JP3418396B2 - 植物稔性の調節方法 - Google Patents

植物稔性の調節方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明の植物の稔性の調節方法に関するものであり、
そして更に詳細には植物中のフラバノン−３−ヒドロキ
シラーゼの活性を遮断することによってフラボノイドを
欠失している条件雄稔性植物を創出すること及び稔性回
復フラボノールを植物の花粉部位に提供することによっ
てフラボノイドを欠失している条件雄稔性植物の稔性を
回復することに関するものである。
発明の背景 高等植物で上手く受精することは種の保存に主要であ
るだけでなく、自然選択を行う変化や競争の源となる大
集団も提供する。雄性配偶体発育の分散後の時期に、花
粉は柱頭で発芽し、そして花粉壁の発芽孔から管を出
す。被子植物では、生長中の花粉管は、２つの精子細胞
が卵細胞及び中心細胞と融合してそれぞれ接合体及び内
胚乳を形成する胚嚢に柱頭組織を通って移動するための
導管である（E.G.Cutter、1978年、Plant Anatomy、パ
ート１、実験及び解釈、E.Arnold、編集、Addison Wesl
ey、ロンドン、６章）。花粉の発育は葯内部で生起し、
そして成熟時には各粒子は、葯壁（タペツム;tapetum）
の内層に起因する胞子体遺伝子発現と各粒子内部の生長
細胞からの一倍体遺伝子発現の両方の生成物を含有する
多細胞胞子である（J.P.Mascarenhas、1990年、Annu.Re
v.Plant Physiol.Plant Mol Biol.41:317;J.P.Mascaren
has、1989年、Plant Cell 1:657）。小胞子形成の過程
は組織学的に良好に記録されているが、分散後の花粉機
能に係わる分子的及び生化学的因子については殆ど知ら
れていない。
フラボノイドは低分子量（約300）の豊富なクラスの
植物に特異性のある代謝物であり、そしてこれらは共通
する15個の炭素骨格構造を共有している。基本構造を修
正して、種々の環の酸化状態及び置換パターンによって
分類される広範囲な化合物系列が得られる。幾つかのク
ラスは色素（例えば、アントシアニン、カルコン、そし
て特にフラボノール及びフラボン）であり、一方他のク
ラスは無色の紫外線吸収化合物である。アントシアニ
ン、特にペラルゴニン、シアニジン及びデルフィニジン
は赤、青及び紫の植物色素の原因となる。他の着色した
フラボノイド、カルコン並びに或るフラボノール及びフ
ラボンは黄色、アイボリー及びクリーム色に着色した花
に大いに寄与している。花粉フラボノイドは、これらフ
ラボノイドが花粉に独特の黄色を与えている幾つかの種
で同定されており、そして乾燥重量での大きい割合（２
〜５％）を占めることができる（R.Zerback、M.Bokel、
H.Geiger、D.Hess、1989年、Phytochemistry 28:897;R.
Wierinann及びK.Vieth、1983年、Protoplasma 118:23
0）。幾つかの植物種は花粉中に特有のタイプのフラボ
ノイドを有しているので、花粉粒がフラボノイドの生合
成及び／または蓄積のための特別の環境となるという証
拠がある（O.Ceska及びE.D.Styles、1984年、Phytochem
istry 23:1822）。
修正したフラボノイドで着色された植物が以前に文献
で報告されている。例えば、黄色の花粉ではなくて非機
能的な白色を生成するトウモロコシ突然変異体が以前に
単離され、そして特性化されている（Coe E.H.、McCorm
ick S.M.及びModena S.A.、1981年、「トウモロコシの
白色花粉」、J.Hered.72:318〜320）。白色の花粉突然
変異体は、トウモロコシの毛の上で発芽する通常の量の
非着色花粉を放出するが、殆どの授粉の後に種子は付い
ていない。この状態は、トウモロコシの２つのカルコン
シンターゼ（CHS）遺伝子、それぞれC2及びWhpで安定し
た劣性突然変異を発現することによって胞子体的に決定
される。最近、着色した同系交配のペチュニアストック
中へCHS変換遺伝子をアグロバクテリウムの介在で導入
すると内在性CHS遺伝子の発現が抑制され、全くフラボ
ノイドで着色していない花冠が生じると報告されている
（Napoli C.、Lemieux C.及びJorgensen R.、1990年、
「キメラカルコンシンターゼ遺伝子をペチュニアに導入
するとトランスの同種遺伝子の可逆的同時抑制が生じ
る」、Plant Cell ２:279〜289）。これらの植物ではCH
S変換遺伝子の発現も抑制されるので、同時抑制の用語
を使用してこの現象を記載した（Jorgensen R,、1990
年、「同種遺伝子間のトランス相互作用による植物にお
ける遺伝子発現の変化」、Trends Biotech ８:340〜34
4）。融合された変換遺伝子は内在性CHS遺伝子の非結合
優性インヒビターのように作用し、そして花弁だけでな
く生殖器官においても可視フラボノイド色素の産生が完
全に阻止される。
CHS遺伝子発現を阻止するとフラボノイド着色がない
だけでなく、稔性（fertility）でない植物も生じる（C
oe等、1981年;Taylor等、1992年、「カルコンシンター
ゼ欠失ペチュニアにおける条件雄稔性（Conditional Ma
le Fertility）」、J.Hered.83:11〜17）。CHS欠失植物
の稔性を復帰させ、そして更にはCHSより花粉の稔性と
密接に結合した酵素を制御することによって植物の稔性
を制御できるようにすることは非常に望ましいであろ
う。
発明の要約 フラバノン−３−ヒドロキシラーゼ（F3H）活性がフ
ラボノール欠失を生じさせる態様で損なわれている植物
は条件雄稔性（Conditionally male fertile;CMF）であ
り、そして植物の花粉が稔性回復フラボノールと接触し
得る状態を提供することによって雄稔性を復帰するかま
たは回復することができることが今や発見された。植物
のF3H産生を遮断することによって、例えば、植物が天
然に産生するF3Hを不活性化するかまたはフラボノール
生合成経路でのカルコンシンターゼ（Chalcone synthas
e;CHS）のようなプリカーサー酵素の活性を損なわせる
ことによって、F3H活性を直接または間接的に損なわせ
ることができる。
生育可能な花粉はF3H欠失植物によって産生される
が、花粉発芽及び管生長はインビボ及びインビトロの両
方で非常に減少し、自己不妊の植物が生じる。しかし乍
ら、植物の花粉が稔性回復フラボノールと接触し得る状
態を提供することによって、植物の花粉発芽及び管生長
能力を完全に回復することができる。適切な稔性回復状
態には、例えば、F3H損傷状態の除去、植物におけるF3H
産生の回復等によることを含めて、植物の花粉が必要な
フラボノールを利用できるようにされている任意の状態
がある。或いは、植物の花粉を、花粉の発芽及び／また
は管生長を高めるのに効果的な或る量の稔性回復フラボ
ノールと接触させることによって植物稔性を復帰するか
または回復することができる。有用な稔性回復フラボノ
ールには式： （式中、R1、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は水素、ヒドロ
キシルまたは１から３個の炭素原子を有するアルコキシ
である）の化合物が含まれる。特に好ましいフラボノー
ルにはガランギン（galangin）、ケンフェロール（kaem
pferol）、イソラムネチン（iso−rhamnetin）、クエル
セチン（quercetin）及びモリン（morin）が含まれる。
図面の簡単な説明 本願発明の上記特徴及び付随する利点の多くは、添付
の図面と一緒にするとき、以下の詳細な説明を参照する
ことによってより良く理解できるようになると、一層容
易に評価されるであろう。図面において、 図１は、カルコンシンターゼ（CHS）異形接合体植物
中の小胞子発育に与える胞子体の影響（斜線）の略式図
である。胞子体中でのCHS機能の欠如は白い背景（図1
A）で示し、そしてCHS機能の存在は黒い背景（図1B）で
