KR100292234B1 - 식물 수정능력의 조절방법 - Google Patents
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Abstract
플라보놀 활성이 손상된 식물은 조건 수 임성(CMF) 이고, 식물의 화분부위에 수정능력 회복 플라보놀을 제공함으로써 수 임성이 구제 또는 회복될 수 있다.
플라보놀 결핍 식물에 의해 생육가능 화분이 생성되지만, 생체내 및 생체외에서 화분 발아 및 관 생장이 심하게 감소되어 자가 불임성인 식물로 된다. 그러나, 화분의 발아를 증가시키는데 효과적인 양만큼의 수정능력회복 플라보놀과 식물의 화분을 접촉시킴으로써, 완전한 화분발아와 관 생장이 회복될 수 있다. 유용한 수정능력회복 플라보놀은 식(I)의 화합물을 포함하는데, 여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 1 내지 3 탄소원자를 갖는 알콕시이다. 특히 바람직한 플라보놀은 갈란긴, 캠프페롤, 이소- 람네틴, 케르세틴 및 모린을 포함한다.
Description
[발명의 명칭]
식물 수정능력의 조절방법
[도면의 간단한 설명]
제1도는 칼콘 신타아제(CHS) 이형접합 식물에서 발생중인 화분립(microspore)에 대한 포자체의 영향(사선)을 도식적으로 나타낸 것이다. 포자체에서 CHS기능의 결핍은 백색 백그라운드에 의해 나타내고 (제1(a)도), CHS기능의 존재는 흑색 백그라운드에 의해 나타냈다(제1(b)도).
제2(a)도 및 제2(b)도는 근교(近交) 페투니아계통 V26(제2(a)도) 및 CHS- 결핍식물 02425.1(제2(b)도)의 생체외에서 발아하는 화분을 사진으로 나타낸 것이며, 새로 열개(裂開)한 꽃밥의 화분을 액체배지에 현탁시키고 실온에서 6시간동안 생장시킨후 촬영하였다. 제2(a)도에서 막대모양은 25㎛를 나타낸다. 제2(b)도에서 화살표는 발아하려고 하는 화분관을 나타낸다.
제3도는 근교 페투니아계통 V26(좌측열; 제3(a)도, 제3(c)도, 제3(e)도 및 제3(g)도) 및 CHS- 결핍식물 02425.1(우측열; 제3(b)도, 제3(d)도, 제3(f)도 및 제3(h)도)의 발생적으로 동일한 꽃밥의 단면을 사진으로 나타낸 것이며, 실시예 3에 기재한 대로 식물체를 채취하여 고정하고, 포매(包埋)하고, 횡단면으로 자르고, 틀루이딘 블루로 염색하였다. 제3(a)도 및 제3(b)도는 트랜스유전자 함유 꽃밥이 두툼하고 백색일때 열개 48 시간전의 꽃밥단면을 나타낸다. 제3(e)도 및 제3(f)도는 제3(c)도 및 제3(d)도의 배율로 제3(a)도 및 제3(b)도와 같은 꽃밥 단면을 나타낸다. 제3(f)도에서 막대모양은 50 ㎛를 나타낸다. 제3(g)도 및 제3(h)도는 열 개시의 성숙한 화분을 나타낸다. 제3도에서 P는 화분; E는 꽃밥의 내피; S는 스토미움(stomium); C는 외피를 나타낸다.
제4도는 수정능력회복 플라보놀 캠프페롤에 의해 페투니아 CHS- 결핍화분의 화분발아 및 화관생장이 회복되는 것을 사진으로 나타낸 것이다. 조건 수 임성 꽃밥에서 화분을 모아서, 발아배지에 현탁시키고, 캠프페롤(K+, 제4(c)도) 또는 DMSO(K-, 제4(b)도)를 1μM 최종농도로 첨가했다. 4 시간의 배양후에 대표적인 화분부위를 도면으로 표현했다. 캠프페롤 회복된 CMF화분(제4(c)도)에서 관찰되는 발아 및 관 생장은 DMSO 만을 공급받는 야생형 V26 콘트롤(C, 제4(a)도)과 구별할 수 없다. 보충되지 않은 CMF화분(제4(b)도)은 어떤 알갱이에서는 발아구멍에서 팽창을 보이지만 어떤 화분관도 분출되지 않는다.
제5도는 야생형 V26암술머리(제5(a)도) 및 CMF암술머리(제5(b)도)의 메탄올 추출물의 HPLC결과이다. 150 개의 암술머리로부터 제제화되고 역상 C18컬럼에서 메탄올-물 구배로 분류된 추출액중 100μl 분액의 360nm에서의 흡광도를 측정하였다. 제5(a)도의 삽입그림은 33.17분에서의 피크의 UV/가시 스펙트럼이며 진정한 캠프페롤 표준에 의해 생성되는 것과 동일하다. 산 가수분해된 V26암술머리 추출물의 HPLC 결과와 UV/가시 스펙트럼은 보유시간(retention time) 7.43, 10.10, 13.46 및 16.65에서의 주요피크는 캠프페롤과 케르세틴의 글리코시드라는 것을 나타낸다.
제6도는 화분발아 빈도를 증가하는 플라보놀 아글리콘(aglycone) 농도의 함수로서 나타낸 그래프이며, 발아배지(GM)에 표시한 최종농도로 캠프페롤(○), 모린(●), 미리 세틴(△) 및 3-히드록시플라본(▲)을 첨가하고 4시간의 배양후에 발아를 평가하였다. 세 번의 별도의 실험에서 측정한 평균 발아빈도를 평균의 표준 오차(the standard error of th mean; SEM)로 도면에 나타냈다. 1.4미만의 SEM값은 눈에 보이지 않는다. 야생형 콘트롤 V26화분의 발아빈도는 전형적으로는 75%이며 회복되지 않은 DMSO-처리된 CMF화분은 1-2%사이의 수분작용을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 식물에서의 수정능력의 조절방법에 관한 것이며, 보다 특이적으로는 식물체에서 플라바논-3-히드록실라제의 활성을 차단함으로써 플라보노이드-결핍 조건 수 임성(稔性)(conditionally male fertile) 식물체를 만들어내는 것, 및 식물화분부위에 수정능력 회복 플라보놀을 제공함으로써 플라보노이드-결핍 조건 수 임성 식물체에서 수정능력을 회복시키는 것이 관한 것이다.
[발명의 배경]
고등식물에서 성공적인 수정은 종의 영속성에 핵심적일뿐만 아니라 자연석택으로 이끄는 변이와 경쟁의 원천인 큰 개체군을 제공한다. 수 배우체 발생의 분산 후 단계에서, 화분은 암술머리에서 발아하여 화분벽에서 발아구멍을 통해 관을 돌출시킨다.
피자식물에서 생장하는 화분관은 두 정세포가 암술대 조직을 통해서 배낭으로 이동하는 도관이며, 배낭에서 그것은 난자와 중심세포와 융합하여 각각 접합자와 내배젖을 형성한다(E.G. Cutter, 1978, Plant Anatomy, Part I, Experimentation and Interpretation. E. Arnold, Eds., Addison Wesley, London, Chap. 6.). 화분발생은 꽃밥내에서 일어나고 성숙시 각 화분립은 꽃밥벽의 내층(융단조직)으로부터 발생하는 포자체 유전자발현 및 각 화분립내의 영양세포로부터 반수체 유전자 발현의 산물을 포함하는 다세포의 화분립이다(J.P. Mascarenhas, 1990, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol. 41:317; J.P. Mascarenhas, 1989, Plant Cell 1:657). 소포자 생성의 과정은 조직학적으로는 잘 알려졌지만, 분산후 화분기능에 포함된 분자생물학적 및 생화학적 인자에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
플라보노이드는 15 탄소골격의 공통구조를 갖는 저분자량(∼300)의 식물-특이적인 풍분한 부류의 대사산물이다. 기본구조의 변형은 광범위한 화합물들을 생성하고 이것들은 다양한 고리의 산화상태 및 치환패턴에 의하여 분류된다. 어떤 부류는 색소(가령, 안토시아닌, 칼콘(chalcone), 및 특별한 플라보놀과 플라본)인 반면, 다른 부류는 무색의 자외선흡수 화합물이다. 안토시아닌, 특히 펠라르고닌, 시아니딘, 및 델피니딘은 적색, 청색 및 자색 식물색깔의 원인이 된다. 다른 착색 플라보노이드인 칼콘, 및 일부 플라보놀과 플라본은 황색, 상아색 및 크림색 꽃의 중요한 원인이 된다. 화분 플라보노이드는 몇몇 종에서 확인되었는데, 그것은 화분에 특유한 황색을 부여하고 건조중량의 상당한 부분(2-5%)을 차지할 수 있다(R. Zerback, M. Bokel, H. Geiger, D. Hess, 1989, Phytochemistry 28:897; R. Wierinann 및 K. Vieth, 1983, Protoplasma 118:230).
몇몇 식물종은 그것의 화분에서 특유한 유형의 플라보노이드를 갖기 때문에 화분립은 플라보노이드 생합성 및/ 또는 축적의 특별한 환경이라는 증거가 있다(O. Ceska 및 E.D. Styles, 1984, Phytochemistry 23:1822).
