CN1117867C - Dna序列及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的DNA序列及其在转化载体，宿主生物体和植物及生产雄性不育和改变了花的颜色的新的植物中的应用。

Description

DNA序列及其用途
本发明涉及一种新的DNA序列及其在转化载体，宿主生物体和植物及产生雄性不育和展现出改变的花的颜色的新的植物中的应用。
雄性不育植物在植物育种，尤其是杂交育种中发挥重要作用。生产雄性不育植物的许多方法已被公开，这些方法包括，例如特异地引起细胞损伤，例如在花药中，干扰线粒体功能，用反义DNA为化学制剂创造机会以产生绝育效应或抑制苯基苯乙烯酮的合成(cf.WO 90/08830，WO90/08831，WO 89/10396，EP-A-0 329 308和EP-A-0 335 451)。然而，到目前为止已用于生产雄性不育植物的方法在许多情况下未达到完全满意的结果。除此之外，经常得到的植物显示对真菌病原体极大增长的易感性，基本上使得在实践中很难处理它们。因此，十分需要免除这些不利之处的其它生产雄性不育植物的方法。
显示花的颜色改变的植物的生产在装饰植物的培养中特别有意义，因而在此领域的新方法中也很有意义。
新的DNA序列，以下称为DNA序列I，现已被发现，其序列由下列成份组成，它们按照5′-3′方向顺次排列。
a)启动子，它与在植物中高度活跃和/或是花药特异的或绒毡层特异的成份b是异源的，且合适地，位于一放大元件(增强子)的下游；
b)编码茋合酶的DNA序列；和
c)3′多腺苷酸化序列；
和DNA序列I一起也包含仍显示完成本发明必须的特性的衍生的DNA序列。
此外已出乎意料地发现在其基因组中包含DNA序列I的植物是雄性不育的，且除此之外，显示花的颜色与不含DNA序列I的相应植物比较是改变的。
另外这些新的植物对微生物植物病原体具有增加的抵抗力，特别是致植物病的真菌。在许多情况，改变花的颜色使得在混合群体中识别雄性不育植物更为容易，这一点具有相当的实际意义。
本发明因而也涉及新的植物(包括这些植物的部分和它们复制的材料，如原生质体，植物细胞，愈伤组织，种子，块茎或插条，等)，在其基因组中包含DNA序列I，并且是雄性不育的和/或显示与不含DNA序列I的相应植物比较改变的花的颜色。
在植物中高度活性，且可被应用作为本发明的DNA序列I的成份a)的启动子已被公开。核酮糖-1，5-二磷酸盐羧化酶(rbcS)的小亚单位的基因的启动子可作为实例被提及(cf，例如，EMBO Journal，vol.5，NO.9，2063-2071，(1986))。此外，在植物中高度活性的植物病毒启动子也被应用。这种启动子已被公开，且CaMV 35S启动子(cf，例如，科学(Science)250，959-960(1990))将作为实例被提及。
花药特异性和/或绒毡层特异性的启动子也可被应用如DNA序列I的成份a)。在花药或称为绒毡层的花药部位显示特别显著活性的此启动子已被公开。TA29启动子将作为实例提及(cf，例如，自燃(Nature)347，737-741(1990))。已从烟草中分离的，TA26和TA13基因的已知花药特异性启动子也适合于按照本发明的用途。
按照本发明，CaMV 35S启动子优选用作DNA序列I的成份a)。
在启动子上游放置合适的放大元件(增强子)以放大期望的启动子效应是有利的。此增强子/启动子结构已被公开。例如，已知的CaMV 35S增强子，用作此增强子特别有利。
依照本发明，CaMV 35S启动子特别优选用作DNA序列I的成份a)。非常特别优选地，由CaMV 35S增强子，并在其后5′-3′方向跟随CaMV 35S启动子组成的结构物被运用。
按照本发明应用的启动子与成份b)是异源的，即与在自然茋合酶基因中发现的启动子是不同的。
合适启动子和增强子的分离已被公开，或可用技术人员熟悉的已知的步骤和方法实现。
任何编码茋合酶的DNA可用作DNA序列I中的成份b)。茋合酶应被理解为意味着能够(在合适的环境尤其植物细胞中)产生茋的任何酶。茋这一术语描述了在植物中发现的一组化学物质，其含有茋骨架(反-1，2-二苯基乙烯)作为其共同基本结构。这基本骨架还可通过附加进一步集团被加强。二个重要且优选的茋是3，5-二羟基-茋(赤松素)和3，4′，5-二羟基-茋(白藜芦醇)。
编码茋合酶的DNA序列已被公开，例如，在欧洲专利申请EP-A-0 309 862，EP-A-0 464 461和EP-A-0 533 010。这些专利申请描述了茋合酶基因的分离和它们在生产显示对病原体增强抵抗力的转基因植物中的用途。这些专利申请中描述的茋合酶-编码DNA序列优选地按照本发明应用，特别的优选采用编码白藜芦醇合酶的序列。另外，优选先应用在所述欧洲专利申请中描述的来自落花生植物(花生)和葡萄树(葡萄)的茋合酶-编码DNA序列。编码茋合酶的DNA序列可呈现为下列形式，即它们被包含在包括可能存在的非编码区(如内含子)的相应的天然植物基因中(“基因组形式”)，或对应于可通过利用逆转录酶/聚合酶自mRNA获得且不再含有任何内含子的cDNA(拷贝DNA)。此序列还可呈现在部分或完全合成的或自不同来源的部分装配的形式中。
被包含在质粒pGS 828.1(EP-A-0 309 862)，质粒pin5-49(EP-A-0 533 010)和非常特别优选地，质粒pVst1，pVst2和pVst12t3(EP-A-0 464 461)中的茋合酶-编码DNA序列按照本发明特别优选采用，借助于DNA序列(其被用作探针)能从植物中分离出来的其它的茋合酶编码DNA序列也是如此。特别强调的是包含在质粒pVst1(EP-A-0 464 461)中的茋合酶-编码序列。