示す。
図2A及び2Bは、同系交配ペチュニア株V26（図2A）及
びCHS欠失植物02425.1（図2B）から得られたインビトロ
発芽花粉を写真で示したものであり、その際新たに裂開
した葯から得られた花粉を液体培地に懸濁し、そして室
温で６時間生長させた後に写真撮影した。図2A中の棒印
は25μｍを表わす。図2Bの矢印は発芽しようとしている
花粉管を示す。
図３は、同系交配ペチュニア株V26（左欄；図3A、3
C、3E及び3G）及びCHS欠失植物02425.1（右欄；図3B、3
D、3F及び3H）から得られた発育的に同一の葯の断面を
写真で示したものであり、これらは実施例３に記載した
ようにして採集し、固定し、埋め込み、横に切断しそし
てトルイジンブルーで染色した。図3A及び3Bは、変換遺
伝子葯が丸々としていて白色である裂開48時間前の葯の
断面を示す。図3E及び3Fは、図3C及び3Dで示した倍率で
の図3A及び3Bの葯の断面を示す。図3Fの棒印は50μｍを
表わす。図3G及び3Hは裂開時の成熟花粉を示す。図３に
おいて、Ｐは花粉;Eは内被;Sは小孔；そしてＣは外被を
表わす。
図４は、稔性回復フラボノール、ケンフェロールによ
るペチュニアのCHSが欠失した花粉の花粉発芽回復及び
管生長を示す写真である。花粉は条件雄稔性葯から採集
し、発芽培地に懸濁し、そしてケンフェロール（Ｋ＋、
図4C）またはDMSO（Ｋ−、図4B）を採集濃度が１μＭに
なるように添加した。インキュベーション４時間後の代
表的な花粉領域を図示する。ケンフェロールで復帰した
CMF花粉で観察された発芽及び管生長（図4C）はDMSOだ
けを与えた野生タイプのV26対照（Ｃ、図4A）と区別で
きない。補充されなかったCMF花粉（図4B）は幾つかの
粒子で発芽孔の膨潤を示しているが花粉管は出ていな
い。
図５は、野生タイプV26の柱頭（図5A）及びCMFの柱頭
（図5B）のメタノール抽出物のHPLCプロフィールであ
る。150個の柱頭から調製しそして逆相C18カラムでメタ
ノール−水傾斜で分画した100μｌ分別物の360nmでの吸
収。図5Aの挿入図は33.17分のピークのUV/可視スペクト
ルであり、そしてこれは標準品ケンフェロール標準で得
られたものと同一である。酸加水分解したV26柱頭抽出
物のHPLCプロフィール及びUV/可視スペクトルは、保持
時間、7.43,10.10,13.46及び16.65の主ピークがケンフ
ェロール及びクエルセチンのグリコシドであることを示
している。
図６は、花粉発芽頻度をフラボノール アグリコン濃
度上昇の関数としての示すグラフであり、その際ケンフ
ェロール（白丸）、モリン（黒丸）、ミリセチン（白三
角）及び３−ヒドロキシフラボン（黒三角）は示された
最終濃度で発芽培地（GM）に添加し、そして発芽はイン
キュベーションの４時間後に評価した。３つの別々の実
験で測定された平均発芽頻度は、平均値の標準誤差（SE
M）と共にプロットする。＜1.4のSEM値は目で見ること
はできない。野生タイプの対照V26の花粉の発芽頻度は
典型的には75％であり、そして復帰していないDMSO処理
CMF花粉は１〜２％の間の授粉をもたらす。
好ましい実施態様の詳細な説明 本願発明の１つの特徴に従って、フラボノイドが欠失
した条件雄稔性（CMF）植物における植物稔性は、植物
の花粉が稔性回復フラボノールと接触し得る状態を与え
ることによって回復される。例示的な実施態様では、植
物の花粉の発芽及び管生長を高めるのに有効な量の稔性
回復フラボノールと植物の花粉を接触させることによっ
て適切な状態を得ることができる。本願明細書で使用す
るとき、フラボノイドが欠失した条件雄稔性またはCMF
植物の用語は、カルコンシンターゼ（CHS）またはフラ
バノン−３−ヒドロキシラーゼ（F3H）活性が天然にか
または突然変異的にかのいずれかで損なわれて植物中の
フラボノイドの天然の産生が崩壊している植物を含める
ように意図されている。従って、フラボノイドが欠失し
た条件雄稔性植物は典型的には、白色または薄い着色を
もたらす色素欠失であり、そして典型的には自己不妊で
ある。本発明はCMFペチュニア及びトウモロコシと関連
させて以下で詳細に記載するが、他のCMF植物も同様に
本発明の実施で使用することができる。
本願発明の他の特徴に従って、フラバノン−３−ヒド
ロキシラーゼ（F3H）の活性を遮断することによって植
物稔性を制御して、通常は自己不妊であるCMF植物を作
ることができるが、該植物の稔性は植物の花粉を稔性回
復フラボノールと本願明細書に記載したようにして接触
させて復帰するかまたは回復することができる。天然の
フラボノール生合成経路において、カルコンシンターゼ
（CHS）は３分子のマロニル−CoAと１分子のｐ−クマロ
イルを縮合させてカルコノナリンゲニンを形成させ、そ
してこれは自然に（低速度で）そしてカルコン−フラバ
ノンイソメラーゼ（CHI）の作用によってマリンゲニン
に変換される。経路の次の段階で、F3HはＣ環の３位炭
素へのヒドロキシル基添加を触媒して、本願発明による
稔性回復活性に必要なフラボノールを産生する。一般的
な経路は次のように表わすことができる： F3Hはフラボノールの産生における速度限定酵素であ
り、そしてこれまでにアンチリナム マジャス（Antirr
hinum majus）からクローン化されている（Martin,C.、
Prescott,A.、Mackay,S.、Bartlett,J.及びVrijlandt,
E.、1991年、「アンチリナム マジャスの花における生
合成制御」、The Plant J.１:37〜39）。フラボノール
アグリコン化合物は、本願明細書に記載したように、雄
性稔性に必要であるので、F3Hヒドロキシル活性性を効
果的に遮断する任意の手段を本発明の実施で使用するこ
とができる。それ故、例えば、生合成経路でプリカーサ
ーの産生を遮断することによってF3H基質を除くことが
でき、または遺伝子発現を妨げることによってF3H、CHI
若しくはCHSの発現を遮断することができる。もう１つ
の例示的な実施態様では、植物内でF3H若しくはプリカ
ーサー酵素、例えばCHIをコードするかまたはそれらの
発現に必要なmRNAとハイブリッド形成する植物中にアン
チセンスRNAを発現させることによって、フラボノール
産生が遮断されている植物を作ることができる。例え
ば、タペタル（tapetal）細胞に特異的なプロモーター
をアンチセンス配向のF3H遺伝子と融合させることがで
き、そしてこの融合構築物を、既知の技術、例えばアグ
ロバクテリウム介在性形質転換、粒子ガン（gun）衝
撃、直接的DNA導入技術等を使用して、植物細胞、例え
ばタバコ、ペチュニア、トマトまたは他の植物細胞中に
導入することができる（例えば、Napoli,C.、Lemieux,
C.及びJorgensen,R.、1990年、「キメラカルコンシンタ
ーゼ遺伝子をペチュニアに導入するとトランスの同種遺
伝子の可逆的な同時抑制が生じる」、Plant Cell ２:27
9〜289;Mariani,C.、De Beuckleer,M.、Truetner,J.、L
eemans,J.及びGoldberg,R.B.、1990年、「キメラリボヌ
クレアーゼ遺伝子により植物における雄性不妊の導
入」、Nature 347:737〜741;及びOeller,P.W.、Min−Wo
ng,L.、Taylor,L.P.、Pike,D.A.及びTheologis,A.、
「アンチセンスRNAによるトマトフルーツ老齢化の可逆
的阻止」、Science 254:437〜439、参照）。タペツム
（tapetum）プロモーターは、示差cDNAクローニング（G
oldberg,R.B.、1988年、「植物：新しい開発法」、Scie
nce 240:1460〜1467）によってかまたは、以前に発表さ
れたタペツム特異性プロモーターと同種のゲノム配列の
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）増幅（Saiki,R.K.、1990
年、PCRプロトコールにおける「ゲノムDNAの増幅」、M.
A.Innin、Felfand,D.H.、Sninsky,J.J.及びWhite,T.