변형된 플라보노이드 색소침착을 갖는 식물이 이전에 문헌에 발표되었다.
예컨대, 황색화분이 아닌 비-기능적인 백색화분을 갖는 옥수수 돌연변이체가 이전에 분리 및 특정화되었다(Coe E.H., McCormick S.M. 및 Modena S.A., 1981, “White pollen in maize,” J Hered 72:318-320). 백색화분 돌연변이체는 옥수수털에서 발아하는 정상적인 양의 비-색소침착 화분을 떨어뜨리지만, 대부분의 수분작용후에 어떤 씨도 생기지 않는다. 이러한 상태는 옥수수의 두 칼콘 신타아제(chalcone synthase; CHS)유전자인 C2 및 Whp에서 안정한 열성 돌연변이의 발현에 의하여 포자체에서 결정된다.
최근에는 CHS 트랜스유전자를 착색된 근교(近交) 페투니아 스톡속으로 Agrobacterium을 매개로하여 도입시키면 내생적인 CHS유전자(들)의 발현을 억제하여 완전히 플라보노이드 색소 침착이 결핍된 화관이 생기는 것이 발표되었다(Napoli C, Lemieux C 및 Jorgensen R, 1990, “Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-repression of homologous gene in trans,” Plant Cell 2:279-289).
이러한 식물에서는 CHS 트랜스유전자의 발현도 또한 억제되기 때문에, 용어 “공-억제”(co-suppression)가 이 현상을 기술하는데 이용되었다(Jorgensen R, 1990, “Altered gene expression in plants due to trans interactions between homologous genes,” Trends Biotech 8:340-344). 통합된 트랜스 유전자는 내생적인 CHS유전자(들)의 미연관 우성 억제인자처럼 작용하여 화판에서 뿐만아니라 생식기관에서 가시 플라보노이드색소를 완전히 차단시킨다.
CHS 유전자 발현이 차단되면 플라보노이드 색소 침착이 결핍될뿐만 아니라 수정능력이 없는 식물체로 된다(Coe등, 1981; Taylor등, 1992, “Conditonal Male Fertility in Chalcone Synthase Deficient Petunia,” J. Hered. 83:11-17). CHS 결핍 식물체에서 수정능력을 회복시키는 것이 매우 바람직할 것이며 더욱이 CHS보다 화분수정능력에 더 밀접하게 연관된 효소의 조절을 통해서 식물수정능력을 조절할 수 있도록 하는 것이 매우 바람직한 것이다.
[발명의 요약]
플라보놀 결핍을 일으키는 방식에 있어서 플라바논-3-히드록실라제(F3H) 활성이 손상된 식물체는 조건 수 임성(CMF) 이며, 식물의 화분이 수정능력회복 플라보놀과 접촉될 수 있는 조건을 제공함으로써 수 임성이 구제 또는 회복될 수 있다는 것이 현재 발견되었다. 식물에서 F3H생성을 직접적으로 또는 간접적으로 차단시킴으로써 F3H활성을 손상시킬 수 있는데, 예컨대 식물에 의해 자연적으로 생성되는 F3H를 불활성화 시켜서 또는 플라보놀 생합성 경로에서 칼콘 신타아제(CHS)등의 선구물질 효소의 활성을 손상시켜서 F3H활성을 손상시킬 수 있다. 생육가능한 화분이 F3H결핍식물에 의해 생성되지만 화분 발아 및 관 생장은 생체내 및 성체외에서 크게 감소되어 자가불임인 식물로 된다. 그러나, 식물체의 화분이 수정능력 회복 플라보놀과 접촉될 수 있는 조건을 제공함으로써, 식물의 완전한 화분발아 및 관 생장력을 회복시킬 수 있다.
적합한 수정능력 회복조건은 식물의 화분에 필요한 플라보놀이 이용될 수 있는 어떤 조건을 포함하는데, 예컨대 F3H손상조건의 제거, 식물체에서 F3H생성의 회복등에 의한 것을 포함한다. 한편 식물의 화분을 화분의 발아 및/ 또는 관 생장을 증가시키는데 유효한 양의 수정능력 회복 플라보놀과 접촉시킴으로써 식물의 수정능력을 구제 또는 회복시킬 수 있다. 유용한 수정능력 회복 플라보놀은 하기의 식물의 화합물을 포함한다:
여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 1 내지 3 탄소원자의 알콜시이다. 특히 바람직한 플라보놀은 갈란긴(galangin), 캠프페롤(kaempferol), 이소-람네틴(iso-rhamnetin), 케르세틴(quercetin) 및 모린(morin)이다.
[바람직한 구체예의 상세한 기술]
본 발명의 한면에서는, 식물체의 화분이 수정능력 회복 플라보놀과 접촉될 수 있는 조건을 제공함으로써 플라보노이드-결핍 조건 수 임성(CMF) 식물에서의 식물 수정능력이 회복된다.
예시적인 구체예에서, 식물의 화분의 발아 및 관 생장을 증가시키는데 효과적인 양의 수정능력 회복 플라보놀과 식물체의 화분을 접촉시킴으로써 적합한 조건이 획득될 수 있다. 여기서 사용되는 용어 “플라보노이드-결핍 조건 수 임성 또는 CMF식물체”는 칼콘 신타아제(CHS) 또는 플라보논-3-히드록실라제(F3H)활성이 자연적으로 또는 트랜스유전학적으로 손상되어 식물체에서 플라보노이드의 자연생성이 파괴된 식물체를 포함하도록 의도된다. 따라서, 플라보노이드-결핍 조건 수 임성 식물체는 전형적으로는 색소-결핍이어서 백색 또는 엷은 착색으로 될 것이며, 전형적으로는 자가불임일 것이다. 본 발명은 하기에서 CMF 페투니아 및 옥수수와 관련하여 상세히 기술할 것이지만, 다른 CMF 식물도 본 발명의 수행시 유사하게 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 면에서는, 플라바논-3-히드록실라제(F3H) 의 활성을 차단하여 정상적으로는 자가불임이지만 식물의 화분을 여기서 기술한 대로 수정능력 회복 플라보놀과 접속시킴으로써 수정능력이 구제 또는 회복될 수 있는 CMF식물을 생성함으로써 식물의 수정능력을 조절할 수 있다. 천연의 플라보놀 생합성 경로에서, 칼콘 신타아제(CHS) 는 3분자의 말로닐-CoA와 1분자의 p- 쿠마로일을 축합하여 칼코노나링게닌을 형성하여, 이것은 자연적으로(낮은 비율로) 그리고 칼콘-플라바논 이성화효소(CHI) 의 작용에 의하여 나링게닌으로 전환된다. 이 경로의 다음 단계에서는, F3H가 C고리의 3- 위치탄소에 히드록실기를 첨가하는 것을 촉매하여 플라보놀을 생성하며, 이것은 본 발명에 관한 수정능력회복 활설에 필요하다.
일반경로는 하기와 같이 나타낼 수 있다:
F3H는 플라보놀의 생성에서 속도 조절효소이며, 이전에 Antirrhinum majus로부터 클로닝되었다(Martin, C., Prescott, A., Mackay, S., Bartlett, J. 및 Vrijlandt, E., 1991, “Control of biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus,”The Plant J. 1:37-39).
여기서 기재된 것처럼 플라보놀 아클리콘 화합물이 수 임성(수정능력) 에 필요하기 때문에, F3H 히드록실화 활설을 효과적으로 차단하는 어떤 수단도 본 발명의 수행시 이용할 수 있다. 따라서 예컨대 생합성 경로에서 선구물질의 생성을 차단함으로써 F3H기질을 제거할 수 있고, 또는 유전자 발현을 방해함으로써 F3H, CHI 또는 CHS 의 발현을 차단할 수 있다. 또 다른 예시적인 구체예에서는, 식물체에서 F3H 또는 CHI등의 선구체 효소의 발현에 필요하거나 암호화하는 mRNA 에 혼성화하는 안티센스 RNA를 식물체에서 발현시킴으로써 플라보놀 생성이 차단된 식물이 생성될 수 있다. 가령 융단세포- 특정 프로모토를 안티센스 방향으로 F3H유전자에 융합시키고, Agrobacterium-매개 형질전환, 입자 총 충격(particle gun bombardment), 직접적인 DNA 도입기술 등의 공지된 기술을 이용하여 융합구조체를 담배, 페투니아, 토마토등의 식물세포, 또는 기타 실물세포속에 도입시킬 수 있다(가령, Napoli C, Lemieux C 및 Jorgensen R, 1990,“키메라 칼콘 신타아제 유전자의 페투니아 속으로의 도입에 의해 상동 유전자가 트랜스로 가역적 공- 발현됨,” Plant Cell 2:279-289; Mariani, C., Beuckleer, M., Truettner, J., Leemans, J, 및 Goldberg, R.B., 1990,“키메라 리보뉴클레아제 유전자에 의한 식물에서의 수 불임성의 유도,”Nature 347:737-741; Oeller, P. W., Min-Wong, L., Tayor, L.P., Pike, D.A., 및 Theologis, A.,“ 안티센스 RNA에 의한 토마토 결실 노화의 가역적 억제”, Science 254:437-439 참조). 융단세포 프로모터는 차별적인 cDNA 클로닝에 의하여 분리할 수 있고(Goldberg, R.B., 1988,“식물체: 새로운 발생과정,”Science 240:1460-1467) 또는 이전에 공표된 융단세포- 특정 프로모터에 상동적인 게놈 서열의 중합효소사슬반응(PCR) 증폭에 의해 합성된 혼성화 프로브를 이용함으로써 분리할 수 있다(SaiKi, R.K., 1990,“게놈 DNA의 증폭,”PCR Protocols, M.A. Innin, Felfand, D.H., Sninsky, J.J. 및 White, T.J., eds, Academic Press, San Diego, pp. 13-20 참조).