能够作为DNA序列I的成份b)应用的DNA序列的分离已被公开和/或能够用已知的和技术人员熟悉的过程和方法实现。例如，编码茋合酶的区域可以用多聚酶链反应技术(PCR技术)自质粒pVst1，pVst2pVst12t3或pGS 828.1中分离。
扩增能够通过PCR实现，用例如以下方案：1x  95℃ 180秒
72℃  保温(加入聚合酶)25x 95℃  45秒
55℃  45秒
72℃  90秒1x  95℃  45秒
55℃  45秒
72℃  300秒
来自葡萄(var最优)的Vst1和Vst2茋合酶基因和来自花生(A.hyp)的茋合酶基因可用以下引物扩增：引物  1 Vst1：见SEQ ID NO：1引物  1 Vst2：见SEQ ID NO：2引物  1A.hyp.：  见SEQ ID NO：  3引物  2Vst1：    见SEQ ID NO：  4引物  2Vst2：    见SEQ ID NO：  5引物  2A.hyp.：  见SEQ ID NO：  6
被如此扩增的每个基因的所有编码区域可被连接入常规载体的合适的限制性切割位点。
另外，编码和终止序列还可用酶EcoRI和PstI还有EcoRI和SphI自pSSVst1(cf.下面)同时被分离。
被包含在DNA序列I如成份d)的3′多腺苷酸化序列可在大范围内变动，所有对植物中茋合酶的表达无损害效应的合适序列可被应用。特别地，当作为SEQ ID NO：7中具体情况(cf.部分c)下所用技术的结果时，采用几种不同来源的适当的(例如，2)，依次插入的多腺苷酸化序列是有利的。为简便起见，优选使用在天然茋合酶基因中包含的3′多腺苷酸化序列，此序列可与茋合酶编码序列一起自茋合酶基因中方便地分离。所以，按照本发明，如成份b)和c)，仅将天然启动子去除的茋合酶基因也可被采用。在这种情况，只需要加上DNA序列I的成份a)，它是异源的启动子，并在上游合适的位置加上增强子。
合适的3′多腺苷酸化序列可用一般惯例的和技术人员熟悉的步骤和方法分离。
按照SEQ ID NO：7的DNA序列，或个体的或结合存在的，非常特别优选用作DNA序列I的成份a)至c)。在SEQ ID NO：7中，第1至720核苷酸组成双35S CaMV RNA启动子，其由CaMV 35S增强子和CaMV 35S启动子(成份a))组成。第721至730核苷酸是一合成的连接序列。SEQ ID NO：7的第731至2265核苷酸代表编码茋合酶(成份b))的部分，第2266至2485核苷酸代表茋合酶基因的多聚A部分(成份c))。第2486至2728核苷酸代表衍生于CaMV 359 RNA在末端具有多聚连接序列的成份c)部分。
术语DNA序列I还包括仍然具有完成本发明所必须特性的所有衍生DNA序列，这些序列最终引起植物雄性不育性，并可引起花的颜色改变。在这些衍生序列中，单个DNA的密码子和/或组成的序列将缺失(例如由于应用了限制性酶)和/或被其它DNA的密码子和/或组成的序列替代。这些改变可由于基因密码的简并化或在DNA序列的操作中呈现。新的DNA序列和/或它们的成份a)至c)也包含使它们易于操作的DNA的和/或DNA序列，例如所谓连接子或在操作后仍(例如在限制性酶切后)保留的这些连接子。DNA序列I的成份a)至c)可是自然起源的或以部分或完全合成的形式存在。
成份a)至d)可用一般常规的和技术人员熟悉的步骤和方法连接形成DNA序列I，它还可被认为是“嵌合基因”。
在本发明的一个具体实施方案中，DNA序列I由(a)由CaMV 35S启动子和从属CaMV 35S增强子组成的所谓CaMV 35S双启动子，和(b)编码茋合酶(白藜芦醇合酶)的序列，同时以及尾随的3′多腺苷酸化序列组成正如存在于质粒pVst1(cf.EP-A-0 464 461)中的。
此DNA序列包含在新的质粒pSSVst1中，其构建如图1所示。茋合酶基因Vst1的编码区域能相应地从质粒pVst1中分离成-2.1 KB MunI片段，质粒pVst1包含作为4.9kB EcoRI片段的完全的茋合酶基因(Vst1基因)。然而，此MunI片段在编码区域的5′末端缺乏前4个密码子。方便地，纯化的MunI片段随后用限制性酶NruI消化且得到的1.7kBNruI/MunI片段与一编码前四个氨基酸的寡核苷酸连接子相融合。由于EcoRI与MunI的限制性切点的突出末端是相同的，所以有必要防止MunI/EcoRI融合，寡核苷酸连接子被设计成EcoRI切点只通过随后的限制性消化形成。得到的NruI/EcoRI片段在穿梭载体pSS的SmaI和EcoRI切点间连接，使得Vst1茋合酶基因的完整编码区域在双35S启动子的控制下。然而，通过技术人员在其专业知识及本文所包含信息的基础上，使用常规方法，相同的构建物可被制备并付诸使用。
大肠埃希杆菌菌株RH pSSVst1包含质粒pSSVst1。此大肠埃希杆菌菌株，RH pSSVst1被保存在Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen(DSM)[德国微生物保存中心]，Mascheroder Weg 1B，D38124Braunschweig，联邦德国，依照布达佩斯条约1994年10月18日为专利方法目的对国际微生物保存的要求，并给保存号为DSM 9501。
质粒pSSVst1，和大肠埃希杆菌菌株RH pSSVst1，与它的仍显示为完成本发明所必须的保存菌株特性的突变型，同样是本发明的部分。
大肠埃希杆菌RH pSSVst1可用一般常规方法复制。质粒pSSVst1可同样用一般常规方法自此大肠埃希杆菌菌株中分离。技术人员将包含在质粒pSSVst1中的DNA序列I分离出来也是件容易事。因此，包含在质粒pSSVst1中的DNA序列I能够，例如，用限制性酶SphI和PstI以大约2700 bp(碱基对)大小DNA片段的形式从此质粒中分离。
