BG99033A

BG99033A - Методи за регулиране на фертилитета на растенията

Info

Publication number: BG99033A
Application number: BG99033A
Authority: BG
Inventors: Loverine Taylor; Yinyuan Mo
Original assignee: Washington State University Research Foundation
Priority date: 1992-03-09
Filing date: 1994-09-08
Publication date: 1995-09-29
Also published as: KR950700407A; DE69332451D1; NZ251069A; HU9402583D0; US5733759A; HUT69991A; RO116095B1; AU3786493A; EP0630403B1; EP0630403A4; CA2131704A1; JPH07506963A; AU668548B2; WO1993018142A1; ATE226981T1; EP0630403A1; KR100292234B1; JP3418396B2; BG62891B1; BR9306047A

Abstract

Растения, при които флавоноловата активност е намалена, са условно мъжки фертилни (плодовити) /смf умф), а мъжкият фертилитет може да се спаси или дасе възстанови, като се доставят възстановяващи фертилитета флавоноли на местата на цветния прашец врастението. Въпреки че жизненият полен се продуцира от растенията с флавонолова недостатъчност, покълването на прашеца и растежа на тръбата са значително намалени както in vivо, така и in viтrо, катосе получават сам остерилни растения. При поставяне на прашеца в контакт с известно количество възстановяващ фертилитета флавонол, ефективен при засилване кълняемостта на прашеца, могат да бъдат възстановени напълно кълняемостта на прашеца и растежа на тръбата. Полезните за възстановяване на фертилитета флавоноли включват съединения с формула, в която r1, r2, r3, r4, r5, r7 и r8 са водород, хидроксилен или алкоксилов радикал, имащи от 1 до 3 въглеродни атома. Предпочитаните флавоноли включват галангин, кемпферол, isо-рамнетин, кверцетин и морин.

Description

МЕТОДИ ЗА РЕГУЛИРАНЕ ФАЕРТИЛИТЕТА НА РАСТЕНИЯТА

ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ИзоБретението се отнася до методи за регулиране на фертилитета при растенията, а по-специално, до създаването на флавоноидна недостатъчност, условно мъжки фертилни растения, чрез блокиране активноста на флавонон-З-кидроксилазата в растенията, и до възстановяването на фертилитета (плодовитоста) при условна мъжки фертилните, с флавоноиден недостиг, растения, чрез осигуряване на възстановяващи фертилитета флавоноли при поленовите сайтове на растенията.

НИВО НА ТЕХНИКАТА

Успешното опрашване на висшите растения по принцип, не само за продължаването на вида, а също така и осигурява големите популации, които са източника на изменчивост и конкуренция, които движат естествения подБор. В пост-дисперсната фаза от развитието на мъжките гаметофити, полена покълва върху Близалцето и изБутва тръБичката през пората на покълване в стената на полена. При ангиоспермия, растящата поленова тръБица представляsa провод за миграцията на двете спермени клетки (спермии) през стиларната тъкан до зародишната торбичка, където те се сливат с яйцеклетката и централните клетки до образуването на зигогата и ендосперма, съответно (Е. G. Cutterq 1978, Plant Anatomy, Part 1, Experimentation and Interpretation. E. Arnold. Eds., Addison Wesley, London, chap. 6.). Развитието на полека се осъществява в прашника и при зрялост, всяко семе представлява многоклетъчна спора, съдържаща продукти и от двете - спорофитна генна експресия, произлизаща от вътрашния слой на стената на прашника (tapetum), и хаплоидна генна експресия от вегететивната клетка във всяко семе (J.P. Mascarenhas, 1990, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 415317; J.P. Mascarenhas, 1989, Plant Cell B657). Въпреки, че процеса на микроспорогенезата е добре документиран исторически, малко се знае за молекулярните и биохимични фактори, които се включват при пост-дисперсното тюленово функциониране.

Флавоноидите са голям клас ниско-молекулни ((5300) специфични за растенията метаболити, които споделят обща 15 въглеродна скелетна структура. Модификация на основната структура води до внушителен списък от съединения, класифицирани по степента на окисление и характера на заместването на различните пръстени. Някои класове са пигменти (например антоцианини, халкони и специфични флавоноли и флавони) , докато други класове са безцветни абсорбиращи ултравиолета съединения. Антоцианините, в частност пеларгонина, цианидина и делфинидина, са отговорни за червения, синия и виолетовия цвят на растенията. Други пигментирани флавоноиди, халконите, и някои флавоноли, допринасят значително за жълто, слонова кост и кремавото оцветяване на цветята. Поленовите флавоноиди са идентифицирани в някои видове, където придават отличим жълт цвят на полека и могат да заемат голям процент (2-57.) от сухото тегло (R. Zerback, М. Bokel, Н. Geiger, D. Hess, 1989, Phytochemistry 28:897; R. Wierinann and K. Mieth, 1983 Protoplasma 118:230). Съществуват доказателства, че поленовото зърно е специфична среда за биосинтезата на флавоноидите и/или акумулирането, като няколко растителни вида притежават уникални типове флавоноиди в полените им (0. Ceska and E.D. Stylesq 1984, Phytochemistry 23:1822).