한편 F3H유전자는 공표된 Antirrhinum F3H서열에 근거한 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 혼성화 프로브를 합성함으로써(상기의 Saiki, R.K., 1990 참조) 분리할 수 있다. 추가의 대안으로서, 식물체에서 F3H, CHI 또는 CHS를 암호화하는 유전자를 변형, 돌연변이, 제거, 차단 또는 다르게 손상시켜서 식물체에서의 F3H효소의 발현을 방해할 수 있다. 예컨대, 1992년 1월 8일 공표된 유럽특허출원 EP 0465024 에 기재된 대로 식물체의 핵게놈으로부터 식물에서 F3H를 암호화하는 유전자를 결실시키고, 유도가능한 프로모터에 작동적으로 연결된 F3H유전자로 대체하여, 외부로부터 유도된 유전자 발현에 의하여 플라보놀 생성의 미차단 및 식물수정능력의 회복의 조절을 가능하게 할 수 있다.
생체내에서 F3H의 합성을 차단하는 것이외에도, F3H와 직접적으로 상호작용하여 그것의 히드록실라제 활성을 불활성화 또는 손상시키는 분자부로 F3H활성을 차단할 수 있다는 것도 또한 명백할 것이다.
부가적으로 CHI활성을 차단함으로써 플라보놀의 생성을 손상시킬 수 있다; 그러나 이러한 대안은 칼코노나링게닌의 나링게닌으로의 전환이 CHI의 부재하에서는 자연적으로 낮은 속도로 진행하기 때문에 덜 바람직하다.
CHS, CHI 또는 F3H활성의 결핍의 결과로서 플라보놀이 결핍된 식물체에서 수 기능의 손상은 꽃밥형태가 색깔, 모양, 및 크기에서 정상에서 벗어날 때 열개 바로전까지는 화분 발생에 있어서 심하게 비정상으로 되지는 않는다. 열개시 화분은 꽃밥내에서 엉겨붙고 현미경으로 관찰할 때 꽃밥의 주머니에서 화분립들의 상당부분이 정상보다 줄어드는 것 같다. 생육가능한 화분이 생성되고 발산되지만 화분발아 및 관 생장이 생체내 및 생체외에서 크게 손상된다. 기능적으로 수 불임성뿐만 아니라, 플라보놀-결핍식물은 자가불화합성의 일부 양상을 나타내는데, 이것은 화분이 야생형 식물의 암술머리에 의하여 부분적으로 회복될 수 있지만 플라보놀- 결핍식물의 암술머리에 의해서는 그러하지 않은 사실에 의해서 입증되었다. 수 불임성 및 자가불화합성의 요소들은 명백하지만, 플라보놀- 결핍식물의 화분이 나타내는 특징은 명백하게 여기서 조건수 임성(CMF) 으로서 나타내는 특유한 상태를 구성한다.
CHS가 결핍된 식물(EK라서 플라보노이드가 결핍됨) 은 두 특성을 제외하고는 정상으로 나타난다: (1) 플라보노이드 착색의 결핍 및 (2)기능을 나타내기 위해서는 야생형 암술(암술머리+ 암술대) 에 완전히 의존하는 손상된 화분의 생성.
CHS결핍 식물은 플라보노이드 착색의 결핍 및 화분기능의 손상을 모두 나타내지만 식물종사이에는 일부 차이점이 명백하다.
옥수수 백색 화분은 옥수수의 털에서 발아하고 생장이 암술대에 의해 방해되는 화관을 생성한다. 부가적으로 옥수수 돌연변이체 화분은 생체외에서 발아하고 거의 야생형 화분의 길이의 관을 생성한다(L.P. Taylor, 미공표 관찰). 반대로, 플라보노이드- 결핍 페투니아의 화분은 암술머리를 침투하지 못하고, 생체내 또는 생체외에서 관을 생성하지 못한다. 옥수수와 페투니아 사이의 이러한 차이는 3세포(옥수수) 및 2세포(페투니아) 화분사이의 생리학적 차이에 의하여 설명될 수 있다. 2 세포 화분은 발산(shedding)될 때 낮은 호흡율을 가지고, 발산후 제 2정세포를 형성하고, 발아하기 수시간전에 암술머리에 있을 수 있고 낮은 초기 화관 생장율을 갖는다.
3 세포 화분은 개화전 제 2유사분열을 겪고, 발아될 때 높은 호흡율을 가지고, 암술머리 표면과 접촉후 수 분내에 발아하고 높은 초기 생장율을 갖는다. 3 세포 화분은 발산 후 빠르게 생장할 준비가 되어 있기 때문에, 옥수수 백색 화관은 관생장을 억제하는 어떤 기작이 효과가 있기 전에 상당한 길이로 생장한다.
세대교번을 하는 현화식물에서 2배체 포자체는 생장하고 유사분열하여 배우체를 생성하는 반수체 포자를 생성한다. 배우체 생활주기의 일부는 발생중인 화분포자가 주위의 포자체 조직과 밀접하게 접촉하는 동안 일어난다.
이러한 배열은 2배체- 반수체 상호작용의 가능성을 갖는다. 이형접합 식물에서 이러한 상호작용은 또한 제1도에서 나타낸 것처럼 두 유형의 배우체 사이의 반수체- 반수체 상호작용을 포함할 것이다.
옥수수 백색화분 수 불임성은 유전학적으로 열성인 반면에 여기서 기술된 페투니아 플라보노이드- 결핍 수 불임성은 유전학적으로 우성인 사실은 배우체 또는 포자체가 그 효과의 원인이 되는지의 여부에 관한 흥미있는 결론으로 이끈다. 옥수수에서 수 불임성은 단지 두 CHS유전자 c2 및 Whp에 대해서 열성인 동형접합 식물에서만 발현된다. C2 또는 Whp중 어느 단일의 기능적인 카피를 갖는 이형접합체는 100% 황색의 임성 화분립을 생성한다(Coe등, 1981).
따라서 이형접합체에서는 CHS- 양성 포자체 또는 50% CHS- 양성 배우체가 CHS- 음성 배우체에서 임성의 발현에 영향을 미친다.
트랜스유전자 함유 페투니아에서는, 수 불임성이 우성형질과 연관되고 이형접합 식물에 의해 생성되는 화분은 100% 수 불임성이다.
이 경우에는 CHS 억제된 배우체에 의한 CHS- 양성 배우체의 억제 또는 트랜스유전자 함유 포자체에서의 CHS결핍에 의하여 불임성이 야기된다(제1도). 수 불임성을 야기하는 CHS결핍에 대한 생리학적 기초는 옥수수와 페투니아에서 동일한 것같고, 두종에서 불임성 표현형을 야기하는 것은 배우체가 아닌 포자체이다. 따라서, 옥수수와 페투니아에서 CHS결핍과 연관된 조건 수 임성은 공통의생리학적 기초를 가진다.
플라보놀- 결핍 식물의 조건 불임성 화분의 생성은 생체외 화분 회복검사(in vitro pollen rescue assay)의 기초로서 이용할 수 있다.
정제한 플라보노이드 또는 식물체 추출물로 보충된 발아용액에서 트랜스유전자 함유 화분을 배양하고 증가된 발아 빈도 및 화관 생장을 측정함으로써, 화분기능에 필요한 특정 화합물들을 확인할 수 있다.
이러한 방법으로 넓은 부류의 플라보노이드 화합물이 일반적으로는 CMF식물에서 임성을 회복시키는데 균일하게 효과적이지는 않으며, 특정 군의 임성 회복플라보놀 아글리콘이 이러한 목적에 효과적이라는 것이 결정되었다.
CMF식물의 화분의 발아를 촉진하는데 효과적인 어떤 플라보놀도 본 발명의 수행에서 이용할 수 있다. 그러나 비교적 큰 부류의 플라보노이드에 속하는 대부분의 것들은 이러한 목적에 효과적이지 못하다는 것이 발견되었다. 따라서 본 발명의 본직적인 면은 특별히 효과적인 임성 회복 플라보놀을 확인하여 CMF 자가불임 조건에서 식물 수정능력의 회복에 이용할 수 있다는 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 수정능력 회복 플라보놀은 하기의 식의 화합물이다:
여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 1 내지 3 탄소원자의 알콜시이다. 더 바람직하게는 R1-R5중 단지 둘만 히드록실 또는 메톡시이고 나머지 R1-R5는 수소이고, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 메톡시이다. 현재 본 발명의 특히 바람직하고 대표적인 수정능력 회복 플라보놀 화합물은 갈란긴, 캠프페롤, 이소- 람네틴, 케르세틴, 및 모린을 포함하며 이것들은 하기의 치환기와 상기에 나타낸 일반 화학구조를 갖는다:
[표 1]
본 발명의 수행에 유용한 다름 플라보놀은 여기에 나타낸 생체외 화분 회복검사법을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기의 내용은 하기의 실시예와 관련하여 더 잘 이해될 수 있으며, 이것은 제한의 목적이 아니고 예시의 목적을 위해 제공한다.