J.、編集、Academic Press、San Diego、13〜20頁、参
照）で産生されたハイブリッド形成プローブを使用して
単離することができる。或いは、F3H遺伝子は、発表さ
れたアンチリナムF3H配列に基づくPCRオリゴヌクレオチ
ドプライマー（Saiki,R.K.、1990年、上述、参照）を使
用してハイブリッド形成プローブを産生させることによ
って単離することができる。更なる変法として、植物内
でF3H、CHIまたはCHSをコードする遺伝子を変化させる
か、変異させるか、除去するか、遮断するか、またはそ
うでない場合損なわせて、植物のF3H酵素の発現を妨げ
ることができる。例えば、植物内でF3Hをコードする遺
伝子を植物の核ゲノムから欠失させ、そして1992年１月
８日に発行されたヨーロッパ特許出願EP 0465024に記載
された誘発可能なプロモーターと操作して結合されたF3
H遺伝子で置き換えて、外部的に誘発された遺伝子発現
によってフラボノール産生の遮断解除の制御及び植物稔
性の復帰を可能にすることができる。インビボでF3Hの
合成を遮断することに加えて、F3Hと直接相互作用する
部分を用いてF3H活性を遮断してそのヒドロキシラーゼ
活性を不活性化するかまたは損なわせ得ることも明白で
あろう。更に、フラボノールの産生はCHI活性の遮断に
よって損なわせることができるが、この変法は、CHIが
存在しないと自然ではカルコノナリンゲニンからナリン
ゲニンへの変換が低い速度で進行するので、あまり好ま
しくない。
CHS、CHIまたはF3H活性の欠失の結果フラボノールを
欠いている植物での雄性機能が損なわれても、葯形態学
が正常な色、形状及び大きさから逸脱する裂開直前まで
花粉発育における目に見える異常は生じない。裂開時
に、花粉は葯内部で凝集塊のままであり、そして顕微鏡
で見るとき、花粉袋内のかなりの割合の粒子は正常なも
のより縮んで見える。生存可能な花粉が産生されそして
放出されるが、花粉の発芽及び管生長はインビボ及びイ
ンビトロの両方で非常に損なわれる。機能的な雄性不妊
に加えて、フラボノール欠失植物は、花粉が、フラボノ
ール欠失植物の柱頭によってではなくて、野生タイプの
植物の柱頭によって部分的に復帰され得るという事実に
よって明らかなように、自己不適合性の幾つかの特徴を
示している。雄性不妊及び自己不適合性の両方の要素は
明白であるが、フラボノール欠失植物から得られる花粉
によって示される特徴は明らかに、本願明細書で条件雄
稔性（CME）と称する特有の状態を構成する。
CHSを欠く（そしてそれ故、フラボノイドを欠く）植
物は２つの特徴：（１）フラボノイド着色のないこと及
び（２）機能するためには野生のめしべ（柱頭＋花柱）
に完全に依存する損傷花粉の産生を除いて正常のように
見える。
CHS欠失植物はフラボノイド着色の欠失と花粉機能の
損傷を共有しているが、植物種間で幾つかの相違が明ら
かである。トウモロコシの白色花粉はトウモロコシの毛
上で発芽し、そして花粉管を作るがその生長は花柱内で
阻止される。更に、トウモロコシの突然変異体花粉はイ
ンビトロで発芽し、そして野生タイプの花粉とほぼ同じ
長さの管を作る（L.P.Taylor、未発表所見）。対照的
に、フラボノイド欠失ペチュニアから得られる花粉は柱
頭に浸透しないしまたインビボまたはインビトロのいず
れでも管を作らない。トウモロコシとペチュニア間のこ
の差異は、三細胞（トウモロコシ）と二細胞（ペチュニ
ア）の花粉間の生理学的差異に関連して説明することが
できる。二細胞花粉は、放出時に呼吸数が低く、放出後
に第２の精子細胞を形成し、数時間柱頭にいて初めて発
芽することができ、そして初期花粉管生長速度が低い。
三細胞花粉は、比較すると、開花（雄しべの成熟）前に
第２の有糸分裂を受け；放出時に呼吸数が高く、柱頭表
面と接触した後数分以内に発芽し、そして初期生長速度
が高い。三細胞花粉は放出後急速に生長する用意ができ
ているので、トウモロコシの花粉管は、管の生長を阻止
する何らかのメカニズムが有効となる前にかなりの長さ
まで生長する。
世代交代のある開花植物では、二倍体の胞子体は一倍
体胞子を産生し、そしてこれが生長しそして有糸分裂し
て配偶体を作る。配偶体の寿命サイクルの１部は、生長
している花粉胞子が周囲の胞子体組織と密に接触してい
る間に生じる。この配列は二倍体−一倍体の相互作用の
可能性を有している。異種接合体植物では、この相互作
用はまた、図１に示した２つのタイプの配偶体間の一倍
体−一倍体の連絡も含むであろう。本願明細書に記載し
たペチュニアのフラボノイド欠失雄の不妊性が遺伝子的
に優性であり、一方トウモロコシの白色花粉の雄性不妊
性が遺伝子的に劣性であるという事実によって、配偶体
または胞子体が上記効果に寄与するかどうかに関して興
味深い結論が導かれる。トウモロコシでは、雄性不妊は
CHS遺伝子、c2及びWhpの両方について劣性の同種接合体
植物だけに発現する。C2またはWhpのどちらか１つの機
能コピーを有する異種接合体は100％黄色の稔性花粉粒
を産生する（Coe等、1981年）。かくして、異種接合体
では、CHS陽性の胞子体かまたは50％CHS陽性の配偶体の
どちらかがCHS陰性配偶体の稔性発現に影響を与える。
遺伝子変換ペチュニアでは、雄性不妊は優性形質と関係
があり、そして異種接合体植物によって産生される花粉
は100％雄性不妊である。この場合には、不妊はCHSで抑
制された配偶体によるCHS陽性配偶体の阻止かまたは遺
伝子変換胞子体でのCHS欠失のいずれかによって生じる
（図１）。雄性不妊を生じさせるCHS欠失の生理学的根
拠はトウモロコシとペチュニアで同一であり、そしてこ
れら種の両方で、不妊の表現型を生じさせるのは配偶体
ではなくて胞子体であるように思われる。かくして、ト
ウモロコシとペチュニアでのCHS欠失に関連した条件雄
稔性は共通した生理学的根拠を有している。
フラボノール欠失植物から条件不妊花粉が産生するこ
とはインビトロでの花粉復帰アッセイの根拠として使用
することができる。精製フラボノイドまたは植物抽出物
を補充した発芽溶液中で遺伝子変換花粉をインキュベー
トしそして発芽頻度及び花粉管生長の高まりについてア
ッセイすることによって、花粉機能に必要な特定の化合
物を同定することができる。この方法で、フラボノイド
化合物の広範囲のファミリーが、一般的には、CMF植物
の稔性回復において一様に有効なのではなくて、むしろ
稔性回復フラボノールアグリコンの特定の群がこの目的
に有効であることが決定された。
CMF植物の花粉の発芽を促進するのに有効な任意のフ
ラボノールを本発明の実施で使用することができる。し
かし乍ら、フラボノイドの比較的大きいファミリーのう
ちの大部分のメンバーはこの目的に無効であることが見
い出されている。従って、特に有効な稔性回復フラボノ
ールを同定し、そしてCMF自己不妊状態の植物の稔性回
復で使用できることが本願発明の主要な特徴である。本
発明の好ましい実施態様では、稔性回復フラボノールは
式： （式中、R1、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は水素、ヒドロ
キシルまたは１から３個の炭素原子を有するアルコキシ
である）の化合物である。更に好ましくは、R1〜R5のう
ち２つ以下がヒドロキシルまたはメトキシであり、そし
て残りのR1〜R5は水素であり、そしてR7及びR8は水素、
ヒドロキシルまたはメトキシである。本発明の現在特に
好ましくそして代表的な稔性回復フラボノール化合物に
は、ガランギン、ケンフェロール、イソラムネチン、ク
エルセチン及びモリンが含まれ、そしてこれらは以下の
置換基を有し上記の一般的な化学構造を有している： 本発明の実施に有用な他のフラボノールは、本願明細
書に記載したインビトロでの花粉復帰アッセイ法を使用
して容易に決定することができる。
上記のことは、以下の実施例と関連させてより良く理
解することができるが、これら実施例は説明のために示
すものであって限定するものではない。
実施例１ カルコンシンターゼ欠失ペチュニアの稔性 遺伝子変換及び同系交配V26ペチュニアは、300〜600
μmolm-2秒-1の強さのハロゲン化金属光を加えたガラス
ハウスで16/8時間の光周期で維持した。同系交配V26
は、花粉、葯及び花糸、並びにめしべ（柱頭及び花柱）