Растения, притежаващи модифицирана флавоноидна пигменW нтация, са описани от преди в литературата. Например, мутант на царевица, продуциращ не-функционален, по-скоро бял отколкото жълт полен, е бил изолиран и охарактеризиран (Coe Е.Н., McCormick S.

М., and Modena S.A., 1981, White pollen in maize, J. Hered 72:318-320). Мутантът c бял полен разпространява нормални количества от не--пигментиран полен, който покълва върху свилата, но не се получават семена след повечето поленизации» Условието е спорофитно определено чрез експресията на стабилни рецесивни мутации при двата халкон-синтетазни (CHS) гена на наревицата, С2 and Whp. Наскоро, бе докладвано, че Agrobacterium-медиираS» но вкарване на CHS трансген в наследствено пигментирана присадка от петуния, премахва експресията на ендогенния CHS ген(и), в резултат на което цветното венче е изцяло лишено от влавоноидна пигментация (Napoli С, Lemieux С and Jorgensen R, 1990, Introductiοποί a chimeric chaicone synthase gene into petunia results in reversible co-repression o-f homologous genes in trans, Plant Cell 2:279-278). Тъй като експресията на CHS трансгена е също подтисната в тези растения, терминът ко-супресия се използува за описването на този феномен (Jorgensen R, 1990, Altered gene expression in plants due to trans interactions

between homologous genes, Trends Biotech 8:340--344). Интегриреният тренсген действа като несвързан доминантен инхибитор на ендогенния CHS ген(и) и води до пълно блокиране при продуцирането на видими флавоноидни пигменти, не семо във венчелистчетата, но и в репродуктивните органи.

Блокирането на експресията на CHS гена води не само до недостатъчност на флавоноидната пигментация, но и до не-фертилни растения (Coe et al., 19815 Taylor et al., 1992, Conditional Male Fertility in Chaicone Synthase Deficient Petunia, J. Hered 83511-17). Крайно желателно е да се запази фертилитета при растенията с CHS недостатъчност, а също и да се даде възможност да се регулира фертилитета на растенията, чрез контролиране на един ензим, по-тясно свързан с поленовия фертилитет, отколкото CHS.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Вече е открито, че растения, при които флавон-3-хидроксилазната (F3H) активност е намалена, по такъв начин, че да се получи флавонолна недостатъчност, са условно мъжки фертилни (CMF), а този мъжки фертилитет може дъ бъде спасен или възстановен чрез осигуряване на условия, при които полена на растенията да може да влезе в контакт с възстановяващите фертилитета флавоноли. F3H активноста може да бъде намалена чрез блокиране F3H производството в растенията, директно или индиректно, непример чрез инактивиране на естествено продуцирания в растенията F3H, или чрез намаляване активноста на ензима-предшественик, такъв като халкон синтетазата (CHS) в флавоноловия биосинтетичен път. Въпреки че жизнеспособен полен се продуцира от растения с F3S недостатъчност, посълването на полена и растежа

-5на тръбата на сериозно намалени, както in vivo, така и in vitro, при което се получават самостерилни растения. Въпреки това, при осигуряване на условия, при които полена на растенията да може да влезе в контакт с възстановяващите фертилитета флавоноли, може да бъде възстановена способноста на растенията на пълна поленова кълняемост и растеж на тръбата. Подходящи условия за възстановяване на фертилитета, включват всички условия, при които нужните флавоноли са достъпни за полена на растенията, включително, например, чрез отстраняване F3H понижаващото обстоятел**» ство, възстановяване F3H производството в растенията, и други подобни. Алтернативно, фертилитета на растенията може да бъде запазен или възстановен като се постави в контакт полена на растенията с известно количество възстановяващ фертилитета флавонол, ефективен при засилване на кълняемоста и/или растежа на поленовата тръба. Полезните за възстановяване на фертилитета флавоноли включват съединения с формула:

и

R _а са &

водород, хидроксилен или рим.

алкосилен радикал, притежаващ от 1 до 3 атома. Най-предпочитаните флавоноли включват галангин, кемпферол, iso-рамнетин и мо-6КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Горе описаните аспекти и много от съпътстващите аспекти на настоящето изобретение, ще бъдат много по-пълно оценени, като при това ще бъдат и по-добре разбрани, чрез отпратка към следното подробно описание, като се вземе в съчетоние с прилежащите схеми, където:

Фигура 1 схематично представя спорофитното влияние (диагоналните щрихи) върху развиващите се микроспори в халкон синтетазни (CSH) хетерозиготни растения. Отсътвието на CHS функция в спорофита е означено с бял фон (фигура 1А), а наличието на CHS функция е означено с черен фон (фигура 1В).

Фигура 2А и 2В представляват фотографии на in vitro покълващ полен от наследствена петуниева линия V26 (фигура 2А) и растение 02425.1 с CSH недостатъчност (фигура 2В) , където пелена от прясно разпуканите прашници се суспендира в течна среда и се фотографира след прорастване при стайна температура, в продължение на 6 часа. Линията на фигура 2А отговаря на 2р'м. Стрпелките на фигура 2В посочват поленовите тръби, опитвайки се да покълнат.