[실시예 1]
[칼콘 신타아제- 결핍 페투니아의 수정능력]
트랜스유전자 함유 근교 V26페투니아를 300-600μmol m-2sec-1의 강도로 금속할로겐화물광(光)으로 보충된 온실에서 16/8 시간의 광주기로 유지시켰다. 근교 V26은 화분, 꽃밥 및 꽃실, 암술(암술머리+ 암술대)을 포함하여 대부분의 식물조직에서 플라보노이드를 생성할 수 있고 완전히 자가화합성인 Petunia hybrids의 착색된 계통이다.
분석한 트랜스유전자함유 재료는 두 개의 독립된 형질전화 재생식물 218.38 및 218.41(Napoli C, Lemieux C 및 Jorgensen R, 1990,“키메라 칼콘 신타아제 유전자의 페투니아 속으로의 도입에 의해 상동유전자가 트랜스로 가역적 공- 발현됨,”Plant Cell 2:279-289) 그리고 친(親)V26계통과의 두 번재 여교배(戾交配) 세대(BC2) 로부터의 개체(개체군2425 내지 2435)로 구성되었다. 이러한 형질전환체에서 T-DNA삽입체는 선별가능 표지로서 네오마이신 포스포트란스페라제 Ⅱ 유전자에 연결된 바이러스 프로모터와 융합된 CHS cDNA 서열을 포함한다(Napoli 등, 1990). 화분의 적용 24시간전에 꽃을 없앰으로써 교배를 행하였다. 교배에 이용된 모든 트랜스유전자함유 꽃은 어떤 색소의 가시 징후도 보이지 않았다.
화분공여체(donor)는 2 내지 3 열 개성 꽃밥을 가진 식물체로부터 선택되거나 또는 두툼한, 열 개 전의 꽃밥으로부터 절단되었다.
트랜스유전자함유 페투니아 식물체 218.38 및 218.41 은 CHS유전자의 부가적인 카피의 도입후에 순백색 꽃을 생성한다. 트랜스유전자함유 꽃잎에서 CHS발현을 조사했을 때, 미형질 전환 V26교배친(parent)또는 체세포 연전체(revertant) 와 비교하여 50 배의 mRNA 유도가 내생적인 CHS유전자 및 도입된 CHS 유전자에서 검출되었다. V26 근교 계통은 잎, 줄기, 작은 꽃자루, 암술대 및 꽃밥 꽃실에서 자색의 안토시아닌 색소를 생성하고, 발생중인 꽃밥에서 황생의 칼콘을 생성한다. 한편 형질전화된 식물은 이러한 조직들중 어느 것에서도 식별가능한 플라보노이드 색소를 갖지 않는다. 가시의 색소의 결핍은 실시예 6에서 기술된 대로 메탄올 추출물의 HPLC 분석에 의하여 확인되었다. 정상적으로 발산 바로전에 성숙한 화분으로 채워진 페투니아 꽃밥이 건조상태로 된다. 열 개시 꽃밥덮개가 스토미움을 따라서 세로방향으로 파열될 때, 조직의 탈수상태에 의해 꽃밥 열편(裂片)의 두 가장자리가 서로에 대해서 뒤로 오그라들어서 화분립을 노출시킨다.
착색되지 않은 트랜스유전자함유 식물을 자세히 관찰한 결과 열개 48시간전에는 꽃밥이 길이에 있어서 평균 40%만큼 움츠러들고 색깔이 크림색-백색에서 황갈색으로 변한다는 것을 나타냈다. 한편 미형질전환 교배친 v26의 꽃밥은 단지 약15%만큼 움츠러들고 색깔변화를 겪지 않고 이 기간내내 황색이었다. 열개성 꽃밥의 빈도의 넓은 변이는 0 내지 100% 의 범위에서 상대습도가 낮아지면 빈도가 증가하는 것으로 나타났다. 열개는 V26교배친에 비해 다소 지연될 수 있지만, 플라보노이드-결핍 꽃밥은 열려서 정상적인 양의 화분을 노출시키는데, 이 화분은 V26화분만큼 가볍고 깨지기 쉬운 것 같지는 않고 꽃밥덮개내에서 엉겨붙은채로 있다.
하기의 것들중 어느 것을 이용하여 218.41 의 플라보노이드- 결핍 자손의 자가수분에 대한 무수한 시도로부터 어떤 결실도 일어나지 않았다: (i) 움츠러들고, 황갈색인, 열개성 꽃밥으로부터 화분 또는 (ii)백색이고, 두툼한, 열개 전의 꽃밥으로부터 절단된 화분(표2, 5열, “트랜스유전자함유 자가교배: 0 씨/ 꼬투리” 참조).
V26 교배친 계통의 자가교배는 평균 225 씨/ 꼬투리를 생성하였다.
이것은 시도한 75 트랜스유전자함유 페투니아 자가교배에서 대략 17,000 개의 가능한 씨로 해석된다.
표2에 나열된 모든 식물은 근교계통 V26으로부터의 화분과 암술머리를 수분시킴으로써 암 임성(female fertility)에 대해서 시험하였다.
모든 경우에 꼬투리는 정상적인 씨의 보충물과 함께 생성되었으며, 이것은 CHS결핍 식물이 암 임성이라는 것을 나타낸다.
V26 암술머리위의 상호교배, 트랜스유전자 함유 플라보노이드- 결핍 화분은 표 2에서 보여지는 것처럼 다양한 양의 씨를 생성하였다.
[표 2]
* 이 식물의 다른 가지의 꽃은 화관에서 일부 자색 색소를 가진다.
a 나열한 각 식물에서 적어도 4개의 꽃은 V26화분과 모든 세트 전체 씨 꼬투리로 수분시켰다.
꼬투리당 씨의 평균 수=225.
수 교배친으로서 10 개의 다른 트랜스유전자함유 식물을 포함하는 37 교배중에서, 11개는 어떤 꼬투리도 생성하지 않았고, 20개는 꼬투리당 150개미만의 씨를 갖는 꼬투리를 생성하였고, 6 개는 꼬투리당 150개 보다 더 많은 씨를 갖는 꼬투리를 생성하였다.
이것은 평균하면 꼬투리당 대략 60 개의 씨 또는 씨 세트의 70%감소가 된다.
이러한 결과는 플라보노이드- 결핍 식물의 화분은 플라보노이드- 결핍 암술머리상에서 비- 기능적이지만, 야생형 암술머리상에서는 부분적으로 기능적이라는 것을 나타내며, 이러한 상태를 여기에서는 조건 수 임성(CMF) 으로서 나타냈다.
이러한 이계교배에서 수분 당 씨 세트 수의 큰 변이는 가능하게는 환경적 및/ 또는 발생적 인자에 기인한다.
CMF는 수 임성에 필요한 유전자 속으로의 T-DNA의 삽입에 기인하는 것 같지는 않은데, 그것은 두 독립적인 형질전환체 218.38 및 218.41 이 둘다 동일한 특성: 플라보노이드 착색의 완전결핍 및 동일한 우성 수 불임성 표현형을 나타내기 때문이다.
이러한 결론에 대한 부가적인 증거는 형질전환된 재생체가 때때로 완전 착색식물로 체세포 역전하지만 트랜스유전자를 보유한다는 Napoli 등(1990)의 관찰로부터 유래하는데, 이것은 트랜스유전자만의 존재는 내생적인 CHS 발현을 억제하지 않는 것을 나타낸다.
이러한 체세포 역전체의 추가의 관찰과 교배는 그것들이 완전 수 임성이라는 것을 나타낸다.
옥수수의 백색 화분과의 유사성을 보면, 페투니아의 CMF는 CHS 또는 F3H유전자 발현의 억제에 의해 야기되는 것과 같은 플라보노이드의 결핍에 의하여 야기되는 것같다.
[실시예 2]
[화분 발아 및 화관 생장]
생체외 발아는 Mulcahy GB 및 Mulcahy Dl, 1988,“The effect of supplemented media on the growth in vitro of bi-and trinucleate pollen,”Plant Science 55: 213-216에 기재된 것과 같은 단순화된 Brewbakers 배지(여기서는 때때로 “발아배지”또는 “GM”으로 나타냄)에서 새로 수집한 화분에서 수행하였다. 단일의 꽃밥의 화분을 50μl 의 배지가 있는 마이크로타이터 웰속에 놓고, 6 내지 8시간동안 실온에서 진동시키고, 코닥테크니컬 팬필름으로 촬영했다.
생체내 화관생장은 Herrero M. 및 Dickinson H.G., 1979, “Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrids: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses,”J Cell Sci 36:1-18에 기재된 것처럼 수분후 48 시간이 지나서 측정하였다. 칼로즈(callose) 마개는 Leitz Aristoplan 으로부터 355-425nm(D입방체)에서의 여기(excitation) 및 억제파장 460nm에 의하여 발생된 에피플루오레센스(epifluorescence) 에 의하여 명시화되었다. 표본을 Ektachrome T 160 필름으로 촬영하고 프린트는 인터네가티브로부터 만들었다.