を含む大部分の植物組織中でフラボノイドを産生するこ
とができそして完全に自己適合性であるペチュニア ハ
イブリッドの着色株である。分析した遺伝子変換材料は
２つの独立した形質転換再産生体、218.38及び218.41
（Napoli C.、Lemieux C.及びJorgensen R.、1990年、
「ペチュニア中にキメラカルコンシンターゼ遺伝子を導
入するとトランスの同種遺伝子の可逆的な同時抑制が生
じる」、Plant Cell ２:279〜289）、並びに第２の戻し
交配世代（BC2）から親のV26までの個々の株からなる
（2425から2435までの集団番号）。これらの形質転換体
におけるＴ−DNA挿入には、配列選択可能なマーカーと
してネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子に
結合したウイルスプロモーターに融合したCHS cDNAが含
まれる（Napoli等、1990年）。花粉を適用する24時間前
に花の雄性機能を除去して交配を実施する。交配に使用
した遺伝子変換花は全て目に見える色素の徴候を示さな
かった。花粉ドナーは、２から３個の裂開葯を有する植
物から選択するかまたは上記の丸々とした裂開前の葯か
ら切断した。
遺伝子変換ペチュニア植物、218.38及び218.41は、CH
S遺伝子のコピーを更に導入した後に純白の花が産生し
た。CHS発現を遺伝子変換花弁で試験したとき、形質転
換していないV26の親や復帰細胞と比べてmRNAでは50倍
の導入が内在性及び導入CHS遺伝子の両方で検出され
た。V26同系交配株は葉、幹、小花柄、花柱及び葯花糸
では紫色のアントシアニン色素を、そして発育中の葯で
は黄色カルコンを産生する。比較して、形質転換した植
物はこれらの組織のいずれでも識別できるフラボノイド
色素を有していない。可視色素が無いことは、実施例６
に記載したとおり、メタノール抽出物のHPLC分析で確認
された。通常、放出直前に、天然の花粉で満たされたペ
チュニア葯は乾燥する。裂開時に、葯の鞘が小孔に沿っ
て縦方向に裂けるとき、葯裂片の両端で組織の脱水状態
が生じ、お互いに反り返って花粉粒を露出する。着色し
ていない遺伝子変換植物を綿密に調べると、裂開48時間
前に葯は長さが約40％縮みそして色がクリーム白色から
黄褐色に変化したことが明らかになった。比較して、非
遺伝子変換親株V26の葯は約15％だけ縮みそして色の変
化を受けず、この期間中黄色のままであった。裂開葯の
頻度の広範な変動が０から100％までの範囲で生起し、
より高い頻度は低い相対湿度に関連があった。裂開はV2
6親に比べて僅かに遅延することがあるが、フラボノイ
ド欠失葯は開いて通常量の花粉を露出する。この花粉は
V26花粉と同様に軽く且つ砕けやすいとは思われずそし
て葯の鞘内部で凝集したままである。
（ｉ）縮んで黄褐色の裂開葯から得られた花粉、また
は（ii）白色の丸々とした裂開前の葯から得られた花粉
を使用する218.41のフラボノイド欠失子孫の自己授粉の
多数の試みからは種子は生じなかった（表２、５欄、
「遺伝子変換自己交配：種子０個／鞘」）。V26親株の
自己交配は１鞘当たり平均して225個の種子を産生し
た。これは、試みた75回の遺伝子変換ペチュニア自己交
配では約17,000個の種子と解釈される。表２に示した植
物は全て、同系交配株V26から得られた花粉で柱頭を授
粉することによる雄稔性について試験した。全ての場合
に、鞘は種子の正常な補足遺伝子を有して産生され、CH
S欠失植物が雄稔性であることを示していた。相互的交
配、即ちV26の柱頭に遺伝子変換フラボノイド欠失花粉
を相互的に交配させると、表２に示された種々の量の種
子が産生した。
雄性の親として10種の遺伝子変換植物に係わる37の交
配のうち11は鞘を作らず、20は鞘当たり150個以下の種
子を有する鞘を作り、そして６は鞘当たり150個より多
い種子を有する鞘を作った。これは平均して１鞘当たり
約60個の種子、または種子セットで70％の減少となる。
これらの結果は、フラボノイド欠失植物から得られる花
粉はフラボノイド欠失柱頭に対して非機能的であるが、
野生タイプの柱頭に対しては部分的に機能的であること
を示しており、この状態を本発明者は本願明細書で条件
雄稔性（conditional male fertility;CMF）と称した。
これらの異系交配における授粉当たりの種子セット数の
広範な変動は多分環境的及び／または進化的要素による
ものであろう。
２つの独立した形質転換体、218.38及び218.41は共に
同じ特徴：フラボノイド着色の完全な欠如及び同一の優
性雄不妊表現タイプを示すので、CMFは雄稔性に必要な
遺伝子にＴ−DNAを挿入したことによるものではないよ
うに思われる。この結論に対する更なる証拠は、形質転
換した再産生体はときには体細胞的に完全に着色した植
物に戻るが、変換遺伝子は保有しており、そして変換遺
伝子が存在しているだけでは内在性CHS発現を抑制しな
いというナポリ（Napoli）等（1990年）の観察から得ら
れる。これらの体細胞復帰体に関する観察及び交配は、
それらが完全に雄稔性であることを示している。トウモ
ロコシの白色花粉との類似性を所与のものとすると、ペ
チュニアのCMFは、例えばCHSまたはF3H遺伝子発現の抑
制によって引き起こされるフラボノイドの欠失によって
生起するように思われる。
実施例２ 花粉の発芽及び管の生長 インビトロでの発芽は、マルカイ（Mulcahy）GB及び
マルカイDL、1988年、「二核及び三核花粉のインビトロ
繁殖に与える補充培地の影響」、Plant Science 55:213
〜216に記載された単純ブリューバーカーズ（Brewbaker
s）（培地（以下ではときに「発芽培地」または「GM」
と称する）中で新たに集めた花粉で実施した。１個の葯
から得られた花粉を50μｌの培地を有する微量滴定ウェ
ルに入れ、室温で６から８時間振とうし、そしてコダッ
クのテクニカルパンフィルムで撮影した。
インビボでの花粉管生長は、ヘレロ（Herrero）M.及
びディッキンソン（Dickinson）H.G.、1979年、「ペチ
ュニア ハイブリッドにおける花粉−めしべの不適合
性：適合及び不適合の種内交配後のめしべにおける変
化」、J.Cell Sci.36:1〜18に記載されたようにして授
粉48時間後に測定した。カルスプラグは355〜325nm（Ｄ
キューブ）で励起しそしてライツ アリストプラン（Le
itz Aristoplan）からの波長460nmを抑制した発生させ
たエピフルオレセンスによって視覚化した。標本はエク
タクローム（Ektachrome）T160フィルムで撮影し、そし
てプリントは中間ネガから作成した。
花粉の生存可能性は、新たに裂開した花粉を発芽培地
中カルボキシフルオレセインアセテート（1mM）の溶液
中でインキュベートすることによって、蛍光着色法（FC
R）（Heslop−Harrison J.及びHeslop−Harrison Y.、1
970年、「酵素的に誘発された蛍光による花粉生存可能
性の評価；フルオレセインジアセテートの細胞内加水分
解」、Stain Technol.45:115〜120）で決定した。エピ
フルオレセンスは上記したようにして視覚化した。
カロース（Callose）産生 ペチュニアの花粉管は通常発芽の約１時間後に柱頭に
侵入し（Herrero及びDickinson、1980年）、そして柱頭
組織から下方に生長して２つの精子細胞を胚嚢中に沈着
させる。カロースはβ（1K3）グリコシド連鎖で結合し
た多糖ポリマーであり、そしてこの物質のプラグは通
常、生長している花粉管に沿って下方に規則的な間隔で
沈着する。カロースは、脱色したアニリンブルーで染色
した後特有の蛍光で視覚化する（Currier 1957年;Eschr
ich及びCurrier 1964年）。実施例１のCHS欠失花の自己
交配及び同じ植物とV26花粉との戻し交配における発芽
及び花粉管生長を試験した。めしべは、授粉48時間後に
収穫し、脱色したアニリンブルーで染色し、そして蛍光
顕微鏡で検査した。カロース沈着物の規則的なパターン
は、V26で授粉されたフラボノイド欠失めしべのスカッ
シュの柱頭の下方にずっと観察された。他方、たとえ多