Фигура 3 представлява фотографии на напречно срязани, идентични по развитие прашници от наследствена петуниева линия V26 (лява колона) и от растение 02425.1 с CHS-недостатъчност (дясна колона), които са били изолирани, фиксирани, закрепени, напречно срязани и оцветени с толуидин-блу, както е описано в пример 3. ’Фигура ЗА показва целия срез на прашника непосредствено преди разпукването, когато прашниците с CHS-недостатъчност са кафеникави и повехнали. Линията на фигура ЗА е 200 Ji(m. Фигура ЗВ показва срезове на прашник 48 часа преди разпукването, когато тренегенните прашници са закръглени и бя--7 ли» Фигура ЗС покадва срезове на прашници както на фигура ЗА при увеличение като на изображенията на фигура ЗВ» Линията на фигура ЗЕ< е 50 Т'м. Фигура 3D показва зрял полен при разпукване» На фигура 3, Р означава пален, Е - ендотециум, S - стомиум, С - кугитула.

Фигура 4 представлява фотография на възстановяването на тюленовото попълване и растежа на тръбата на полен от петуния с CHS-недостатъчност, чрез възстановяващия фертилитета флавонол, кемпферол. Полена се взима от прашници с условно мъжки фертилитет, суспендират се в среда за попълване и се прибавя кемпферол (К+, фигура 40 или DMSO (К , фигура 4В) до крайна концентрация 1 уЯМ. Репрезентативни участъци от полена са заснети след 4 часово инкубиране. Попълването и растежа на тръбата, наблюдавани при запазения с кемпферол

CFIF полен (фигура 4С>

е неотличим от дивия тип V26 контрола (С, фигура 4А) , който е получил само DMSO. СМЕ полена без добавки (фигура 4В) изпъкналост при пората на попълване при някои семена, но не се

ибутват поленови

Фигура 5 тръби.

представлява HPL.C профил на метанолни екстракти от бли залцето на дивия тип V26 (фигура 5А) и CMF близалце (фигура 5В) . Абсорбция при 360 нм на 100уХл аликвоти от екстракти, приготвени от 150 г близалца и фракционирани в метанол-воден градиент върху обратно-фазова колона. Притурката на фигура 5А е УВ/видимия спектър на пика при 33.17 минута и е идентичен, на този поалучен от автентичен кемпферолов стандарт. HPLC профил и и УВ/видим спектър на кисел хидролизиран V26 екстракт от близалца показват, че най-големите пикове при кемпферола и кверцетина.

време на задържане 7.43, 10.10, 13.46 и 16.65 са гликозиди на

-8-Фигура 6 е графично изображение на честотата на попълване на полена във функция от повишаването на концентрацията на флавонол гликон, при което се добавят кемпферол (отворени кръгове), морин (затворени кръгове), мирицетин (отворени триъгълници) и 3-хидроксифлавон (затворени триъгълници) към средата за попълване (БМ) до посочените крайни концентрации, а попълването се изчислява след 4 часа инкубиране. Средната честата на попълване, измерена при три отделни експеримента се разпределя по стандартната грешка на средното (SEN). SEM стойности < 1.4 не са видими. Честотата на попълване на контрол~1МйГ' ния полен от див тип V26 е типично 757., а резултата от не-запазен DMSO-третиран СМЕ полен е между 1-27. поленизация.

ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО И НА ПРЕДПОЧИТАНИЯ ВАРИАНТ

Съгласно един от аспектите на настоящето изобретение, фертилитета на растения при флавоноидна недостатъчност, условно мъжки фертилни (CMF) растения се възстановяват чрез осигуряване на условия, при които полена от растенията може да влезе в контакт с възстановяващите фертилитета флавоноли. При един ^w' илюстративен вариант, подходящи условия могат да се постигнат като се пастави в контакт полена на растението с известно количество възстановяващ фертилитета флавонол, способен да засили попълването и растежа на тръбата на полена на растението. Както се използува тук, под терминът флавонидна-недостатъчност, условно мъжки фертилни или CMF растения се подразбира, че се включваг растения, при които халкон синтетазната (CHS) или флаванон-З-хидроксилазната (F3H) активност са намалени, било то естествено или трансгенетично, за да се прекъсне естественото производство на флавоноиди в растението. В съответствие с то-9 ва, флавоноидна недостатъчност, условно мъжки фертилни растения ще бъдат с типична пигментна недостатъчност, което се изразява в бяло или светло оцветяване, и ще бъдат типично самостерилни. Предвид това, изобретението ще бъде описано в детайли във връзка с CMF петунии или царевица, други CMF растения могат да бъдат използувани по подобен начин при практическото осъществяване на изобретението.

В съответствие с друг аспект на настоящетго изобретение, фертилитета на растенията може да бъде регулиран чрез бло-

киране на активноста на флаванон-3-хидроксилазата (F3H), за да се получи CMF растение, което нормално самостерилно, но чийто *

фертилитет може да бъде спасен или възстановен като се постави полена на растението в контакт с възстановяващ фертилитета флаванол, както е описано тук. В естествения флавонолов биосинтетичен път, халкон синтетазата (CHS) кондензира три молекули малонил-Со-А и една молекула р-кумароил, за да се образува халкононарингинин, който се превръща в нарингенин спонтанно (в ниска степен) и под действието на халкон-флавонон изомераза (CHI).