화분 생존능력은 발아배지중의 카르복시플루오레세인 아세테이트 용액(1mM)에서 새로 열개한 화분을 배양함으로써 형광색소방법(fluorochromatic procedure; FCR)으로 결정하였다(Heslop-Harrison J. 및 Heslop-Harrison Y., 1970,“Evaluation of pollen viability by enzymatically induced fluorescence; intracellular hydrolysis of fluorescein diacetate,”Stain Technol. 45:115-120). 에피플루오레센스는 상기에 기술한 대로 명시화 되었다.
[칼로즈생성]
페투니아 화관은 정상적으로 발아후 약 1시간이 지나서 암술머리를 침투하고(Herrero 및 Dickinson, 1980) 암술대조직을 통해 아랫쪽으로 생장하여 배낭에 두 정세포를 위치시킨다. 칼로즈는 β(1K3) 글리코시드 결합으로 연결된 다당류 중합체이며 이 물질의 마개는 정상적으로는 생장하는 화관밑에 규칙적인 간격으로 위치된다.
칼로즈는 탈색된 아닐린 블루로 염색한 후 그것의 특유한 형광에 의하여 명시화된다(Currier 1957; Eschrich 및 Currier 1964). 실시예 1의 CHS- 결핍 꽃의 자가 교배 그리고 V26화분과의 동일한 식물체의 여교배에서 발아 및 화관의 생장을 조사하였다.
수분후 48시간이 자나서 암술을 수집하고, 탈색된 아닐린 블루로 염색하고, 형광현미경에 의해 조사하였다. V26에 의해 수분된 플라보노이드- 결핍 암술의 열매에서 암술대 아래쪽 도처에서 규칙적인 패턴의 칼로즈 층이 관찰되었다. 한편 자가수분된 페투니아의 암술에서는 암술머리위에 풍부한 양의 화분이 존재함에도 불구하고 어떤 칼로즈도 보이지 않았다.
[화분 형태학 및 발아]
실시예 1의 플라보노이드- 결핍 식물의 새로 떨어진 화분을 현미경으로 조사하였으며 어떤 심한 비정상적인 특징을 나타내지는 않았다.
페투니아 화분은 단순 액체배지에서 배양할 때 용이하게 발아하는 관을 생성한다.
BC2 군의 각각(2425 내지 2435)의 발아된 화분을 V26화분에 대해서 생체외에서 비교하였다. 전형적인 견본들을 제2도에 나타냈다. 제2도에서 보여지듯이 6시간의 생장 후에 많은 돌연변이 화분립은 발아구멍중 하나 주위의 두드러진 팽창에 의해 주지되는 것처럼 발아를 시도했지만(제2도의 화살표), 그러나 고작 플라보노이드- 결핍 식물 화분립의 단지 2% 만이 어떤 길이의 관을 생성하였다. 측정가능한 관을 생성하지 않는 화분립에서 그 길이는 동일 조건하에서 생장한 V26 화관의 길이의 20%보다 더 적었다.
플라보노이드- 결핍 식물에 의해 생성되어 발산되는 화분이 생육가능하고 따라서 발아 및 화관 생장할 수 있는지를 결정하기 위하여, 새로 발산된 트랜스유전자함유 V26화분에 대해서 생존능력에 대한 형광색소분석(FCR)을 수행하였다. 이 시험은 플루오레세인 디아세테이트 화합물의 화분립속으로의 수용과 그 다음 세포내 효소에 의한 플루오레세인으로의 전환에 의존한다. 플루오레세인은 극성이 크고 대부분 생장 세포 세포질에서 고립되어 있고, 거기서 그것은 형광현미경에 의해 명시화된다.
근교 V26화분은 완전히 어떤 내부특징이 결핍된 높은 비율(40%까지)의 비정상적으로 작은 FCR 음성 화분립으로 구성된다.
이러한 유형의 몇 개의 화분립은 제2(a)도에서 볼 수 있고, 사진의 중앙에 있는 두개를 포함한다. 이 집단은 발아하지 않으며 대부분 기형의 화분립이다.
나머지 화분립(60%) 중에서 거의 모두 양성 FCR테스트를 나타내는데, 이것은 온전한 원형질막과 활성이 있는 세포질의 에스테라제의 존재를 나타낸다. 돌연변이 꽃밥의 화분은 높은 비율의 움추러든 기형 화분립을 보유하였다.
나머지 정상으로 보이는 화분립중에서 90%이상이 FCR양성이었다.
플라보노이드- 결핍 식물에 의해 생성된 화분의 대부분의 생육가능하고 대사적으로 활성이 있다는 사실은 정상적인 화분 발아 및 관 생장에 CHS활성의 일부 측명이 필요하다는 것을 나타낸다.
[실시예 3]
[꽃밥 발생의 현미경에 의한 관찰]
소포자생성동안 CHS활성의 결핍이 발생하는 화분립 또는 꽃밥조직의 세포구조를 변형시키는지를 결정하기 위해서, V26 및 CHS결핍식물 02425.1의 화분발생을 비교하였다.
0.1 내지 6 cm의 길이의 페투니아 싹의 발생단계별로 꽃밥을 수집하고, Pipes(ph 7.2) 중의 2%파라포름알데히드, 1.25% 글루타르알데히드에 고정시키고, Spurrs수지에 포매하고, 1μm 단편을 톨루이딘블루로 염색하였다.
코닥테크니컬 팬 필름으로 현미경사진 촬영하였다. 조직학적으로 이것은 포원 세포조직 분화의 최초 증거로부터 성숙한 화분으로 채워진 열 개 전의 꽃밥까지 소포자 생성의 모든 단계를 나타낸다. 융단조직의 발생 및 그 이후의 분해에 큰 관심이 주어졌는데, 이 조직은 화분 플라보노이드의 공급원이라고 생각되기 때문이다.
모든 단계에서 트랜스유전자함유 꽃밥 및 발생중인 소포자는 V26과 비교했을 때 큰 조직학적 차이를 보이지 않았다. 두툼하고 백색인 것으로부터 움츠러들고 황갈색인 것으로 전이되는 동안 플라보노이드- 결핍 꽃밥에서 부가적인 단편을 취하여 V26 의 유사한 단계들과 비교했다(제3도).
열개전에는 내피층의 세포가 정상적으로는 방사상으로 확장되고, 두꺼워지고, 꽃밥 파열의 기작에 포함된다고 생각되는 물질을 침적시킨다(Cutter, E.G., 1978,“Plant Anatomy: Experimentation and Interpretation. Part 1,”Cells and Tissues . 2nd ed., London: Arnold). 이 층은 연속적이지는 않고 스토미움 주위의 부위에는 존재하지 않는다.
움츠러든 황갈색 꽃밥의 단편은 내피층, 스토미움, 또는 꽃밥 주위의 외피에서 심한 비정상적인 특징을 보이지 않았다. 그러나 V26화분과 비교했을때(제3도, “V26”열) 내부특징이 없는 움츠러든 화분립의 보다 높은 비율이 트랜스유전자함유 식물의 꽃밥 주머니에서 존재하였고 더 큰 화분립은 크기, 모양, 및 염색반응에서 보다 더 이질적이었다(제3(c)도 및 제3(d)도). 제3(c)도 및 제3(d)도에서 보여지는 이종성은 화분이 정상적으로는 매우 탈수된 상태로 발산되고 암술머리에서 빠르게 재수화(rehydration)되는 사실에 의하여 설명될 수 있다.
플라보노이드- 결핍 화분은 정상보다 훨씬 더 탈수된 상태로 발산될 수 있고, 액체 발아배지에 놓였을 때 정상 형태로 재수화 되는 것같다.
[실시예 4]
[페투니아 플라보노이드 추출물]
페투니아 화분 추출물의 분석에 의해 주요 플라보노이드를 케르세틴 및 캠프페롤의 3-0-글리코시드, 4,2',4',6'- 테트라히드록시칼콘, 디히드로플라보놀, 탁시폴린(taxifolin) 으로 확인하였다(Zerback, R., Bokel, M., Geiger, H. 및 Hess, D., 1989, Phytochemistry 28:897-899; Zerback, R., Dressler, K. 및 Hess, D., 1989, Plant Science 62:83-91; De Vlaming, P. 및 Koh, K.F.F., 1976, Phytochemistry 15:348-349).
옥수수화분은 캠프페롤, 케르세틴, 및 이소람네틴의 적어도 10 글리코시드를 포함한다(Ceska, O. 및 Styles, E.D., Phytochemistry 23:1822-1823). 야생형 및 근교 페투니아 계통 V26의 수성 추출물은 암술머리를 겸자로 거세하거나 또는 이후에는 GM 으로 나타내는 PEG 4000배지중에서 화분현탁액을 와동시키고(W. Jahnen, W.M. Lush, A.E. Clarke, 1989, Plant Cell 1:501), 원심분리기에서 5분 원심분리하고, 상층액의 분액을 96 웰 마이크로타이터 플레이트에서 GM 중의 CMF화분현탁액에 적접적으로 적용시킴으로써 만들어졌다.