量の花粉が柱頭に存在したとしても、自己授粉ペチュニ
アのめしべにはカロースは全く見られなかった。
花粉の形態学及び発芽 実施例１のフラボノイド欠失植物から得られ新たに放
出された花粉の顕微鏡検査を行い、そして肉眼的異境は
何も明らかにならなかった。ペチュニア花粉は単純液体
培地でインキュベートするとき容易に発芽し、そして管
を生成する。BC2ファミリー（2425から2435）のそれぞ
れからV26花粉までの発芽花粉をインビトロで比較し
た。典型的な代表例を図２に示す。図２に示されるよう
に、生長６時間後に多数の突然変異花粉粒は発芽孔（矢
印、図２）の１つの周囲の顕著な膨潤で認められるよう
に発芽しようとしていたが、フラボノイド欠失植物から
得られる花粉粒はせいぜい２％しか何らかの長さの管を
生成しなかった。測定可能な管を生成した花粉粒に関し
ては、長さは同一の条件下で生長したV26花粉管の長さ
の20％未満であった。
フラボノイド欠失植物が生成しそして放出した花粉が
生存可能であるかどうか、そしてそれ故発芽及び花粉管
生長が可能であるかどうかを決定するために、新たに放
出した遺伝子変換及びV26花粉の生存可能性についての
蛍光着色分析（FCR）を実施した。この試験は、フルオ
レセインジアセテート化合物の花粉粒中への取り込み、
そしてその後の細胞内酵素によるフルオレセインへの変
換に依存している。フルオレセインは極性が高くそして
殆どが植物細胞の細胞質中で隔離されたままであり、そ
こでフルオレセインは蛍光顕微鏡で視覚化される。同系
交配V26花粉は、内部特徴を全く欠いている高率（40％
まで）で異常に小さいFCR陰性粒子からなっている。こ
のタイプの幾つかの粒子は、写真の中心の２つを含めて
図2Aで見ることができる。この集団は決して発芽せず、
そして殆どが発育不全の粒子である。残りの粒子（60
％）のうち、殆ど全ては陽性のFCR試験を示し、無傷の
血漿膜及び活性の細胞質エステラーゼの存在を示唆して
いた。突然変異葯から得られる花粉は高率の縮んだ発育
不全の粒子を保有していた。残りの正常に見える粒子の
うち、90％以上がFCR陽性であった。フラボノイド欠失
植物により産生された花粉の大部分が生存可能でありそ
して代謝的に活性であったという事実は、正常な花粉発
芽及び管生長にはCHS活性の幾つかの特徴が必要である
ことを示している。
実施例３ 葯発育の顕微鏡観察 小胞体形成中のCHS活性の欠如が発育中の花粉粒また
は葯組織の細胞構造を変化させるかどうかを決定するた
めに、V26とCHS欠失植物O2425.1を比較した。0.1から6c
mまでの長さの範囲のペチュニアの蕾の一連の発育段階
から得られた葯を収穫し、スパース（Spurrs）樹脂に埋
め込んだピペス（Pipes）中２％のパラホルムアルデヒ
ド、1.25％のグルテルアルデヒド、pH7.2中で固定し、
そして１μｍの断面をトルイジンブルーで染色した。顕
微鏡写真はコダックのテクニカルパンフィルムを用いて
撮影した。組織学的にはこれは、原生胞子組織分化の最
初の徴候から成熟花粉で満たされた裂開前の葯までの小
胞体形成の全ての段階を表わしている。タペツムの発育
及びその後の崩壊は、この組織が花粉フラボノイドの供
給源であると考えられているので、厳密に注目した。全
ての段階で、遺伝子変換葯及び発育中の小胞体は、V26
と比較したとき肉眼による組織学的差異を全く示さなか
った。更なる断片は、丸々として白色から縮んだ黄褐色
に移る間のフラボノイド欠失葯からとり、そしてV26の
同様な段階と比較した（図３）。裂開に先立って、内皮
組織層の細胞は通常放射状に拡張し、濃厚化し、そして
葯裂開のメカニズムに係わっていると思われる物質を沈
着する（Cutter,E.G.、1978年、「植物解剖学：実験及
び解釈。パート１」、Cells and Tissues、第２版、ロ
ンドン：アーノルド）。この層は連続しておらず、小孔
周囲の領域には無い。縮んだ黄褐色の葯の断面は内皮
層、小孔または葯周囲の外被に対して肉眼的な異常は全
く示さなかった。しかし乍ら、V26花粉（図３、「V26」
の欄）と比較したとき、内部特徴を有していない高率の
縮んだ粒子が遺伝子変換植物の小房に存在しており、そ
してより大きい粒子は大きさ、形状及び染色反応がより
不均一であるように思われた（図3C及び図3D）。図3C及
び図3Dに示された不均一性は、花粉が通常非常に脱水さ
れた状態で放出され、そして柱頭で急速な再水和化を受
けるという事実によって説明することができる。フラボ
ノイド欠失花粉は通常よりはるかに脱水された状態で放
出され、そして液体発芽培地に入れると再度水和化して
通常の外観になるように思われる。
実施例４ ペチュニアフラボノイド抽出物 ペチュニア花粉抽出物の分析によって主要なフラボノ
イドはクエルセチン及びケンフェロールの３−Ｏ−グリ
コシド、4,2′,4′６′−テトラヒドロキシカルコン並
びにジヒドロフラボノール、タキシフォリンとして同定
されている（Zerback,R.、Bokel,M.、Geiger,H.及びHes
s,D.、1989年、Phytochemistry 28:897〜899;Zerback,
R.、Dressler,K.及びHess,D.、1989年、Plant Science
62:83〜91;De Vlaming,P.及びKoh,K.F.F.、1976年、Phy
tochemistry 15:348〜349）。トウモロコシの花粉はケ
ンフェロール、クエルセチン、及びイソラムネチンの少
なくとも10種のグリコシドを含有している（Ceska,O.及
びStyles,E.D.、Phytochemistry 23:1822〜1823）。野
生タイプ及び同系交配ペチュニア株V26の両者の水性抽
出物は、PEG4000培地（W.Jahnen、W.M.Lush、A.E.Clark
e、1989年、Plant Cell １:501）（以下、GMと称する）
中で柱頭をピンセットを用いて細分するか、または花粉
懸濁物を撹拌し、微量遠心機で５分間遠心し、そしてこ
の上清液の分別物を96ウェルの微量滴定プレートのGM中
のCMF花粉懸濁物に直接適用することによって作成し
た。メタノール抽出物は、花粉懸濁物に添加する前に抽
出物を真空下で乾燥しそしてGM中に再懸濁した以外は同
じプロトコールに従って作成した。初期復帰実験は、10
個のV26柱頭から調製した水性抽出物20μｌ（総容量の
５分の１）を使用して33％の発芽率を引き出した。対照
として、CMF植物の柱頭及び花粉からの抽出物は同様に
して調製した。花粉発芽アッセイでは、V26の柱頭及び
花粉から得た抽出物だけがフラボノイド欠失花粉に対し
て発芽及び管生長を回復することができた。野生タイプ
及びCMFの花粉及び柱頭の抽出物は次のようにして分析
した。柱頭または花粉を先ず50％メタノール、続いて10
0％メタノールで抽出し、そして抽出物を集めて濃縮し
た。酸加水分解によってアグリコンが生成された；抽出
物を4N HClとv/vで混合し、2mlアンプル中に密封し、
そして沸騰水中で40分間加水分解した。複製試料を逆相
C18カラム（Phenomenex Spherisorb 5 ODS 2 250×4.6m
m）中に注入した。溶媒Ａは５％酢酸であり溶媒Ｂは80
％のアセトニトリル中５％の酢酸からなっていた。各実
施は６分間の等傾斜（20％のＢ）、続いて95％のＢまで
の20分間の直線的傾斜からなっており、そして95％のＢ
の等傾斜14分間で終了した。溶媒の流速度は室温で0.5m
l/分であった。ヒューレット パッカード（Hewlett Pa
ckard）モデル1040A フォトダイオード アレイ検出器
を用いて360nmで検出した。ケンフェロールは60ngの柱
頭の野生タイプの柱頭抽出物で検出され、そしてクエル
セチンは実質的により低い値で検出された。150個のCMF
柱頭のプールまたは500個のCMF葯から得た同一の抽出物
は典型的なフラボノイドスペクトルを示すピークを生じ
させなかった。
タンパク質消化酵素、熱及び分子篩膜通過を用いて野
生タイプの柱頭抽出物を処理すると、活性化合物は小さ
い非タンパク質分子であることが示された。活性化合物
の分子量は、抽出物を3000ダルトンの分子量のカットオ
フフィルター（Centricon−39フィルター、アミコン）
を通過させそして花粉復帰活性が該フィルターを通過す