用常规和技术人员熟悉的方法一次或多于一次(例如一前一后排列)，优选一次，作为“外源”DNA，将DNA序列整合入任何原核的(优选细菌)或真核的(优选植物)DNA是可能的。被如此修饰并能够被用于，例如，转化的植物或植物细胞，并在转化后被包含在植物或植物细胞中的重组体DNA，是本发明的组成部分。
DNA序列I，和重组体DNA能够作为“外源”DNA被包含在载体(特别是质粒，粘粒或噬菌体)，转化的微生物(优选细菌，特别是革兰氏阳性菌，如大肠埃希杆菌)以及转化的植物细胞和植物，或它们的DNA中。这些载体，转化的微生物(它们也可能包含这些载体)以及转化的植物细胞和植物，和它们的DNA，代表本发明的组成部分。如已提示的，按照本发明，DNA序列I被一次或多于一次(在基因组的相同或不同位点)地整合入天然植物基因组中。
本发明因而还涉及制备转基因植物细胞(包括原生质体)和植物(包括植物的部分和种子)的方法，其中这些植物是雄性不育的且可能显示花色的改变，此方法的特征在于：
a)DNA序列I和/或新的重组体DNA是/均是一次或多于一次插入植物细胞(包括原生质体)的基因组中，并且是在适当时，
b)自转化的植物细胞(包括原生质体)再生完整的，转化的植物并且，在适当时复制，且在合适时，
c)从所得的亲代或从其获得的其它代转基因植物中分离期望的植物部分(包括种子)。
方法步骤(a)，(b)和(c)可用已知的步骤和方法以常规的方式完成。
一次或多于一次栽有作为“外源”DNA的DNA序列I的转基因植物细胞(包括原生质体)和植物(包括植物部分和种子)，和其后代，还有那些能用上面方法获得的转基因植物细胞和植物，和其后代，同样属于本发明。
下面也是本发明的部分：
a)DNA序列I和/或新的重组体DNA和/或新的重组载体和/或新的转化的微生物在转化植物细胞(包括原生质体)和植物(包括植物部分和种子)中的应用。
b)新的转基因植物细胞(包括原生质体)和植物(包括植物部分和种子)在生产复制材料和生产新的植物和它们的复制材料中的应用，
c)新的DNA序列I和/或新的重组体DNA在生产雄性不育性和，在合适时植物花色的改变中的应用，
d)包含在质粒pSSVst1内的DNA序列I在检测植物中和还有(一般地转基因植物细胞(包括原生质体)和植物(包括植物部分和种子)的产物中DNA序列I的存在中的应用，以及
e)茋合酶编码DNA序列在生产转基因植物中的应用，此植物是雄性不育的和/或与在其基因组中不包含此DNA的同样植物相比花的颜色是改变的。
许多不同的方法可用于将DNA序列I作为“外源”DNA整合入植物或植物细胞的遗传物质中。基因转移可用一般常规的，已知的方法完成，且使技术人员无困难地确定每种情况合适的方法是可能的。
根瘤土壤杆菌的Ti质粒用作将外来DNA转移至双子叶和单子叶植物基因组内的特别良好和广泛应用的载体。为此，DNA序列I以一种合适的方式插入合适Ti质粒的T-DNA(例如Zambryski等，1983)并通过感染植物转移，感染植物部分或植物组织，如叶盘，茎，下胚轴，子叶或分生组织，和衍生自它们的组织，如次级胚胎和愈伤组织，或通过与根瘤土壤杆菌共培养原生质体来完成。
替代办法是与植物原生质体(例如Hain等，1985年；Krens等，1982年；Paszkowski等，1984年)在聚阳离子或钙盐和聚乙二醇存在下孵育DNA序列I，或重组体DNA。
DNA摄取还可另外借助电学领域方法(电穿孔)(例如Fromm等，1986年)。
DNA还可以已知的方式，用植物花粉的办法引入，例如通过用带有DNA的物理加速颗粒“轰击”花粉或植物组织(cf.EP-A-0 270 356)。
植物用合适的营养介质以已知的方法再生(例如Nagy和Maliga1976年)。
在新的方法(按照来自EP-A 116 718)的方法的优选实施方案中，如包含在质粒pSSVst1中的DNA序列I，被克隆入一合适的中介大肠埃希杆菌载体中，例如pGV700或pGV710(cf. EP-A 116 718)，或优选另外包含报告基因如nptII(Herrera-Estrella等1983年)或hpt(Van denElzen等1986年)的其衍生物。
以此方法构成的质粒用常规方法(例如Van Haute等1983年)转移入，含有如pGV 3850，或其衍生物(Zambryski等1983年)的根瘤土壤杆菌。替代地，DNA序列I能被克隆入穿梭载体中，例如PCV001或PCV002(例如Koncz和Schell 1986年)并如上所述，转移入合适的土壤杆菌属菌株(Koncz和Schell 1986年)。得到的包含以可转化至植物的形式存在的DNA序列I的土壤杆菌菌株，用于植物的转化质粒pSSVst1也可直接转化入合适的根瘤土壤杆菌菌株(cf.，例如，Koncz和Schell(1986年))。*
在其它优选实施方案中，包含有用于植物细胞的卡那霉素抗性报告基因的质粒pSSVst1(例如Herrera-Estrella等，1983年)，通过直接基因转移，以常规的方式转移入植物原生质体(例如Hain等，1985年)。虽然为此目的质粒pSSVst1可以是环状，但优选线状。当包含此报告基因的pSSVst1被应用时，接着可检查卡那霉素抗性原生质体茋合成酶的表达。
转化的(转基因的)植物或植物细胞以已知的方法生产，例如籍转化叶盘(例如Horsch等，1985年)，籍共培养再生植物原生质体或细胞与根瘤土壤杆菌共培养(例如Marton等，1979年，Hain等，1985年)或籍用DNA的直接转染。获得的转化的植物的检测，或通过选择报告基因的表达，例如通过体外硫酸卡那霉素的磷酸化(Reiss等，1984年，Schreier等1985年)或通过用Northern印迹分析和Western印迹分析筛选nopaline合酶(与Aerts等1983年一致)或茋合酶。此茋合酶和茋，还可在特异抗体的帮助下，以已知的方式，在转化的植物中被检测。茋合酶还可用酶活性试验检测(Rolfs等，植物细胞报告(Plant Cell Reports) 1，83-85，1981年)。