메탄올 추출물은 추출물이 진공하에서 건조되고 화분현탁액에 첨가되기전에 GM 중에 재현탁되는 것을 제외하고는 동일한 프로토콜에 따라 만들어졌다. 초기회복 실험은 10 개의 V26암술머리에서 제조한 수성추출물 20μl(전체체적의 1/5)을 이용하여 33% 발아율을 끌어냈다. 콘트롤로서 CMF식물의 암술머리와 화분으로부터 유사한 방법으로 추출물을 제조했다. 화분 발아 검사에서 단지 V26암술머리와 화분의 추출물만이 플라보노이드- 결핍 화분에 발아 및 관 생장을 회복시킬 수 있다.
야생형 및 CMF화분과 암술머리 추출물을 하기와 같이 분석하였다. 암술머리 또는 화분을 먼저 50%메타올로 추출하고, 그다음 100%메탄올로 추출하고, 추출물을 모아서 농축하였다. 아글리콘은 산 가수분해에 의해 생성되었다: 추출물을 4N HCl과 혼합하고, 2ml앰풀에 밀봉하고 끓는 물에서 40 분간 가수분해하였다. 복제샘플을 역상 C18컬럼(Phenomenex Spherisorb 5 ODS 2 250×4.6mm)속에 주입하였다.
용매 A는 5% 아세트산이고 용매 B는 80%아세토니트릴중에 5% 아세트산으로 구성되었다.
각 사이클은 6분간 아이소크래트 구배(isocratic gradient)(20% B), 그 후 20 분간 95% B까지 직선구배, 14분간 95% B에서 아이소크래트 구배로 종결되는 것으로 이루어졌다. 용매 유속은 실온에서 0.5ml/min이었다.
Hewlett Packard모델 1040A 포토다이오드 어레이 디텍터로 360nm에서 검출했다.
캠프페롤은 60ng 암술머리에서 야생형 암술머리 추출물에서 검출되었고, 케르세틴은 실직적으로 더 낮은 수준에서 검출되었다. 150 CMF암술머리 수집물로부터 또는 500 CMF 꽃밥으로부터 동일한 추출물은 전형적인 플라보노이드 스펙트럼을 보이는 어떤 피크도 생성하지 않았다.
야생형 암술머리 추출물의 단백질 소화효소, 열, 및 분자크기 막 통과 처리는 활성 화합물이 작은 비- 단백질함유 분자라는 것을 나타냈다. 활성화합물의 분자량은 3000 달톤 분자량 차단필터(Centricon-30 필터, Amicon)를 통해 추출물을 통과시키고 화분회복활성이 필터를 지나 통과하는 것을 봄으로써 측정하였다.
V26 암술머리 및 화분의 수성 추출물을 100μl 반응체적에서 30 분간 37 ℃에서 0.025유니트의 파파인으로 처리하였다. BSA(0.5mg/ml)를 동일한 조건에서 처리하고 SDS- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 소화생성물을 조사하여 효소활성을 확인하였다.
프로테아제나 열처리(100℃, 5분) 어느것도 추출물이 CMF 화분발아 및 관 생장을 회복시키는 능력을 제거하지 않았다.
이러한 결과들은 야생형 화분에 존재하는 플라보노이드는 화분 발아에서 역할을 하며 야생형 암술머리는 CMF 화분에서의 플라보노이드의 결핍을 보충할 수 있는 유사한 화합물을 포함하는 것을 나타낸다.
[실시예 5]
[CMF 수정능력의 플라보놀 회복]
실시예 1의 플라보노이드- 결핍 화분의 생화학적 상보는 발아배지(GM)중의 CMF화분 현탁액에 낮은 농도(1μM)의 캠프페놀, 플라보놀 아클리콘을 첨가하여 이루어졌다.
제4도에서 보여지는 것처럼, 12시간 생장기간 내내 나란히 비교한 것은 플라보놀 보충을 받지 않은 야생형 V26화분과 비교했을때(C) 회복된 CMF화분(K+)에서는 발아가 동시에 개시되고 관 생장은 동일한 속도 그리고 동일한 정도로 진행하는 것을 확인시켰다. 회복은 거의 완전하였다; 플라보노이드- 보충된 화분은 V26화분에 비해 80% 발아빈도를 나타냈다.
단지 DMSO 용매만이 첨가된 CMF화분(K-)은 상당한 발아를 보이지 않았고(1-2%) 그것은 발아한다고해도 화관은 2 화분립 직경이상 진행되지 않았다.
화분발아 및 관 생장을 회복시킬 수 있는 야생형 암술머리 추출물이 캠프페롤을 포함하는지를 확인하기 위해서, 가수분해되지 않은 추출물을 HPLC 에 의해 분류하고 UV/가시 흡수 스펙트럼분석에 의해 분석하였다. 전형적인 플라보놀 스펙트럼(260 및 360nm 주위의 흡수최대치) 및 보유시간을 갖는 하나의 피크가 V26암술머리 추출물에서 검출되었다(제5(a)도 및 삽입도). 이러한 추정 캠프페롤 피크를 모아서 건조상태까지 증발시키고, DMSO에 재현탁시키고, 생체외 GM 배지에 첨가하였고, 거기서 CMF화분으로부터 환전발아 및 관 생장 반응을 일으켰다.
실제 캠프페롤 표준과 함께 이 활성 분획의 재- 크로마토그래피를 하여 그것의 순도와 정체를 확인하였다. 150 암술머리의 이러한 분석으로부터 V26암술머리에서 캠프페롤의 양은 60ng/암술머리인 것으로 계산되었다.
34μl의 암술머리체적(체적변위)을 생각함으로써, V26 암술머리에서 플라보놀 농도는 약 6μM이고, 이러한 수준은 강한 발아반응을 일으킬 수 있는 수준이다.
150 CMF 암술머리 수집물 또는 500 CMF 꽃밥의 추출물에 대한 동일한 분석은 전형적인 플라보노이드 스펙트럼을 나타내는 어떤 피크도 생성하지 않았다(제5(b)도 참조).
V26 화분 및 꽃밥의 추출물은 제5(a)도에서 보여지는 것과 유사한 크로마토그램을 생성하였다. 캠프페롤을 나타내는 보유시간 및 UV/가시 스펙트럼을 갖는 용출물 피크는 GM 중에 CMF에 첨가했을 때 완전하게 화분발아를 촉진시켰다. 이러한 분석은 캠프페롤이 야생형 화분과 꽃밥에 존재하는 것을 확실하게 한다.
[화분회복 활성에 필요한 구조적 특징]
페투니아의 야생형 화분과 암술머리 추출물은 또한 화분발아 및 관 생장을 촉진시킬 수 있는 캠프레롤 이외의 다른 화합물을 포함한다(제5(a)도). 따라서 모든 주요부류의 플라보노이드의 대표적인 화합물: 플라본, 플라바논, 플라보놀, 이소플라보노이드, 칼콘, 안토시아닌, 및 카테킨을 하기와 같이 화분회복 활성에 대해 시험하였다.
페투니아 화분립을 1-2×104/ml 의 밀도로 PEG 4000 발아배지(GM)에 현탁시키고, 현탁액중 100μl 분액을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 휄속에 넣고, 150rpm으로 진동시키면서 실온에서 배양하였다.
화분의 첨가전에 어떤 보충물을 GM에 직접 가하였다. 플라보노이드와 다른 화학물질은 스톡용액을 디메틸술폭시드(DMSO)중에 직접만들어서 하기의 표 3에 나타낸 최종 농도로 각 웰에 첨가했다.
각 시험에서 DMSO 의 농도는 1% 로 일정하게 유지했다.
화관이 1 화분립 직경 이상의 길이일 때 화분이 발아된 것으로 평가했다.
실질적으로 발아한 모든 화분립은 5 화분립직경 보다 더 긴 관을 생성한다.
실시예 1에서 기술한 페투니아 V26은 두 유형의 성숙화분을 생성한다; 화분립의 약 25%는 어떤 내부특징 없이 작고 그것은 생체외에서 발아하지 않는다. 따라서 전체 화분립의 75%가 발아했을 때 V26의 완전 발아가 일어난다. 실시예 1의 CMF 페투니아 화분은 이러한 동일비율을 유지한다. 대부분의 회복실험에서 최대발아 빈도는 생육가능 화분립의 89%이었다. 각 시험에서 4시간 배양후 최소 1000화분립이 평가되었다.
발아반응을 획득하는데 필요한 시험화합물의 최저농도를 하기의 표에 나타냈으며, 여기서 NR은 어떤 반응이 없는 것을 나타낸다.
100μM에서 ＜20% 발아를 일으킨 화합물은＞ 100 μM 로서 나타낸다. 표 3에 나열된 화합물 이외에도, 비-플라보노이드 P- 쿠마르산, 살리실산, 히드로퀴논, 클로로겐산, 디히드로아스코르브산, 나프틸프탈름산(NPA), 1- 나프탈렌아세트산(NAA), 인돌-3- 아세트산(IAA) 및 지베렐산(GA3)을 시험했으며 어떤 반응도 생성하지 않았다.