ることを確認して見積もった。V26柱頭及び花粉の水性
抽出物は100μｌの反応容量中0.025単位のパパインを用
いて37℃で30分間処理した。酵素活性はBSA（0.5mg/m
l）を同じ条件下で処理しそして消化生成物をSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で検査して証明し
た。プロテアーゼまたは熱処理（100℃、５分）のどち
らも抽出物のCMF花粉発芽及び管生長復帰能力を消失さ
せなかった。
集合すると、これらの結果は、野生タイプの花粉に存
在するフラボノイドが花粉発芽で役割を果たしそして野
生タイプの柱頭がCMF花粉中のフラボノイド欠如を埋め
合わせることができる同様な化合物を含有していること
を示している。
実施例５ フラボノールによるCMF稔性の復帰 実施例１のフラボノイド欠失花粉の生化学的補足は低
濃度（１μＭ）のケンフェロール、フラボノールアグリ
コンをCMF花粉の発芽培地（GM）中懸濁物に添加して達
成された。図４に示されるように、12時間の生長期間を
通してなされた密接な比較によって、発芽が同時に開始
しそして復帰されたCMF花粉（Ｋ＋）において管生長
は、フラボノール補充を受けていない野生タイプのV26
花粉（Ｃ）と比較して同じ速度で且つ同じ程度に進行す
ることが確認された。復帰はほぼ完全であった；フラボ
ノイドを補充された花粉はV26花粉に比較して80％の発
芽頻度を示した。DMSO溶媒しか添加しなかったCMF花粉
（Ｋ−）は殆ど発芽を示さず（１〜２％）そして花粉管
は、それらが発芽するとしても、決して２以上の花粉粒
直径を前進させることはなかった。
花粉発芽及び管生長を復帰させ得る野生タイプの柱頭
抽出物がケンフェロールを含有することを確認するため
に、加水分解されていない抽出物をHPLCで分画しそして
UV/可視吸収分光学で分析した。或る保持時間及び典型
的なフラボノールスペクトル（260及び360nm周辺での最
大吸収）を有するピークがV26柱頭抽出物で検出された
（図5A及び挿入図）。この推定上のケンフェロールピー
クを集め、留去して乾燥し、DMSOに再度懸濁し、そして
十分な発芽及び管生長応答をCMF花粉から引き出すイン
ビトロGM培地に加えた。この活性フラクションと標準品
ケンフェロール標準との再クロマトグラフィーでその純
粋性及び同一性が確認された。150個の柱頭の分析か
ら、V26柱頭中のケンフェロールの量は60ng/柱頭である
と計算される。柱頭を34μｌ（容量換算）と仮定して、
V26柱頭中のフラボノール濃度は約６μＭであり、この
値は強力な発芽応答を引き出すことができる。150個のC
MF柱頭または500個のCMF葯のプールからの抽出物に対す
る同じ分析では、典型的なフラボノイドスペクトルを示
すピークは生じなかった（図5B）。V26花粉及び葯から
の抽出物は図5Aで示されるクロマトグラムと同様なクロ
マトグラム及び、GM中のCMFに添加したとき花粉の発芽
を十分に刺激したケンフェロールを示す保持時間及びUV
/可視スペクトルを有する抽出物ピークを生じさせた。
この分析はケンフェロールが野生タイプの花粉及び葯に
存在することを確認している。
花粉の復帰活性に必要な構造的な特徴。
ペチュニアの野生タイプの花粉及び柱頭抽出物は、花
粉の発芽及び管生長も刺激できる（図5A参照）ケンフェ
ロールに加えて他の化合物を含有している。それ故、フ
ラボノイドの全ての主要なクラスの代表的な化合物：フ
ラボン、フラバノン、フラボノール、イソフラボノイ
ド、カルコン、アントシアニン及びカテキンは、次の様
にして花粉復帰活性についてアッセイした。ペチュニア
花粉粒を、１〜２×104/mlの密度でPEG4000発芽培地に
懸濁し、そして懸濁物の100μｌ分別物を96ウェルの微
量滴定プレートのウェルに入れ、そして150rpmで振とう
し乍ら室温でインキュベートした。花粉を添加する前
に、任意の補充物を直接GMに加えた。フラボノイド及び
他の化学品のストック溶液はジメチルスルホキシド（DM
SO）中で直接作成し、そして下記表３に示した最終濃度
になるように各ウェルに加えた。DMSOの濃度は各アッセ
イで１％に一定に保った。花粉は、管が１以上の花粉粒
直径の長さであったとき発芽したとして記録した。発芽
している実質上全ての粒子は続いて５以上の花粉粒直径
の管を生成する。実施例１に記載したように、ペチュニ
アV26は２つのタイプの成熟花粉を生成する；粒子の約2
5％は小さく、内部特徴を有しておらずそしてそれらは
インビトロでは決して発芽しない。それ故、V26におけ
る完全な発芽は、総花粉粒の75％が発芽したときに生起
する。実施例１のCMFペチュニア花粉はこれと同じ比率
を維持している。大部分の復帰実験で、最高発芽頻度は
生存可能な粒子の89％であった。インキュベーション４
時間後に、最も少なくて1000個の花粉粒を各アッセイで
記録し、発芽応答を得るのに必要な試験化合物の最低濃
度は下記表３に記載し、その際NRは応答なしを示す。10
0μＭで＜20％の発芽を生じさせた化合物は＞100μＭと
して示した。表３に示した化合物に加えて、フラボノイ
ドではないｐ−クマル酸、サリチル酸、ヒドロキノン、
クロロゲン酸、ジヒドロアスコルビン酸、ナフチルフタ
ルミン酸（NPA）、１−ナフタレン酢酸（NAA）、インド
ール−３−酢酸（IAA）及びジベレリン酸（GA3）を試験
し、そして応答は全く得られなかった。
表３に記載したように、置換基の位置は式： のフラバノイドの各位置に相当する。
表３から分かるように、アグリコンフラボノールはCM
F花粉に最大の発芽頻度及び生長能力を上首尾に回復さ
せたが、他のクラスのフラボノイドのなかでは、密接に
関係があるジヒドロフラボノール、タキシフォリンだけ
が100μＭでまあまあの（約18％）応答をもたらした。
更に、フェノール酸、抗酸化剤及び植物生長制御剤を含
む幾つかのクラスの非フラボノイド化合物を試験した
が、いずれも花粉の発芽を復帰させることはできなかっ
た。それ故、生理学的に関係のある濃度で花粉機能を復
帰させる能力はフラボノールに存在する。
試験したフラボノイドの範囲から、最大の花粉発芽及
び管生長には５つの一般的な構造的な特徴が必要である
ように思われる。３位炭素の無置換ヒドロキシル基及び
Ｃ環の４位のケト基に絶対的要件がある。最大応答はＣ
環の炭素２と３の間の不飽和結合及びＡ環とＢ環におけ
るヒドロキシル基の置換度に依存している。最も興味深
いことには、３位ヒドロキシルでグリコシル化されたフ
ラボノールは、ペチュニアの花粉や柱頭を含めて植物組
織中に見られる最もとびぬけて豊富なフラボノールの形
態ではあるが、不活性である。100μＭまでの濃度のク
エルセチン−３−Ｏ−グルコシド及びルチン（クエルセ
チン−３−Ｏラムノグルコシド）で試験したとき、花粉
の発芽は得られなかった。
Ｃ環の４位のケト基の要件は、ケト基のないカテキン
が活性を欠いているという事実によって示される。タキ
シフォリン（100μＭで約18％）とクエルセチン（10μ
Ｍで約50％）の相対的効率の比較によって、Ｃ環の炭素
２及び３間の二重結合が応答を約30倍高めることが示さ
れる。クエルセチンとフィゼチンまたは３−ヒドロキシ
フラボンの比較によって、Ａ環の５位かまたは７位のい
ずれかで追加された各ヒドロキシル基が応答を約10倍高
めることが示される。この上昇は、５位のヒドロキシル
基とＣ環の近接ケト基間の相互作用の影響を安定化する
ことに大いに依存していると思われる。最後に、Ｂ環の
ヒドロキシル置換は十分な活性には必要でなく、そして
事実、基の数が増加すると実際には活性を低下させる
（ケンフェロールとクエルセチン及びムリセチンと比
較）。この差異は、多数のヒドロキシル基を有するフラ
ボノールが一層極性であることによって引き起こされる
取込みの少なさまたは非特異的結合の増加によるもので
あろう。
或る非活性フラボノイドは、リゾビウム−レグメ（Rh
izobium−legume）系で小結節形成遺伝子の活性フラボ
ノイド誘発と拮抗することが報告されている（Djordjev
ic,M.A.、Redmond,J.W.、Batley,M.及びRolfe,B.G.、19
87年、EMBO ６:1173〜1179;Peters,N.K.及びLong,S.