转化植物细胞的培养和在再生成完整植物，用适于每种情况的营养培养基，以一般常规的方法完成。
转化的植物细胞和转化的植物，它们包含本发明的组成部分的新的DNA序列I，均显示潜在的强大的对病原体的抗性，尤其是致植物病的真菌。
关于本发明，“植物”一词表示完整的植物，植物的部分，如叶子，茎或根，和复制材料，如种子，块茎，插干，等。“植物细胞”包含原生质体，Zelllinien，植物愈伤组织，等。
如已解释的，在其基因组中包含新的DNA序列I的植物显示雄性水育性，且与不包含DNA序列I的相应植物比较可能显示花颜色的改变。
在观赏植物和为鲜切花的情况，例如玫瑰，康乃馨，香雪兰属，扶郎花属，等，花的颜色具有相当的商业的重要性。以特别的方式影响花的颜色，并达到稳定的花色，常常是困难和复杂的事。本发明使之成为可能，以相对简单的方式，改变所有的开有色花及具花色素特别是花色素苷的植物的花的颜色。作为规律，作为DNA序列I整合的结果，花色变浅，且常常是纯白的。一般地，在不开有色花的植物的情况，变化不能辨认，或很难辨认。
植物的雄性不育性在关于杂交系和杂交种子的生产的植物育种中起重要作用。不幸地，许多杂交系对致植物病的真菌十分易感，极大地限制了它们的使用。雄性不育植物可在本发明的帮助下十分简单地生产。这些植物另外具有对微生物的植物病原体如致植物病的真菌，细胞和/或病毒，特别是致植物病的真菌增强的抗性，因而是优于用其它方法获得的雄性不育植物。
实际上所有植物均被包括在通过整合(转化)新的DNA序列I而获得雄性不育的植物中。自然地，这一点十分需要培养的植物如提供粮食和生料植物的情况，例如谷类植物(特别是小麦，黑麦，大麦，燕麦，小米，大米和玉米)，土豆，豆料(如豆子作物和，特别地，苜蓿和大豆)，蔬菜(特别是甘蓝变种和蕃茄)，水果(特别是苹果，梨，樱桃，葡萄，柑桔属水果，菠萝和香蕉)，油棕，茶，可可和咖啡灌木，烟草，西沙尔麻和棉花，还有在药用植物的情况，如萝芙木属和毛地黄属。大米，小麦，大麦，黑麦，玉米，甜菜，油菜和大豆可作为特别优选者被提及。
下列典型实施方案意在阐明本发明：
I)植物的转化
1.载体pSSVst1的构建和描述，
质粒pSSVst1的构建已在前面详述且以能被技术人员容易领会的方式描绘在图1。
质粒pSSVst1是pSS的衍生物。pSS是PCV001的衍生物(Koncz和Schell，1986年)，其包含基于质粒pRT101(Tpfer等，1987年)表达盒，且其中CaMV 35S RNA增强子通过将Ddel/EcoRV片段克隆入Hincll切割位点而被复制。pSSVst1包含pVst1茋合酶的编码序列和多聚A序列(cf.图1)。pSSVst1包含植物卡那霉素抗性性和细菌氨苄青霉素抗性性。另外，pSSVst1包含起自根瘤土壤杆菌Ti-质粒的边界序列(Koncz和Schell，1986年)和根瘤土壤杆菌及大肠埃希杆菌的复制开端。质粒pSSVst1可用菌株大肠埃希杆菌RH pSSVst1被直接移入合适的根瘤土壤杆菌菌株(例如Koncz和Schell 1986年)。
2.烟草的转化
a)培养烟草枝条和烟草原生质体的分离：
烟草(Petit Havana SR1)在不含激素LS培养基(Linsmaier和Skoog1965年)上以无菌枝条(sterile shoot)培养而被复制。经大约6-8周的间隔，枝条片段被转移至新鲜LS培养基。枝条培养保存于24～26℃的培养室中被暴露于12h的光照时(1000-3000lux)。
为了分离叶子原生质体，大约2g的叶子(约3-5cm长)被用新的剃刀刀片切成小碎片(0.5cm×1cm)。叶子材料在由K3培养基(Nagy和Maliga 1976年)，0.4m蔗糖，pH5.6，2％的R10纤维素酶(Serva)，0.5％的R10浸酶(Macerozyme)(Serva)组成的20ml酶溶液中，于室温孵育14-16小时。此后，原生质体经过0.3mm和0.1mm的钢筛过滤自细胞残余物中分离出来。滤液于100xg离心10分钟。经过离心，完整的原生质体漂浮并集中在酶溶液的上缘成一条带。由细胞残余物组成的沉淀，和酶溶液用一玻璃毛细管吸出。预纯化的原生质体用新鲜K3培养基(0.4M蔗糖作为渗透剂)制成10ml并再次漂浮。洗涤培养基被吸出且原生质体被稀释至1-2×105/ml供培养和随后的用土壤杆菌属感染(共培养)。原生质体浓度在计数室中检测。
b)通过与根瘤土壤杆菌共培养的再生烟草原生质体的转化：
在下列内容中，Marton等.，1979年的方法被经轻度改变后应用。原生质体和所述的分离并，于26℃和1-2×105/ml密度，在K3培养基(0.4m蔗糖，0.1mg/l NAA，0.2mg激动素)中，黑暗中孵育2天且够光线下(500lux)孵育1至2天。一旦原生质体的首次分裂出现，包含序列I于其T-DNA或包含质粒pSSVst1，在基本A(Am)培养基(密度大约109土壤杆菌/ml)内的30μl土壤杆菌属悬浮液被加入3ml的再生原生质体中。在20℃，黑暗中共培养的时间是3-4天。此后，烟草细胞被置于12ml离心管内，用海水(600mOsm/公斤)稀释至10ml并于60xg沉淀10分钟。此洗涤步骤进一步重复1-2遍，以除去大部分土壤杆菌属。细胞悬浮液于5×104/ml密度，在含有每升1mg NAA(萘酰-1-乙酸)，每升0.2mg激动素和每升500mg先锋霉素抗生素头孢氨噻肟的K3培养基(0.3m蔗糖)中培养。每周，细胞悬浮液用新鲜K3培养基稀释并每周培养基的渗透容积逐渐降低0.05m蔗糖(约60mOsm/公斤)。共培养2-3周后，于琼脂糖珠型(bead-type)培养物中(Shillito等，1983年)开始用卡那霉素的筛选(100毫克/升硫酸卡那霉素(Sigma)，660毫克/克活性km)。开始筛选3-4周后，可能从缓长菌落的背景中区别卡那霉素抗性克隆。