[표 3]
표 3에 나타낸 것처럼, R-치환기 위치는 하기 식의 플라바노이드에 대응된다:
표 3으로부터 알 수 있듯이, 아글리콘 플라보놀은 CMF화분에 대해 최대발아빈도 및 관 생장력을 성공적으로 회복시켰지만, 다른 부류의 플라보노이드중에서 단지 밀접하게 관련된 디히드로플라보놀, 탁시폴린만이 100μM에서 많지않은(∼18%)반응을 나타냈다.
부가적으로 페놀산, 산화방지제, 및 식물생장 조절인자를 포함하여 몇몇 부류의 비 -플라보노이드 화합물을 시험하였지만 어느 것도 화분발아를 회복시킬 수 없었다. 따라서 화분기능을 생리학적으로 적당한 온도에서 회복시킬 수 있는 능력은 플라보놀에 속한다.
시험한 플라보노이드의 범위로부터 5가지의 일반적인 구조적 특징이 최대의 화분발아 및 관 생장에 필요한 것 같다. 3-탄소 위치에서의 비치환 히드록실기 및 C고리에서 위치 4에서의 케토 기에 대한 절대적인 필요전건이 있다. 최대의 반응은 C 고리에서 탄소 2및 3사이의 불포화 결합과 A와 B고리에서 히드록실기 치환의 정도에 좌우된다. 가장 흥미롭게는 3히드록실 위치를 통해서 글리코실화된 플라보놀은 지금까지 페투니아 화분과 암술머리를 포함하여 식물체 조직에서 발견된 가장 풍부한 형태의 플라보놀임에도 불구하고 불활성적이다. 케르세틴-3-0- 글루코시드 및 루틴(케르세틴-3-0- 람노글루코시드)을 100μM에 이르는 농도에서 시험했을 때 어떤 화분발아도 얻어지지 않았다.
고리 C의 위치 4에서 케토기에 대한 필요조건은 케토기가 없는 카테킨이 활성이 없다는 사실에 의해 지적된다. 탁시폴린(100μM에서∼18%) 및 케르세틴(10μM에서∼50%)의 상대적인 효율의 비교는 C고리에서 탄소 2와 3사이의 이중겹합이 약 30 배만큼 반응을 증가시키는 것을 보인다.
케르세틴은 피세틴 또는 3- 히드록시플라본과 비교한 것은 A고리의 위치 5 또는 7에서의 각 부가적인 히드록실기가 반응을 대략 10 배 증가시키는 것을 보여준다.
이러한 증가는 주로 고리 C의 5히드록실기와 인접한 케토기사이의 상호작용의 안정화 효과에 좌우될 수 있다. 최종적으로 완전 활성에는 B고리에서의 히드록실 치환기는 필요하지 않고, 사실상 작용기의 수를 증가시키면 실제로 활성의 감소를 일으킨다(케르세틴 및 무리세틴과 캠프페롤의 비교). 이러한 차이는 무수한 히드록실기를 갖는 플라보놀의 보다 더 큰 극성 성질에 의해 야기되는 비특이적인 결합의 증가 또는 열등한 획득에 기인할 수 있다.
어떤 비활성 플라보노이드는 Rizobium- 콩과식물 시스템에서 근립(根粒) 착생 유전자의 활성 플라보노이드- 유도에 반대로 작용하는 것으로 발표되었다(Djordjevic, M.A., Redmond, J.W., Batley, M. 및 Rolfe, B. G., 1987, EMBO 6:1173-1179; Peters, N.K. 및 Long, S.K., 1988, Plant Physiology 88:396-400). 화분기능을 회복시키는데 활성이 없는 화합물을 하기와 같이 플라보놀 아글리콘의 작용을 길항할 수 있는 능력에 대해 실험하였다. 실시예 1에 기재된 대로 GM 중의 CMF화분을 1μM 로 캠프페롤을 첨가하기 전에 1μM 및 10μM 농도의 불활성 화합물에 30 분간 노출시켰다. 또한 화분 현탁액에 불활성 화합물 및 캠프페롤을 1:1 또는 10:1 비율로 동시에 첨가하여 실험을 수행하였다. 4시간 배양후에 화분발아 빈도를 평가하고, 시험한 어떤 조합들에서도 길항작용이 검출되지 않았다. 하기의 불활성 화합물을 분석하였다: 아피게닌, 칼콤, 에르오딕티올, 플라본, 플라바논, 루테올린, 나링게닌, 카테킨, 클로로겐산, P-쿠마르산, 히드로퀴논, 및 살리실산.
[실시예 6]
[UV효과]
부분적으로 플라보노이드의 UV 광 흡수능력 때문에, 플라보노이드는 식물에서 UV 보호제로서 기능하는 것으로 가정된다(W. jahnen 및 K. Hahlbroch, 1988, Planta 173:453 및 그 안에 있는 참고문헌들). 플라보노이드- 결핍 화분에서의 발아의 결핍이 UV 효과에 기인하는지를 결정하기 위해서, 암(暗) 발아 실험을 세가지를 변형하여 수행하였다. (1)수집하여 24 시간동안 완전암흑상태에서(물에서) 보관한 꽃 또는 (2) 새롭게 딴 꽃으로부터 화분을 수집하였다. 이러한 두 공급원에서 플라보놀 있는 또는 없는 GM 중의 화분현탁액을 적색안전광을 이용하여 암실에서 제조하였다. 세 번째 변형은 밝은 곳에서 새로 수집한 꽃으로 부터의 화분현탁액을 제조하지만 암흑 상태에서 플라보놀 용액을 첨가하는 것을 포함한다. 모든 표본을 금속박편으로 싼 다음 실시예 5에서 기술한 대로 배양하였다. 첨가한 플라보놀이 있거나 또는 없는, V26 콘트롤 또는 플라보노이드 결핍 화분에 대해서 광의 발아빈도에 대한 검출가능한 효과는 없었다.
UV 광이 자가수정에 영향을 주는지를 결정하기 위해서, L.P. Taylor 및 W.R. Briggs, 1990, Plant Cell 2:115에서 기술한대로 성숙 페투니아 식물을 610nm필터하에서 수 주일 동안 생장시켰다. 페투니아 싹은 형성되어 성숙되는데 약 2주일 걸리며, 따라서 식물체가 필터하에 위치한 후 형성된, 그리하여 610nm이하의 광에는 노출되지 않은 싹만을 시험하고 자가수정 시켰다. CMF 자가 교배중 어느것(10 번 시도) 에서도 씨 세트가 생기지 않았지만, 동일한 조건하에서 수행된 모든 V26콘트롤 자가교배는 완전한 씨 꼬투리를 만들었다.
[실시예 7]
[플라보놀 노출 시간의 영향]
완전한 발아와 최대의 관 생장에 필요한 플라보노이드 노출의 양은 발아하는 화분이 플라보놀의 존재하에 있는 시간을 변화시켜서 결정하였다. 최대치 가까이의 회복을 나타내도록 계산되고, 세척에 의해 쉽게 제거되는(0.5μM 최종) 농도의 캠프페롤이 GM중의 플라보노이드- 결핍화분 5ml의 현탁액을 포함하는 60×15mm 페트리접시에 첨가되었고, 결과의 현탁액이 계속적으로 150rmp 으로 회전되었다. 표 4에 나타낸 시간마다 4,400 μl 분액을 취하고, 원심분리하고, 킴프페롤을 제거하기 위해 1ml GM 으로 세척하고, 다시 원심분리하고, 400μl GM에 재현탁시키고, 두 부분으로 나누었다.
하나의 100μl분액을 다시 0.5μM 캠프페롤로 보충하고(콘트롤) 다른 부분은 부가적인 플라보놀 노출없이 생장이 계속되게 하였다(처리). 원래의 현탁액의 제제화로부터 전체 경과시간 4시간 동안 계속 생장시킨 다음 처리 및 콘트롤 발아에서 발아빈도 및 관 생장을 평가하였다. 그 결과를 허기의 표 4에 나타냈다.
[표 4]
* 평균 ＋/-SEM, n=3
** 화분립직경기준
표 4에서 보여지듯이, 측정가능한 발아의 증가가 10 분만큼 짧은 노출시간에서 검출 되었다(표 1). 최대 발아빈도 및 관 길이를 위해서는 1 내지 2 시간사이의 노출 시간이 필요하였다.
[실시예 8]
[생체내 수정능력 회복]
수분시 화분에 플라보놀 아글리콘을 공급함으로써 CMF페투니아에 자가수정능력을 회복시키는 능력은 첨가된 플라보놀의 존재하에서 행해진 CMF페투니아의 자가교배로부터 생긴 성공적인 수정에 대해 평가하여 검사하였다. 자가수분 전에 플라보놀 아글리콘은 (i)암술머리에 직접적으로 또는 (ii)새로 수집된 화분과 혼합되어 적용되었다. 씨 세트의 양으로 측정된 가장 성공적인 기술은 자기수분 12-16시간 전에 암술머리에 플라보놀을 적용하는 것을 필요로하였다.
캠프페롤 또는 케르세틴을 첨가하여 47 자가 교배를 행하였고 거의 60%(47중 27) 가 씨꼬투리를 생성하였다. 꼬투리당 씨의 수는 31내지 287로 다양했고, 발아시험에서 어떤 단일 꼬투리에서 씨의 ＞90% 는 생육가능하였다.