K.、1988年、Plant Physiology 88:396〜400）。
花粉機能を復帰させるのに不活性である化合物は、フ
ラボノールアグリコンの作用と拮抗する能力について次
のようにして試験した。実施例１に記載したような、GM
中のCMF花粉を、ケンフェロールを１μＭまで添加する
前に、１及び10μＭの濃度の不活性化合物に30分間暴露
した。実験はまた、不活性化合物及びケンフェロールを
1:1または10:1の比率で花粉懸濁物に同時に添加しても
実施した。花粉の発芽頻度はインキュベーション４時間
後に記録し、そして試験した組合せのいずれでも拮抗作
用は見い出されなかった。次の不活性化合物を分析し
た：アピゲニン、カルコン、エリオジクチオール、フラ
ボン、フラバノン、ルテオリン、ナリンゲニン、カテキ
ン、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、ヒドロキノン及びサ
リチル酸。
実施例６ UV効果 １つにはUV光吸収能のために、フラボノイドは植物に
おけるUV保護剤として機能すると仮定されている（W.Ja
hnen及びK.Hahlbroch、1988年、Planta 173:453及び本
願明細書の参照文献）。フラボノイド欠失花粉が発芽し
ないことがUV効果によるものであるかどうかを決定する
ために、暗がりでの発芽実験を３つの変形で実施した。
花粉は（１）完全な暗がりで集めそして24時間貯蔵（水
中で）した花かまたは（２）新たに摘んだ花のいずれか
から収穫した。これらの２つの供給源から、フラボノー
ルを有するかまたは有していないGM中の花粉懸濁物を、
赤色安全光を使用して暗室で調製した。第３の変形は、
新たに収穫した花から昼間に花粉懸濁物を調製するが暗
がりでフラボノール溶液を添加することに係わってい
た。懸濁物は全てフォイルに包み、そしてその後実施例
５に記載したようにしてインキュベートした。フラボノ
ールが添加されているかまたは添加されていないV26対
照かまたはフラボノイド欠失花粉に関して、発芽頻度に
与える光の影響は検出できなかった。
UV光が自己稔性に影響を与えるかどうかを決定するた
めに、成熟したペチュニア植物を、L.P.Taylor及びW.R.
Briggs、1990年、Plant Cell ２:115に記載されたよう
にして610nmフィルターの下で数週間生長させた。ペチ
ュニアの蕾の形成と成熟には約２週間かかるので、植物
がフィルターの下に置かれた後に、そしてそれ故610nm
未満の光には暴露されなかった後に形成された蕾だけを
試験しそして自己受精させた。種子セットはCMF自己交
配（10回の試験）のいずれでも生じなかったが、同じ条
件下で実施したV26対照の自己交配は全て完全な種子鞘
を示した。
実施例７ フラボノール暴露時間の影響 完全な発芽及び最大の環生長に必要なフラボノイド暴
露量は、発芽中の花粉がフラボノールの存在下にある時
間を変動させて測定した。ほぼ最大の復帰を与えると計
算されるが、洗浄によって容易に除去される（最終0.5
μＭ）濃度のケンフェロールを、フラボノイド欠失花粉
のGM中懸濁物5mlを含有する60×15mmのペトリ皿に加
え、そして得られた懸濁物を150rpmで連続的に回転させ
た。表４に示した時間で400μｌの分別物をとり、遠心
し、1mlのGM中で洗浄してケンフェロールを除去し、再
度遠心し、400μｌのGMに再度懸濁し、そして２つの部
分に分けた。１つの100μｌ分別物には0.5μＭのケンフ
ェロールを再び補充した（対照）が、もう１つの部分は
それ以上フラボノールに暴露しないで生長を続けさせた
（処理）。最初の懸濁を処方してから総計４時間が経過
する間生長を進行させ、その後発芽頻度及び管の長さを
処理及び対照発芽の両方を記録した。結果は下記表４に
示す： 表４で見られるように、発芽の測定可能な増加は10分
ほどの短い暴露時間で検出された（表１）。最大の発芽
頻度及び管長さには１から２時間の間の暴露時間が必要
であった。
実施例８ インビトロでの稔性復帰 授粉時に花粉にフラボノールアグリコンを供給するこ
とによってDMFペチュニアに自己稔性を回復できる可能
性は、添加したフラボノールの存在下で行ったCMFペチ
ュニアの自己交配に起因する成功的な受精を記録するこ
とによって試験した。自己授粉の前に、フラボノールア
グリコンは（ｉ）柱頭に直接かまたは（ii）新たに集め
た花粉と混合して適用した。種子セット量で測定して最
も成功的な技術は、自己授粉の12〜16時間前に柱頭にフ
ラボノールを適用しなければならなかった。47の自己交
配は、添加したケンフェロールまたはクエルセチンを用
いて実施し、そしてほぼ60％（47のうち27）が種子セッ
ト鞘を産生した。１鞘当たりの種子数は31から287まで
変動し、そして発芽試験で任意の１個の鞘中の＞90％の
種子は生存可能であった。フラボノールを添加しないで
実施した自己交配（＞30の実施）は全て種子セットを産
生しなかった。
フラボノイド欠失ペチュニアで示された優性CMF形質
は、カナマイシン耐性（KAN）を与える第２の優性遺伝
子としっかりと結合している（Napoli C.、Lemieux C.