c)烟草原生质体用DNA硝酸钙/PEG转化的直接转化。
约106原生质体于180μl K3培养基中，与含有每μl 0.5μg质粒pSSVst1，或自pSSVst1分离的DNA序列I作为DNA片段，和每μl 0.5μlp GVneo 2103(Hain等1985年)的20μl水性DNA溶液，在细菌培养皿内小心混合。200μl融合溶液(0.1m硝酸钙，0.45M甘露醇，25％聚乙二醇(PEG 6000)，pH9)随后被小心加入。15分钟后，5ml洗涤溶液(0.275M硝酸钙，pH6)被加入且，再过5分钟后，原生质体被转移入离心管中并于60xg沉淀。沉淀物被置入小量的K3培养基中并如下面部分所述被培养。替代地，原生质体可如Hain等1983年所述的被转化。
当来自pSSVst1 DNA序列I的转化还可在不加每μl 0.5μg的pLGVneo 2103的情况下完成。由于此种情况未用报告基因，所以利用斑点杂交检测所得愈伤组织以确定DNA序列I基因单位的存在。自pSSVst1的编码序列可用作杂交探针。自然地，其它检测方法，如用抗体测定或茋合酶的酶检验，也可被应用。
d)培养已与DNA孵育的原生质体和选择卡那霉素抗性愈伤组织：
改良的串珠型(bead-type)培养技术(Shillito等1983年)被用于下述的卡那霉素抗性克隆的培养和选择。原生质体用DNA(cf.c)处理后1星期，3ml细胞悬浮液在5cm细菌培养皿中，与3ml K3培养基(0.3M蔗糖+激素)；1.2％(海噬斑(Seaplaque))LMT琼脂糖(低熔点琼脂糖，海生胶质)混合。为此目的，琼脂糖在干燥状态被高压灭菌，且，K3培养基被加入后，在微波炉中短暂煮沸。琼脂糖凝固后，含有包埋的烟草微愈伤组织的琼脂糖串珠被转移入10cm佩特里细菌培养皿中且每种情况加入10ml K3培养基(0.3M蔗糖，1毫克/升NAA，0.2毫克/升激动素)和100毫克/升硫酸卡那霉素(Sigma)，进一步培养和筛选。液体培养基每周更换，与此相联系，培养基的渗透值被逐步地降低。
在替代培养基(K3+Km)中的蔗糖浓度以每周0.05m(约60mOsm)降低。
筛选DNA转化后的卡那霉素抗性烟草集落的图解：0.4M 0.3M 0.25M 0.20M 0.15M 0.10M液体培养基中的蔗糖U     ES                    K
  1   2     3     4     5    DNA摄取后6周
(K3培养基，1毫克NAA，0.2毫克激动素)
U＝DNA摄取
E＝包埋于琼脂糖中
S＝用卡那霉素(100毫克硫酸卡那霉素/升)筛选
K＝卡那霉素抗性集落能清晰地自背景中辨认
e)卡那霉素抗性植物的再生：
一旦卡那霉素抗性集落达到直径约0.5cm，其中的一半被放于再生培养基(LS培养基，2％蔗糖，0.5毫克/升苄氨基嘌呤BAP)上并当被暴露于12h的光线(3000-5000lux)时于培养室中保持于24℃。另一半在含有1毫克/升NAA，0.2毫克/升激动素，0.1毫克/升BAP和100毫克/升硫酸卡那霉素的LS培养基上繁殖为愈伤组织培养物。当再生的枝条大约在1厘米尺寸的，它们被切掉并为固定被置于不含生长调节剂的1/2 LS培养基(1％蔗糖，0.8％琼脂)上。枝条于含100毫克/升硫酸卡那霉素的1/2 MS培养基上生根并随后被移植入土壤。
f)叶盘leaf discs，用根瘤土壤杆菌的转化
为叶盘的转化(Horsch等，1985年)，来自无菌枝条培养物的约2-3厘米长的叶子打孔为直径1厘米的盘状，与包含质粒pSSVst1或包含来自此质粒的DNA序列I于其T-DNA中的合适的土壤杆菌属悬浮液(约109/毫克)(cf.b)，于Am培养基(见下)中孵育约5分钟。感染的叶片在不含激素的MS培养基(见下)上保持于24℃ 3-4天。在此期间，土壤杆菌属长满叶片。然后在Ms培养基(0.5毫克/毫升BAP，0.1毫克/毫升NAA)中洗涤叶片并放MS培养基上在含500微克/毫升头孢氨噻肟和100微克/毫升硫酸卡那霉素(Sigma)的相同培养基(0.8％琼脂)上。培养基必需在二周后更换。再过2-3周后转化的枝条是可看见的。
检测转化的生物化学方法
新霉素磷酸转移酶(NPT II)酶检验：
新霉素在植物组织中的活性通过Reiβ等(1984年)描述的和Schreier等(1985年)改良的卡那霉素的原位磷酸化而被检测，见下。50毫克植物组织在冰上和在加入的玻璃粉存在下，于50μl提取缓冲液(10％甘油，5％2-巯基乙醇，0.1％ SDS，0.025％溴酚蓝，62.5mM三羟甲基氨基甲烷，pH6.8)中搅匀并在Eppendorf离心机上于4℃离心10分钟。50μl的上清液置于天然聚丙烯酰胺凝胶上(145×110×1.2毫米；分辨胶：10％丙烯酰胺，0.33％双丙烯酰胺，0.375M三羟甲基氨基甲烷，pH8.8，分离胶：5％丙烯酰胺，0.165％双丙烯酰胺，0.125M三羟甲基氨基甲烷，pH6.8)并于4℃和60V电泳过夜。一旦溴酚蓝标记跑出胶外，后者用蒸馏水洗10分钟二遍及用反应缓冲液(67mM 3-马来酸，pH7.1，42mM MgCl2，400mM氯化铵)洗30分钟一遍。胶被平铺于相同尺寸的玻璃盘上并在含底物硫酸卡那霉素(20微克/毫升)和20-200 C1 32P ATP(Amersham)的反应缓冲液中，在上平铺40毫升1％琼脂糖。此夹心胶于室温孵育30分钟，然后一张磷酸纤维素P81纸(Whatman)被铺在琼脂糖上。4层3毫米的滤纸(Whatman)和一些纸巾被堆在顶部。原位磷酸化的，放射性的磷酸卡那霉素至P81纸的转移在3-4小时后被停止。P81纸在蛋白酶K和1％十二烷基磺酸钠(SDS)的溶液中，于60℃孵育30分钟，然后在250ml，10mM磷酸缓冲液中，pH7 5，于80℃洗涤3-4次，在-70℃干燥和放射自显影(Kodak XAR5胶片)1-12小时。