플라보놀 첨가없이 행한 모든 자가교배(＞30 시도) 는 씨 세트를 생성하지 않았다.
플라보노이드- 결핍 페투니아가 나타내는 우성 CMF형질은 카나마이신 내성을 부여하는 두 번째 우성 유전자(KAN) 에 밀접하게 연관된다(Napoli C, Lemieux C 및 Jorgensen R, 1990,“Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-repression of homologous genes in trans,”Plant Cell 2:279-289).
첨가된 플라보놀의 존재하에서 플라보노이드- 결핍 식물을 자가교배함으로써 생성된 씨에서의 CMF형질의 분리에 대해 시험하는데 KAN표지를 이용하였다. 새롭게 수집한 씨를 20%표백제로 표면멸균시키고, 멸균수로 세척하고, 100μg/ml 카나마이신을 포함하는 발아 플레이트(1×MS, 3mM MES(pH 5.6), 1×B5 비타민 혼합물, 3%수크로스 및 0.2% 응고제)에 플레이팅하기 전에 100ppm GA3 용액중에 30 분간 침지시켰다. 16/8시간 광주기로 보충된 23℃에서의 생장후에, 잎과 측생의 뿌리의 존재에 대해 스크리닝하여 카나마이신 내성을 평가했는데 그 잎과 측생의 뿌리 어느것도 카나마이신에 민감한 묘목에 의해서는 생성되지 않았다. 하기의 표 5에서는 P- 값은 일 자유도 카이제곱 적합도 테스트에 대한 관찰된 유의수준을 나타낸다.
[표 5]
표 5에서 보여지듯이, 100μg/ml 카나마이신의 존재하에서 발아한 씨는 이형접합성 우성 형질에 대해 기대되는 것과 같은 KAN 내성: 민감의 3:1비율로 분리되었다.
[실수예 9]
[실지시험(Field Trial)]
천연적으로 존재하는 플라보노이드- 결핍 옥수수 돌연변이체 “백색화분(white pollen)”을 이용하여 실지시험을 행하였는데, 이것을 CHS활성이 결핍되고 백색의 비- 기능적인 화분을 생성하고 자가불임성이다(E.H. Coe, S.M. McCormick, S.A. Modena, 1981, J. Hered. 72:318). 사용한 옥수수 백색화분 식물은 W23 근교 백그라운드속에 유전자 침투된 C2 및 Whp에서의 안정한 열성 돌연변이를 갖는다. 백색화분식물(c2/c2 whp/whp) 은 CHS의 단일의 기능적인 카피를 지니는 동계(同系)의 식물(C2/c2 whp/whp) 로부터의 화분과 교배시킴으로써 유지되었다.
이 식물체는 자가 및 동기교배에서 수 불임성이었고, 화분과 씨를 포함하여 어떤 조직에서도 가시의 플라보노이드색소를 생성하지 않았다.
표준유전 실지실험을 이용하여 어떤 오염화분도 백색화분 식물의 옥수수 털에 도달되지 않았다는 것을 보증하였다. 부가적으로, 백색화분 덩어리가 착색 낟알 변종으로 둘러싸여 어떤 오염 낟알이 즉시 인식될 것이다.
50-100 식물의 돌연변이 백색화분을 옥수수 수염 주머니로부터 수집하고, 모으고, 2 부분으로 나누었다. 한 부분은 교배를 위해 그대로 사용하고 다른 부분은 건조 플라보놀(케르세틴, 캠프페롤, 또는 두가지의 50:50 혼합물) 과 대략 20:1 비율로 혼합하였다. 백색화분의 옥수수털을 처리되지 않은 또는 플라보놀- 보충된 백색화분과 수분시켰고 즉시 주머니로 감쌌다. 수분후 45 일이 지나서 성숙열매를 수거했다.
백색화분 교배는 대개 열매당 ∼200 낟알로 되며 이 수는 생화학적으로 상보된 자가 교배에서 쉽게 얻어졌다.
전체 45 자가교배를 첨가한 플라보놀의 존재하에서 행하였고 그것들 모두(100%) 완전히 채워진 열매를 생성했지만 첨가된 플라보노이드 없이 행한 자가교배(45번 시도)는 정상의 1%보다 더 적은 씨 세트를 나타냈다.
상의 실험들은 하기와 같이 플라보놀이 화분 기능에 필요하다는 것을 확인시켜준다: (i) 야생형 암술머리와 화분의 메탄올 추출물 및 수성추출물은 플라보노이드- 결핍화분에 발아 및 관 생장을 완전히 회복시킬 수 있다; (ii)이 추출물은 여기서 기술된 생체외 수정능력 회복검사에서 활성을 보이는 동일한 플라보놀을 포함한다; (iii) 생체외에서 화분발아를 회복시키고 완전한 관 생장을 회복시키고 생체내에서 완전한 씨 세트를 회복시키는 능력은 특정부류의 플라보노이드인 플라보놀 아글리콘에 한정된다; (iv) 플라보놀의 효과적인 농도는 구조적 특징에 따라 변화하지만, 몇몇 화합물은 이러한 화합물의 생리적 농도내에서, 10μM보다 더 적은 수준에서 현저한 효과를 나타냈다.
플라보노이드는 태강(Hepaticae) 의 각종 이끼, 이끼류, 양치류에서 나자식물 및 피자식물까지의 거의 모든 부류의 식물에 의해 생성된다. 과거의 플라보노이드 추출 표본은 대개 식물표본집 표본의 건조된 잎 또는 뿌리조직을 사용했다; 결과적으로는 화분 플라보노이드의 존재가 퍼져 있는 범위에 대한 양호한 지표가 없다.
식물체 조직에서의 편재 및 몇몇 널리 분기하는 종들의 화분 추출물에서 플라보노이드가 확인된 사실은 플라보노이드가 화분의 일반적인 성분이라는 것을 나타낸다.
대부분의 식물 플라보놀은 3-0- 글리코실화된 종으로 존재한다(J.B. Harbome 및 C.A.Williams, 1988, in The Flavonoids, Advances in Reasearch Since 1980 J.B. Harbome, Eds. (Chapman and Hail, London) Chaps. 7,8). 그리고 이것은 페투니아 화분에서 우세한 형태이다(O. Ceska 및 E.D. Styles, 1984, Phytochemistry 23:1822). 단지 아글리콘 형태만이 화분기능을 회복시킬 수 있는데, 이것은 낮은 비- 검출 수준의 아글리콘이 정상적으로는 존재하거나, 또는 수정에 필요한 아글리콘을 생성하는데 글리코시다제 활성이 필요하다는 것을 제안한다.
화분은 수정과정을 조작하기 위한 자연적인 접근점을 제공한다.
CMF식물체로 되는 플라보놀 활성의 상실은 배우자박멸 유기제가 아닌 천연적인 배우자 저지제(gametostat)로서 작용한다. 완전 수 기능은 플라보노이드- 결핍 화분에 플라보놀을 외부적용시켜서 회복시킬 수 있다. 고등식물 수정에 포함된 인자의 확인이외에도, 본 발명의 중요한 이점은 하이브리드 씨의 생성을 위한 가역적인 수불임 시스템의 개발이다.
본 발명의 바람직한 구체예가 예시되고 기술되었지만, 본 발명의 정신과 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변화가 행해질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
Claims (8)
- 식물의 화분의 위치에서 플라보놀의 생성 또는 활성을 차단하여 발아 및 관생장능력을 억제시킨 조건 수 임성 식물을 얻고 화분과 수정능력 회복 플라보놀을 접촉시켜 식물의 발아 또는 관생장능력을 회복시키는 것으로 이루어지며, 여기서 수정능력 회복 플라보놀은 하기의 식의 화합물의 것을 특징으로 하는 식물의 수정능력을 조절하는 방법:여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 1 내지 3 탄소 원자를 갖는 알콕시이다.
- 제1항에 있어서, 식물에서 플라바논-3-히드록실라제의 생성 또는 활성을 억제시킴으로써 식물에서의 플라보놀 생성을 차단시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 식물에서 칼콘 신타아제의 생성 또는 활성을 억제시킴으로써 식물에서의 플라보놀 생성을 차단시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, R1내지 R5중 두 개 이하는 히드록실 또는 메톡시이고 나머지 R1내지 R5은 수소이고, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 메톡시인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 수정능력 회복 플라보놀은 갈란긴, 캠프페롤, 이소람네틴, 케르세틴 및 모린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 플라보노이드-결핍, 조건 수 임성 식물에 식물 수정능력을 회복시키는 방법으로서, 그 식물의 화분의 발아 또는 관 생장을 증가시키는데 효과적인 양만큼의 수정능력 회복 플라보놀과 그 식물의 화분을 접촉시키는 것으로 이루어지며, 수정능력회복 플라보놀은 하기의 식의 화합물인 것을 포함하는 방법:여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 1 내지 3 탄소 원자를 갖는 알콕시이다.
- 제6항에 있어서, R1내지 R5중 두 개 이하는 히드록실 또는 메톡시이고 나머지 R1내지 R5는 수소이고, R7및 R8은 수소, 히드록실 또는 메톡시인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 수정능력 회복 플라보놀은 갈란긴, 캠프페롤, 이소-람네틴, 케르세틴 및 모린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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