При следващата стъпка от пътя, F3H катализира прибавянетао на идроксилна група към позиционния въглерод от С пръстена, за да се получи флавонол.

който е нужен за да се възстанови фертилитетната активност, в съответствие с настоящето изобретение.

Общият път може да бъде представен както следва:

— 10

(Martin,

Prescott, A., Mackay,

S., Bartlett, J. and Vrijlandt,

E. , 1991, Control ofbiosynthesis in flowers of Antirrhinum като флавонол arликонови съединения са нужни за мъжкия фертилитет, както е описано тук, всеки начин, който ефективно блокира F3H хидроксилиращата активност може да бъзде използуван при практическото осъществяване на изобретението. Така например, F3H субстрати могат да бъдат отстранени чрез блокиране производството на предшественици в биосинтетичния път, или експресията на F3H, CHI или CHS може да бъде блокирана чрез намесване в генната експресия. В друг илюстративен вариант, растения с блокирано флавонолово производство могат да бъдат произведени чрез експресия на противоположна РНК в растенията, която хобридизира с тРНК кодираща или нужна за експресията на F3H или на ензим предшественик, като например CHI, при растенията. Например, тапетен клетъчноспецифичен промотор може да бъде слят с F3H гена с противоположно ориентиране, и слятия елемент можа да бъде въведен в растителни клетки, като от тютюн, петуния, домат или други растителни клетки като се използуват известни техники, като Agro-11bacterium-медиирана трансформация, бомбардиране с частички, техники на директно вкарване на ДНК и други подобни (виж например Napoli С, Lemieux С and Jorgensen R, 1990, Introduction of a chimeric chaicone synthase gene into petunia results in reversible co-repression o-f homologous genes in trans, Plant Cell 2:279289; Mariani, C., De Beuckleer, M., Truettner, J., Leemans, J. and Goldberg, R.B. , 1990, Induction of male sterility in plants by a chimeric ribonuclease gene, Nature 347:737-741; and Geller, P.W. , Min--Wong, L. , Taylor, L.P., Pike, D.A. , and Theologis, A. , Reversible inhibition of tomato fruit senescens by antisense RNA, Science 254:437-439). Промотора на тапетума може да бъде изолиран чрез< диференциално сДНК клониране (Goldberg, R.B., 1988, Plants: novel developmental processes, Science 240:1460-1467) или чрез използуване на хибридизационна матрица, генерирана от полимеразна верижна реакционна (PCR) амплификация на геномните последователности (виж Saiki, R.K., 1990, Amplification of genomicDNA, in PCR Protocols, M.A. Innin, Felfand, D.H., Sninsky, J.J., and White, T.J., eds, Academic Press, San Diego, pp. 1320) хомоложни на преди това публикувани специфични за тапетума промотори. Алтернативно, F3H гена може да бъде изолиран чрез генериране на хибридизационна матрица, като се използува PCR олигонуклеотидни праймери (виж Saiki, R.K., 1990, supra) основавайки се на Antirrhinum F3H последователност. Като друга алтернатива, гена кодираш, за F3H, CHI или CHS в растението може да бъде променен, мутиран, остранен, блокиран или по друг начин да се намали неговото действие за да се избегне експресия на F3H ензима в растанието. Например, гена кодиращ. F3H в растението, може да бъде премахнат от ядрения геном на растението и да бъде заместен с F3H гена, оперативно свързан с един индуцируем промотор, както е описано в заявка за Европейски патент ЕР 0465024, публикувана на 08 януари 1992, да се позволи контролираното отблокиране на флавоноловата продукция и да се

запази фертилитета на растението, чрез индуцирана от вън генна експресия. Освен блокирането на синтезата на F3H in vivo, става ясно, че F3H активноста може да бъде блокирана с малки части, които директно взаимодействат с F3H, за да инактивират или намалят негоивата хидроксилазна активност. В допълнение, производството на флавоноли, може да бъде намалено, чрез блокиране на CHI активноста; все пак тази алтернатива не е много за предпочитане, тъй като превръщането на халкононарингенина в нарингенин става спонтанно в ниска степен в отсъствие на CHI.

Намаляването на мъжката функция в растения, които имат липса на флавоноли, като резултат от недостатъчност на CHS, CHI или F3H активности, завършва с не големи аномолии в поленовото развитие, до момента непосредствено преди разпукването, когато морфологията на прашника се отклонява от нормалните цвят, форма и размери. При разпукването, полена остава групиран в прашЧш ника и при микроскопско наблюдение се забелязва значително количество от семената в камерите по-повехнали от нормално. Все пак се произвежда жизнеспособен полен и се разпръсква, като кълняемоста на полена и растежа на тръбата са силно намалени, както in vivo, така и in vitro. В добавка на функционалната мъжка стерилност, растенията с флавонолова недостатъчност показват някои аспекти на само-несъвместимост, както се вижда от факта, че полена може да бъде частично запазен от близалцето на растения от дивия тип, но не и от близалцето на растения с флавонолова недостатъчност. Въпреки че са на лице елементи както от мъжка стерилност, така и от само-несъвместимост, характер ните черти, които показва полен от растения с флавонолова недостатъчност, ясно съставят уникално състояние, което се описва тук като условен мъжки фертилитет CMF.