用Southern印迹分析证实按照上面实施例获得的植物细胞和植物(烟草)中，编码茋合酶DNA序列的存在。编码茋合酶序列的表达用Northern印迹分析证明，而茋合酶和白藜芦醇在特异抗体的帮助下被证明。转化的和未转化的植物(为了对照)在温室中培养至开花。转化的植物显示花颜色的改变(与未转化的对照植物比较)且是雄性不育的。
在转化植物和植物细胞中应用的培养基已被描述，其中包括，在EP-A 0 309 862中：
上面实施例中和下面实施中所有百分比值均指重量百分比，除非另外指出。
II)检查转基因植物的花颜色改变及雄性不育性。
实施例A
按照上面实施例得到的转基因烟草植物先在组织中预育种，然后于23℃和相对大气湿度70-80％的温室中育种，直至开花。提供给它们需要的肥料和水。
所有按照实施例1)转化的植物显示白色或粉白色花，且在与野生型回交后在F1代仍保持，而未转化的相应的对照植物，显示浓的红色，暗粉色或韭红色。
所有转化的植物还是雄性不育的，并且此不育性也在F1代中保持。
关于植物的转化可引用下列出版物：
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Schreier PH，Seftor EA，Schell J和Bohnert HJ(1985)应用核编码序列指导光调合成和外来蛋白质至植物叶绿体的转运，EMBO J Vol4，No.1：25-32
另外，下列公布的专利申请可被列出：
EP-A 116 718    EP-A-126 546
EP-A 159 418    EP-A-164 597
EP-A 120 515    EP-A-175 966
EP-A-120 516    WO 84/02913
EP-A-172 112    WO 84/02919
EP-A-140 556    WO 84/02920
EP-A-174 166    WO 83/01176
EP-A-122 791
EP-A-0 309 862
EP-A-0 464 461
EP-A-0 533 010
                                   序列表(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)姓名：Bayer AG
(B)街：Bayerwerk
(C)城市：Leverkusen
(D)国家：德国
(E)邮编：D-51368
(F)电话：0214/30 66400
(G)电传：0214/30 3482
(H)电报：85 101-265 by d
(ii)申请名称：DNA序列及其应用
(iii)序列号：7
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软盘：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPA)(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：33个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假说：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TCCCCCGGGA TCCATGGCTT CAATTGAGGA AAT(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征
(A)长度：33个碱基对
(B)类型：核苷酸
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(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：TCCCCCGGGA TCCATGGCGT CTGTGGAGGA AAT(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征
(A)长度：33个碱基对
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(xi)序列描序：SEQ ID NO：3：TCCCCCGGGA TCCATGGTGT CTGTGAGTGG AAT(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征
(A)长度：32碱基对
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(i)序列特征
(A)长度：31个碱基对
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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CCCAGCTATC TGTCACTTCA TCGAAAGGAC AGTAGAAAAG GAAGATGGCT TCTACAAATG    480CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCTATCGT TCAAGAATGC CTCTACCGAC AGTGGTCCCA    540AAGATGGACC CCCACCCACG AGGAACATCG TGGAAAAAGA AGACGTTCCA ACCACGTCTT    600CAAAGCAAGT GGATTGATGT GATATCTCCA