及びJorgensen R、1990年、「キメラカルコンシンター
ゼ遺伝子をペチュニアに導入するとトランスの同種遺伝
子の可逆的同時抑制が生じる」、Plant Cell ２:279〜2
89）。KANマーカーは、添加されたフラボノールの存在
下でフラボノイド欠失植物を自己交配して産生された種
子におけるCMF特性の分離について試験するために使用
した。新たに収穫した種子は、20％漂白剤で表面滅菌
し、滅菌水で洗浄しそして100ppmのGA3溶液に30分間浸
した後、100μg/mlのカナマイシンを含有する発芽プレ
ート（1xMS、3mM MES［pH5.6］、1xB5ビタミンミック
ス、３％スクロース及び0.2％凝固剤）に載せた。16/8
時間の光周期で補って23℃で生長させた後、カナマイシ
ン耐性は真葉及び側根の存在についてスクリーニングす
ることによって記録したが、それらのいずれもカナマイ
シン感受性の苗木では産生されなかった。下記表５で、
Ｐ値はカイ２乗（chi−square）適合度検定の１つの自
由度について観察された有意水準を表わす。
表５に示されるように、種子は、異形優性形質で予期
される3:1の比率のKAN耐性：感受性で分離されて100μg
/mlのカナマイシン中で発芽した。
実施例９ 野外試験 野外試験は、天然に生起するフラボノイド欠失トウモ
ロコシ突然変異体（CHS活性を欠いている白色花粉、こ
れは白色で非機能的な花粉でありそして自己不妊であ
る）を使用して実施した（E.H.Coe、S.M.McCormick、S.
A.Modena、1981年、J.Hered.72:318）。使用したトウモ
ロコシ白色花粉植物は、W23同系交配バックグランド中
に導入されたC2及びWhpで安定した劣性突然変異を有し
ていた。白色花粉植物（c2/c2 whp/whp）は、CHSの１つ
の機能的コピー（C2/c2 whp/whp）を有する同系植物か
ら得られる花粉と交配して維持した。植物は自己交配及
び同胞交配で雄性不妊であり、そして花粉や種子を含む
いずれの組織でも目に見えるフラボノイド色素を全く産
生しなかった。標準的な遺伝子野外実施を使用して、汚
染する花粉が白色花粉植物のトウモロコシの毛に到達し
ないように保証した。更に、白色花粉塊は、仁（kerne
l）の汚染が直ちに認識されるように、着色した仁種で
周囲を囲った。50〜100の植物から得た突然変異体白色
花粉は雄花の穂の袋から集め、プールし、そして２つの
部分に分けた。１つの部分は「そのまま」交配用に使用
し、そしてもう１つの部分は約20:1の比率で乾燥フラボ
ノール（クエルセチンか、ケンフェロールかまたはこれ
ら２つの50:50混合物かのいずれか）と混合した。調製
した白色花粉のトウモロコシの毛を未処置かまたはフラ
ボノールを補充した白色花粉のいずれかで授粉させ、そ
して直ちに袋をかけた。授粉から45日後に成熟した穂を
収穫した。白色花粉交配は通常、１つの穂当たり約200
個の仁を付けており、そしてこの数は生化学的に補足さ
れた自己交配で定型的に得られた。添加したフラボノー
ルの存在下で総計45の自己交配を行い、そしてそれらの
全て（100％）が完全に満たされた穂を生成し、一方フ
ラボノイドを添加しないで実施した自己交配（45回の実
施）は通常の１％未満の種子セットを示した。
前記実験によって、花粉機能にはフラボノールが必要
であることが確認され、それは次のとおりである：
（ｉ）野生タイプの柱頭及び花粉のメタノール及び水性
抽出物はフラボノイド欠失花粉の発芽及び管生長を完全
に回復する；（ii）これらの抽出物は、本願明細書に記
載したインビトロでの稔性復帰アッセイで活性を示すフ
ラボノールと同じフラボノールを含有している；（ii
i）花粉発芽を復帰させ、そしてインビトロでの十分な
管生長及びインビボでの十分な種子セットを回復する能
力はフラボノイドの特定のクラス、フラボノールアグリ
コンに限定される；（iv）フラボノールの有効濃度は構
造の特徴で変動するが、幾つかの化合物はこれら化合物
の生理学的濃度の範囲内である10μＭ未満で著しい効果
を示す。
フラボノイドはゼニゴケ、コケ及び雌性植物から裸子
植物及び被子植物までの事実上全てのクラスの植物で産
生される。過去のフラボノイドの調査ではしばしば、植
物標本からの乾燥葉または根組織が使用された；従っ
て、花粉フラボノイドの存在が如何に広範であるかに関
する良好な示唆を我々は持っていない。植物組織におけ
るそれらの遍在した存在及びフラボノイドが幾つかの広
範に相違する種からの花粉抽出物中で同定されたという
事実は、フラボノイドが花粉の一般的な成分であること
を示している。大部分の植物フラボノールは３−Ｏ−グ
リコシル化した種として生じ（J.B.Harbome及びC.A.Wil
liams、1988年、The Flabonoids、1980年以来の研究の
進展、J.B.Harbome編集（Chapman及びHali、ロンドン）
７、８章）、そしてこれはペチュニア花粉では優性形態
である（O.Ceska及びE.D.Styles、1984年、Phytochemis
try 23:1822）。アグリコン形態だけが花粉機能を復帰
させ、これは検出されない低い値のアグリコンが通常存
在しているかまたは受精に必要なアグリコンを産生する
ためにはグリコシダーゼ活性が必要であるかのいずれか
を示唆している。
花粉は受精プロセスを操作するための天然の接近点を
提供する。CMF植物を生じさせるフラボノール活性の損
失は殺配偶子剤（gametocide）としてではなく天然の配
偶子静止剤として作用する。十分な雄性機能はフラボノ
イド欠失花粉にフラボノールを外部的に適用して回復さ
せることができる。本願発明の顕著な利点は、高等植物
の受精に係わる因子の同定に加えて、ハイブリッド種子
産生用の可逆的な雄性不妊系の開発である。
本発明の好ましい実施態様を説明しそして記載した
が、本発明の精神及び範囲から離れることなく種々の変
更をすることができると考えられよう。
フロントページの続き (72)発明者 モー，インユアン アメリカ合衆国，99163 ワシントン州, プルマン，テラス アパートメント 708 (56)参考文献 特開 平２−2305（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−506595（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−500239（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅ ｒｅｄｉｔｙ，Ｖｏｌ．83，Ｎｏ．１, （1992），ｐ．11−17 Ｐｌａｎｔａ，Ｖｏｌ．161，Ｎｏ. ３，（1984），ｐ．261−265 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 3/00 A01H 43/16 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】植物の稔性を制御する方法であって、該方
    法が、該植物中の花粉におけるフラボノールの産生また
    は活性を遮断して、発芽および管生長能力が阻害されて
    いる条件雄稔性植物を得る工程、ならびに、稔性回復フ
    ラボノールと該花粉を接触させて、該植物の発芽または
    管生長能力を回復させる工程を含む方法であって、該稔
    性回復フラボノールが、以下の式 の化合物であり、 ここで、R1、R2、R3、R4、R5、R7およびR8が、水素、ヒ
    ドロキシル、または１から３個の炭素原子を有するアル
    コキシである、 方法。
  2. 【請求項２】前記植物中のフラボノールの産生が該植物
    中のフラバノン−３−ヒドロキシラーゼの産生または活
    性を阻害することによって遮断される、請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】前記植物中のフラボノールの産生が該植物
    中のカルコンシンターゼの産生または活性を阻害するこ
    とによって遮断される、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】R1〜R5のうち２つ以下がヒドロキシルまた
    はメトキシであり、そして残りのR1〜R5が水素であり、
    そしてR7およびR8が水素、ヒドロキシルまたはメトキシ
    である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】前記稔性回復フラボノールがガランギン、
    ケンフェロール、イソラムネチン、クエルセチンおよび
    モリンからなる群から選択される、請求項４に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】フラボノイドを欠失している条件雄稔性植
    物に植物稔性を回復させる方法であって、該方法が、該
    植物の花粉の発芽または管生長を高めるのに有効な量の
    稔性回復フラボノールと該植物の花粉を接触させる工程
    を含む、方法であって、ここで、該稔性回復フラボノー
    ルが、以下の式 の化合物であり、 ここで、R1、R2、R3、R4、R5、R7およびR8が、水素、ヒ
    ドロキシル、または１から３個の炭素原子を有するアル
    コキシである、 方法。
  7. 【請求項７】R1〜R5のうち２つ以下がヒドロキシルまた
    はメトキシであり、そして残りのR1〜R5が水素であり、
    そしてR7およびR8が水素、ヒドロキシルまたはメトキシ
    である、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記稔性回復フラボノールがガランギン、
    ケンフェロール、イソラムネチン、クエルセチンおよび
    モリンからなる群から選択される、請求項７に記載の方
    法。
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