Растения с липса на CHS (следавателно с липса на флавоноиди) изглеждат нормални, с изключение на две качества: 1) липса на флавоноидна пигментация и 2) производство на повреден полен, който е изцяло зависим от пестика (близълце + стълбче) за да функционира.

Докато растенията с CHS недостатъчност споделят липсата на флавоноидна пигментация и понижената функция на полена, изпъкват някои разлики между растителните видове. Царевичният бял полен покълва върху свилата и продуцира поленова тръба, чийто растеж се ограничава в стълбчето. Освен това, царевичния мутантен поле покълва in vitro и продуцира тръба приблизително толкова дълга колкото при дивия тип (L..P, Taylor, unpub. obs. ) . В противовес, полен от петуния с флавоноидна недостатъчност не навлиза в близалцето, нито продуцира тръба, както in vivo така и in vitro. Тази разлика мегду царевица и петуния може да бъде обяснена от гледна точка на физиологичните разлики между триклетъчен (царевица) и двуклетъчен (петуния) полен. Двуклетъчния полен има ниско дихателно ниво след разпръскване, образува втората спермена клетка след разпръскването, може да се задъзржи на близалцето в няколко часа преди покълването и има ниска степен на първоначален растеж на поленовата тръба. Триклетъчния полен, организационно, претърпява второто митотично делене преди прашниците, притежава високо дихателно ниво след разпръсткавето,у покълва за минути след влизането му в контакт с повърхноста на близалцето и има висока степен на първоначален растеж. Тъй като три клетъцния полен е позиициониран, така

-14че бързо да прорастне след разпръскването, царевичните поленови тръби на белия полен растат до значитолна дължина преди да се активира какъвто и да е механизам, който би задържал растежа на тръбата.

При цъфтящите растения със смяна на генерациите, диплоидния спорофит произвежда хаплоидни спори, които растат и се делят митотично до получаване на гаметофита. Част от гаметофютния жизнен цикъл се осъществява по времето когато развиващата се поленова спора е в тесен контакт със заобикалящата спорофитна тъкан. Това подреждане има потенциала за диплоидно-хаплоиднои взаимодействие. При хетерозиготните растения, това взаимодействие включва също така, и хаплоидно-хаплоидна комуникация между двата типа гаметофити, както е показано на фигура 1. Факта, че описаната тук мъжка стерилност от флавоноидна недостатъчност при петунията, е генетично доминантна, докато мъжката стерилност при белия полен на царевицата е генетично рецесивен, води до един интересен извод по отнощение на това дали гаметофита или спорофита е отговорен за ефекта. Прицаревицата, мъжката стерилност се експресира само при рецесивни хомвозиготни растения за двата CHS гена, с2 и Whp. Хетерозиготни с единично функционално копие на С2 или Whp. продуцират 1007. жълти, фертилни поленови зърна (Coe et al., 1981). Така, в хетерозигота СН8--положителния спорофит или 50% CHS-положителните гаметофити повлияват експресията на фертилитета в CHS-отрицателните гаметофити. В трансгенетичната петуния, мъжката стерилност е свързана с доминантна черта и полена, произведен от хетерозиготните растения е 100% с мъжка стерилност. При този случай, стерилноста се пречинява или от инхибиране на CHS-положителните гаметофити чрез CHS подтиснати гаметофити или чрез CHS не-ISдостатъчности, причиняващи мъжка стерилност,която се проявява еднакво при при царевицата и петунията, и при двата вида поскоро спорофита причинява стерилния фенотип, отколкото гаметофита. Така, условния мъжки фертилитет, свързан с CHS недостатъчност при царевицата и патунията има обща физиологична основа.

Производството на условно стерилен полен от растения с флавоноидна недостатъчност може да се използува като основа един опит зо in vitro спасяване на полена. Специфичните съединения, нужни за функционирането на полена могат да бъдат идентифицирани като се инкубира трансгенетичния полен в разтвор за покълваме, към който са прибавени пречистени флавоноиди или растителни екстракти и като се изследва засилената честота на покълваме и растежа на поленовата тръба. По този начин се определи, че голямото семейство флавоноидни съединения, най-общо, не е еднородно ефективно при възстановяването на фертилитета при CMF растения, докато специфична група от възстановяващи фертилитета флавоноли - агликони, е ефективна за тази цел.