CTGACGTAAG GGATGACGCA CAATCCCACT    660ATCCTTCGCA AGACCCGTCC TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG AGGACCTCGA    720GAATTCCACC ATGGCTTCAA TTGAGGAAAT TAGAAACGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC    780CACCATCCTA GCCATTGGCA CAGCTACTCC CGACCACTGT GTCTACCAGT CTGATTATGC    840TGATTACTAT TTCAGAGTCA CTAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA    900TCGCATATGT AAGTATATAT ATTCATGCAT TAATTCTTAC ATTCACAACA TTTCTATACA    960TATACGAGTG TGCTATTAAG TGAGGGTCAC CTCCAAGTGA ATGAATGTTT CAAGCTTAGA    1020GAATAGCTTT TAGCTAAATT ACTTTAGGAA ACTTGAAAAT CATTTTACAT CAGTAACCGA    1080TATTCCTTTC ATTTGATTGT AAGGGCTTGA AGAGCTGTTC TTTGAATCAT GTAGCATTGC    1140TAGCTATAAT TAAGAATAAC CTTTTATAAT TTCTTCAATG TTAAATGCAT GTTGATCATC    1200TTCAAGAATA TACTATATGA CTAGTCGTTG GAAAACTAAT GTGTTCATCT TATTTCTTTT    1260ACAGGTGACA AATCAATGAT CAAGAAGCGT TACATTCATT TGACCGAAGA AATGCTTGAG    1320GAGCACCCAA ACATTGGTGC TTATATGGCT CCATCTCTCA ACATACGCCA AGAGATTATC    1380ACTGCTGAGG TACCTAAACT TGGTAAAGAA GCAGCATTGA AGGCTCTTAA AGAATGGGGT    1440CAACCAAAGT CCAAGATCAC CCATCTTGTA TTTTGTACAA CCTCCGGTGT AGAAATGCCC    1500GGTGCAGATT ACAAACTCGC TAATCTCTTA GGCCTTGAAA CATCGGTTAG AAGGGTGATC    1560TTGTACCATC AAGGTTGCTA TGCAGGTGGA ACTGTCCTTC GAACTGCTAA GGATCTTGCA    1620GAAAATAACG CAGGAGCACG AGTTCTTGTG GTGTGCTCTG AGATCACTGT TGTTACATTT    1680CGTGGGCCTT CCGAAGATGC TTTGGACTCT TTAGTAGGTC AAGCCCTTTT TGGTGATGGG    1740TCAGCAGCTG TGATTGTTGG ATCAGATCCA GATGTCTCCA TTGAACGACC CCTCTTCCAA    1800CTTGTTTCAG CAGCACAAAC GTTTATTCCT AATTCAGCAG GTGCTATTGC GGGTAACTTA    1860CGTGAGGTGG GACTCACCTT TCACTTGTGG CCTAATGTGC CTACTTTGAT TTCCGAGAAC    1920ATAGAGAAAT GCTTGAATCA GGCTTTTGAC CCACTTGGTA TTAGCGATTG GAACTCGTTA    1980TTTTGGATTG CTCACCCTGG TGGCCCTGCA ATTCTTGATG CAGTTGAAGC AAAACTCAAT    2040TTAGAGAAAA AGAAACTTGA AGCAACAAGG CATGTGTTAA GTGAGTATGG TAACATGTCT    2100AGTGCATGTG TCTTGTTTAT TTTGGATGAG ATGAGAAAGA AATCCCTAAA GGGGGAAAAA    2160GCTACCACAG GTGACGGATT GGATTGGGGN GTACTATTCG GTTTTGGGCC AGGCTTGACC    2220ATTGAGACCG TTGTGCTGCA TAGCGTTCCT ATGGTTACAA ATTGAGTGGA AAACGGTAAG    2280AGAAATGATA TAGGGGACAT GTCTTATTGT ATTACAGAGG AGGTGCTACG AAAGATATGT    2340ACATGTATCT TCAAAGTTAA TAATAGTACT CCTAAATCTT TTATTCCTAT CCTAACATTG    2400AGGGATTGTA ATTTAGTGAT TGTTGGAGGG TGCAGTCACG TCAGGCAAGT GGATGAAACT    2460GCAAGTGCTT GTCATTCTGT TATCGGGGGA TCCTCTAGAG TCCGCAAAAA TCACCAGTCT    2520CTCTCTACAA ATCTATCTCT CTCTATTTTT CTCCAGAATA ATGTGTGAGT AGTTCCCAGA    2580TAAGGGAATT AGGGTTCTTA TAGGGTTTCG CTCATGTGTT GAGCATATAA GAAACCCTTA    2640GTATGTATTT GTATTTGTAA AATACTTCTA TCAATAAAAT TTCTAATTCC TAAAACCAAA    2700ATCCAGTGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTT                                       2728

Claims (33)

1.DNA序列I，它由下列成份组成，这些成份按5′-3′方向顺次排列：
a)启动子，它与成份b)异源，在植物中高度活跃和/或是花药特异的或绒毡层特异的且在适合时位于一增强子的下游；
b)编码茋合酶的DNA序列；和
c)3′多腺苷化序列。
2.按照权利要求1的DNA序列I，其中植物病毒启动子和，适当时，增强子被用作成份a)。
3.按照权利要求1的DNA序列I，其中花药特异性或绒毡层特异性启动子被用作成份a)。
4.按照权利要求1的DNA序列I，其中CaMV35S启动子被用作成份a)。
5.按照权利要求1的DNA序列I，被置于CaMV 35S增强子的下游的CaMV 35S启动子被用作成份a)。
6.按照权利要求1的DNA序列I，其中由CaMV 35S启动子和CaMV35S增强子组成的构建体被用作成份a)，此构建体存在于保藏号为DSM9501的质粒pSSVst1中。
7.按照权利要求1的DNA序列I，其中由CaMV 35S启动子和CaMV35S增强子组成的构建体被用作成份a)，此构建体由SEQ ID NO：7的1至720核苷酸组成。
8.按照权利要求1的DNA序列I，其中编码白藜芦醇合酶DNA序列被用作成份b)。
9.按照权利要求1的DNA序列I，其中来自花生或来自葡萄树的白藜芦醇合酶编码DNA序列或其cDNA被用作成份b)。
10.按照权利要求1的DNA序列I，其中来自葡萄树的白藜芦醇合酶编码DNA序列或其cDNA被用作成份b)。
11.按照权利要求1的DNA序列I，其中存在于保藏号为DSM9501的质粒pSSVst1中的白藜芦醇合酶编码DNA序列被用作成份b)。
12.按照权利要求1的DNA序列I，其中由SEQ ID NO：7的731至2265核苷酸构成的白藜芦醇合酶编码DNA序列被用作成份b)。
13.按照权利要求1的DNA序列I，其中存在于各自天然茋合酶基因中的3′多腺苷酸化序列被用作成份c)。
14.按照权利要求1的DNA序列I，其中存在于质粒pSSVst1中的3′多腺苷酸化序列被用作成份c)。
15.按照权利要求1的DNA序列I，其中由SEQ ID NO：7的第2266至2485或第2266至2728位核苷酸构成的3′多腺苷酸化序列被用作成份c)。
16.按照权利要求1的DNA序列I，其由成份a)至c)的组合构成，此组合存在于保藏号为DSM9501的质粒pSSVst1中。
17.按照权利要求1的DNA序列I，其由SEQ ID NO：7的第1至2728位核苷酸组成。
18.重组体原核或真核DNA，其包含按照权利要求1的DNA序列。
19.重组体DNA，其存在于植物或植物细胞中且包含按照权利要求1的DNA序列。
20.载体，其包含按照权利要求1的DNA序列。
21.保藏号为DSM9501的质粒pSSVst1载体。
22.转化的微生物，其包含DNA序列I。
23.大肠埃希杆菌菌株RH pSSVst1，其保藏号为DSM 9501。
24.转基因的植物原生质体，在其基因组中包含DNA序列I且是雄性不育的和/或与不含DNA序列I的相应植物相比显示花颜色的改变。
25.按照权利要求24的转基因植物原生质体，其包含，作为DNA序列I的存在于保藏号为DSM9501的质粒pSSVst1中的序列。
26.按照权利要求24的转基因植物原生质体，其包含，作为DNA序列I的包含SEQ ID NO：1的1至2728位核苷酸的序列。
27.转基因的植物细胞，在其基因组中包含DNA序列I且是雄性不育的和/或与不含DNA序列I的相应植物相比显示花颜色的改变。
28.按照权利要求27的转基因植物细胞，其包含，作为DNA序列I的存在于保藏号为DSM9501的质粒pSSVst1中的序列。
29.按照权利要求27的转基因植物细胞，其包含，作为DNA序列I的包含SEQ ID NO：1的1至2728位核苷酸的序列。
30.按照权利要求1的DNA序列I和/或按照权利要求18的重组体DNA和/或按照权利要求20的载体和/或按照权利要求22的转化的微生物在转化植物细胞和植物中的应用，其中所述植物细胞包括原生质体，所述植物包括植物的部分和种子。
31.制备转基因植物的方法，在其基因组中包含DNA序列I，并且是雄性不育的和/或显示与不含DNA序列I的相应植物比较改变的花的颜色，其中，转基因植物包括这些植物的部分和它们复制的材料，如原生质体，植物细胞，愈伤组织，种子，块茎或插条等，其特征在于：
a)按照权利要求1的DNA序列I或按照权利要求4的重组体DNA被插入植物细胞的基因组中，其中植物细胞包括原生质体，且，在合适时
b)从转基因植物细胞再生完整的转化的植物，其中植物细胞包括原生质体，并且在适当时复制，并且在适当时，
c)期望的植物部分，自得到的亲代或从亲代获得的其它代的转基因植物中分离，其中植物部分包括复制材料。
32.按照权利要求24的转基因植物原生质体和/或按照权利要求27的转基因植物细胞在生产复制材料和生产新植物中的应用，其包含按照权利要求1的DNA序列I或按照权利要求18的重组体DNA，和它们的复制材料。
33.权利要求1的DNA序列I在生产雄性不育和/或与在基因组中不含此DNA的相应植物相比表现花色改变的转基因植物中的应用。
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