Който и да е флавонол, който е ефективен при спомагането на покълването на полена на CMF растение, може да бъде използуван при практическото осъществяване на изобретението. Открито е въпреки това, че повечето членове на сравнително голямото семейство флавоноиди са неефективни за тази цел. В съответствие с това, ключов аспекст на настоящето изобретение е, че изключително ефективени възстановяващи фертилитета флавоноли могат да бъдат идентифицирани и използувани при възстановяването фертилитета на растенията при CMF само-стерилни условия. При един предпочетан вариант на изобретението, възстановяващия фертилитета флавонол е съединение с формула:

водород, хидроксилен и алкоксилен радикал, притежаващи от 1 go ваглеродни атома. За предпочетане, не повече от два от R^ -Rj- са хидрокси или метокси, а оставащите R^-R^-ca водороди, a R^ и Rg са водород, хидрокси или метокси. Понастоящем, най-пред почетен и най-репрезантатиЕен възстановяващи фертилитета флавонолови съединения, съгласно изобретението, включват галангин, кемпферол, iso-рамнетин, кверцетин и морин, които обща химическа структура посочена по-горе със следните заместетили:

ТАБЛИЦА 1 флавонол r₂ ^R5^R* ^r£ галангин кемпферол iso-рамнетин кварцетин морин

Η	Η	Η	Η	ΟΗ
Η	ΟΗ	Η	Η	ΟΗ
	ΟΗ	Η	Η	ΟΗ
□Η	ΟΗ	Η	Η	ΟΗ
Η	ΟΗ	Η	Η	ΟΗ

Други флавоноли използувани при практическото осъщест вяване на изобретението могат точно определени като се изпол зуват методите за изследване спасяването на полека in vitro

--17 посочени по-горе.

Горе казаното може да Бъде по-доБре разБрано във връз ка със следващите примери, които са представени като илюстративни, а не като ограничителни.

ПРИМЕР 1

ФЕРТИЛИТЕТ НА ПЕТУНИИ С ХАЛКОН-СИНТЕТАЗНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ Трансгенни и наследствени V26 петунии си подържат на 16/8 часа фотопериод в парник с метало-халогенна светлина с ин~λ -4 тензитет 300-600 |Лмола м сек . Наследствена V26 е пигментирана линия от Petunia hybrids, която може да продуцира флавоноиди в повечето растителни тъкани, включително полена, прашинка и филаментите, и пестика (Близалце и стълБче) и е напълно само-съвместима. Анолизираният трансгенетичен материал се състои от два независими трансформирани регенерата, 218.38 и 218.41 (Napoli С, Lemieux С and Jorgensen R, 1990, Introduction of a chimeric chaicone synthase gene into petunia results in reversible co-repression of homologous genes in trans, Plant Cell 2:279-289) и индивиди от втората генерация оБратно кръстосване (ВС2) към родителската V26 линия (номера на популациите от 2425 до 2435). Т-ДНК инсърта в тези трансформанти съдържа CHS сДНК последователности сляти с вирусен промотор свързан към гена на неомицин фосфотрансфераза II, като селекционен маркер (Napoli et al., 1990). Осъществяват се кръстосвания с женски цветове 24 часа преди прилагането на полена. Всички трансгенетични цветове, използувани при кръстасването, не показват видими Белези от пигмент. Донорите на полен се изберат от растения, които имат 2 или 3 разпукани прашника или се изрязва от закръглени, пред разпукване прашници, както е отбелязано.

Трансгенетичните петуниеви растения 218.38 и 218.41 продуцират чисто Зели цветове след вкарването на едно допълнително копие от CHS гена. Когато се наЗлюдава CHS експресия в трансгенетичните венчилистчета, се открива индукция на РНК 50пъти в сравнение с нетрансформераните V26 родители или соматични ревертанти, в двата - ендогенни и вкарани CHS гени. V26 наследствената линия произвежда пурпурни аентоцианинови пигменти в листата, ствола, стеЗлото, стълЗчето и филаментите на прашинка, и и жълти халкони в ръзвиващите се прашници. За сравнение, трансформираните растения нямат отличими флавоноидни пигменти в коя да е от тези тъкани. Липсата на видим пигмент е потвърдена чрез HPLC анализ на метанолни екстракти, както е описано в пример 6. Нормално, точно преди разпръскването, прашниците на петунията, пълни със зрял полен, претърпяват изсушаване. При разпукването, когато кутийката на прашника се скъсва надлъжно по дължината на стомиума, дехидратираното състояние на тъканта позволява двата края на частите на прашника, завити назад един спрямо друг, да разкрият поленовите зърна. Изследване от Злизксз на не-пигментираните трансгенетични растения разкрива, че през 48-те часа предхождащи разпукването, прашника се свива средно около 407. на дължина и променя цвета си от кремаво-Зял до кафеникав. За сревнеие, прашниците на не-трансформираните родителски линии V26 се свиват само около 157 и не претърпяват промяна на цвета, като остават жълти по време на този период. Гоямата вариация на честотата на разпукване на прашници е от 0 до 1007, с най-висока честота, свързана с намаляване на относителната влага. Въпреки това, разпукването може да Зъде леко заЗавено в сравнение с V26 родителите, прашниците с флавоноидна недостатъчност се отварят за да разкрият нормално ко19 личество полен, който не изглежфда толкова светъл и ронлив като полена на V26 и остава групиран в кутийката на прашника.

Не се получават семена от многоБройните опити за самоопрашване на поколенито 218.41 с флавоноидна недостатъчност, като се използува или: 1) полен от свити, кафеникави, разпукани прашници или 2) полен изрязан от Бели, закръглени прашници преди разпукване (виж таблица 2, колона 5, трансгенетично само кръстосване: 0 семена/семенник) · Само кръстосване на V26 родителската линя продуцира средно 225 семена за семенник. Това прави приблизително около 17000 възможни семена в 75-те опита за само кръстосвания натрансгенетични петунии. Всички изБроени растения в таблица 2 се тестуват за женски фертилитет чрез опрашване на близалцето с полен от наследствена линия V26. При всички случаи, семенниците се продуцират с нормалния Брой семена, което означава, че растения с CHS-недостатъчност са с женски фертилитет. Обратното кръстосване, трансгенетичен полен с флавоноидна недостатъчност върху V26 Близълца, дава производство на вариращи количества семена, както е показано на табли ца

От 37 кръстосвания, включващи 10 различни трансгенетични растения като мъжси родители, 11 не произвеждат семенници, произвежс^ат семенници с по-малко от 150 семена на семенник и 6 произвеждат семенници с повече от 150 семена на семенник. Това прави средно около 60 семена на семенник или 707. намаление на група семена. Тези резултати показват, че докато полена от растения с флавоноидна недостатъчност е не-функционалан върху Близалца с флавоноидна недостатъчност, той е частично функционален върху Близалца от дивия тип, състоянието което ние наричаме тук като условен мъжки фертилитет (CMF). Широките вариа ции в броя на семената, установен на опрашване при тези външни кръстосвания, възможно се дължат на факторите на околната среда?. и/или на развитието.

ТАБЛИЦА 2

	ПРОИЗВОДСТВО	НА СЕМЕНА ОТ	КРЪСТОСВАНЕ НА ТРАНСГЕНЕТИЧЕН ПОЛЕН
				Брой на опрашвания
	V26 X	трансгенетичен	полен	Трансгенетично
Родителски	—	------------------------------		—	само кръстосван!
пален	0 семена/	1-150 семена/	>150 семена/	0 семена/
	семенник	семенник		семенник	семенник
02425	0	7		0	8
02430.5	0	5		-	f D
02430.6	*7	1		0	А
02430.8	ND	ND		ND	6
02432« 2	ND	ND		ND	ь
02435.1	0	1		1	ь
О74“*5„ 2	1	4		1	8
02435.3	0	1		1	/
32425.1*	0	1		0	1
32428«1	ND	ND		ND	6
32431.2	“Ί	3		0	ь
32432.3*	3	0		0	7
32430.5*	3	•7		0	7

КЦеветове на други клонки на това растение имат известна пурпурно пигментиране по венчето.

^Най-малко 4 цвята* на всяко от изброените растения е опрашено с пален ат 026 и всички имат пълни със семена семенни ци

Среден брой семена/ семенник

Малко вероятно е CMF да се дължи на вмъкването на Т-ДНК в гена, нужен за мъжкия фертилитет, тъй като два независими трансформанта, 218«ЗВ и 218=41, и двата показват еднакви черти: пълна липса на флавоноидна пигментация и идентичен доминантен мъжки стерилен финотип. Допълнително доказателство за това заключение идва от наблнздениеята на Napoli et al., (1990) че трансформираните регенерати, понякога ревертират соматично до напълно пигментирани растения, но запазват трансгена, което означава, че присъствието само на трансгена не изключва ендогенната CHS експресия. По-нататъшни наблюдения и кръстосвания на тези соматични ревертанти, показват, че те са напълно мъжки фертилни. По подобие на белия полен в царевицата, CMF в петунията изглежда се дължи на флавоноидната недостатъчност, като тази причинена от отстраняването на CHS или F3H генната експресия»

ПРИМЕР 2

ПОКЪЛВАМЕ НА ПОЛЕНА И РАСТЕЖ НА ТРЪБАТА

In vitro покълваме се осъществява от прясно събран полен в опростена среда на Brewbakers, както е описана от Mulcahy GB and Mulcahey DL, 1988, The effect of supplemented media on the groth in vitro of bi- and trinucleate pollen, Plant Science 55:213-216 (тук и по-нататък се посочва като среда за покълване или GM). Полен от единичен прашник се поставя в микротитърна ямка с 50 Тл среда, разклащан на стайна температура в продължение на 6 до 8 часа.и се снима с Kodack технически панорамен фИЛМ.,

In vivo, растежа на поленовата тръба се измерва 48 часа след опрашването, както е описано от Herrero М. and Dickinson

H.G., 1979, Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrids:

~ ед ·φ* -..

changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses, J Cell Sci 36&1-18. Халосните тапи се визуализират чрез епифлуоресценция, генерирана от възбуждане при 355-425 нм (D куб) и отстраняване дължина на вълната 460 нм от Leitz Aristoplan. Снимат се образци с Ektachrome Т 160 филм и отпечатъци, направени от интернегативи.

Жизненоста на полена се определя по флуорохроматична процедура (FCR) (Heslop-Harrison J. and Heslop-Harrison Y. , 1970, Evaluation of pollen viability by enzymatically induced '·* fluorescence; intracel 1 ular hydrolysis of fluorescein diacetate,

Stain Technol. 45:115-120) чрез инкубиране на свежо разпукан полен в разтвор на карбоксифлуоресцеин ацатат (1 мМ) в среда за попълване. Епи<флуоресценцията се визуализира както е описано по-горе.

ПРОДУКЦИЯ НА КАЛОС

Поленовите тръби на петунията, нормално навлизат в близалцето около един час след попълването (Herrero and Dickinson, 1980) и растат надолу през стилярната тъкан, за да доставят две«<· те спермени клетки в зародишната торбичка. Калосът представлява полизахариден полимер свързан с^ШКЗ) гликозидна връзка, и тапи от този материал се наслагват обикновено на ровни интервали надолу по растящъта поленова тръба. Калосът се визуализира чрез неговата отличителна флуоресцентност багрене с обезцветено анилиново синьо (Currier 1957; Eschrich and Currier 1964). Разглеждат се попълването и растежа на поленовата тръба при само кръстосване на цветове с CHS недостатъчност от пример 1 и обратно кръстосване на същите растения с полен от V26. Пестиците се събират 48 часа след опрашването, багрят се с обезцветено аналиново синьо и се наблюдават на флуоресцентен микроскоп.

Наблюдава се равномерно отлагане на халосни парчета по цялата дължина на стълбчето в тълпата от пестици с флавоноидна недостатъчност, опрашени от V26. От друга страна, не се наблюдава калус в пестиците на само-опрашените петунии, въпреки наличието на огромни количества полен върху близалцето.

МОРФОЛОГИЯ НА ПОЛЕНА И ПОКЪЛВАМЕ

Прави се микроскопично наблюдение на прясно разпръснат полен от растения с флавоноидна недостатъчност от пример 1, което не разкрива големи аномалии, Полена от петуния покълва и

продуцира тръба, когато се инкубира в оибикновена течна среда.

Покълналият полен от всяка от ВС2 семействата go V26 полена се сравняват in vitro.

Показаното на фигура 2 е типично представително.

Както е показано на фигура 2, след 6 f* часа растеж, много мутирали поленови зърна са достигнали покълваме, както се забелязва от подчертаното изпъкване около една от порите на покълване (стрелки, фигура 2), но най-много 27. от поленовите зърна от растението с .флавоноидна недостатъчност продуцират тръба с каквато и да е дължина. От поленовите зърна, които продуцират измерима тръба, дължината е под 207 от дължината нй V26 поленовите тръби, растяли при същите условия.

За да се определи дали полена, продуциран и разпръснат от растенията с флавоноидна недостатъчност е жизнеспособен и следователно способен на покълване и прорастване на поленова тръба, се осъществява флуоресцентен анализ (FCR) за жизнеспособноста на свежо разпръснат трансгенетичен и V26 полен. Този тест зависи от издигането на флруоресцеин ацетатното съединение в поленовото зърно, с последващо превръщане в флуоресцеин чрез вътреклетъчните ензими. Флуоресцеина е силно полярен и остава затворен, най-често във вегетативната клетъчна цитоплаз-24ма, където се визуализира чрез флуоресцентна микроскопия. Наследствен 026 полен се състои в голяма степен (над 407.) от ненормално малки, FCR отрицателни зърна, при които изцяло липсва какъвто и да е вътрешен белег. Няколко зърна от този тип могат да бъда видяни на фигура 2А, вкбючително две в центъра на фотогрофията. Таози популация никога не покълва и наподобява закърняли зърна. От оставащите зърна (60%), почти всички показват положителен FCR тест, което посочва присъствието на интактни плазмени мембрани и активни цитоплазмени естерази. Полена от мутантния прашник задържа по-голямата част от повяхналите, закърняли клетки. От оставащите нормално изглеждащи зърна, повече от 907. са FOR положителни. Фактът, че повечето от продуцирания от растения с флавоноидна недостатъчност растения полен е жизнеспособен и метаболитно активен, пхосочва, че някои аспекти на CHS активноста са нужни за нормалното попълване на полена и рг^стежа на тръбите.

ПРИМЕР 3

МИКРОСКОПСКО НАБЛЮДЕНИЕ НА РАЗВИТИЕТО НА ПРАШНИКА

За да се определи дали липсата на CHS активност по време на мипроспорогенезата променя клетъчната архитектура на развиващите се поленови зърна или тъканта на прашинка, се съпоставя поленовото развитие в растения 02425.1 с V26 и CHS недостатъчност. Прашници от серии според различните етапи на развитие на петуниеви пъпки на дължина от 0. 1 до 6 см, се събират, фиксират в 27. параформалдехид, 1.257. глутаров алдехид в Pipes, pH 7.2, закрепват се в смола на Spurrs, и 1 ^м участъци се оцветяват с толуидин блу. Правят се фотомикрографии с Kodack технически панорамен филм. Хистологично, това представлява всички етапи от мипроспорогенезата, от най-ранните данни за дизерен-go прашници пред разпукване, пълЕТ .I·*ци-зция на археспорална тъкан ни със зрял полен. Специално внимание се отделя на развитието и последващата дезинтеграция на тапетума, тъй като тази тъкан се счита за източник на поленовите флавоноиди. При всички ета пи трансгенетичния прашник и развиващите се микроспори не по казват хистологични разлики при сравнение с V26. Взимат се допълнителни участъци от прашници с флавоноидна недостатъчност по време на преминаването от закръглен, бял, към изсушен, кафеникав. и се сравняват със съответните стадии при V26 (фигу<*'* ра 3) . Преди разпукването, клетките от ендотелния слой нормално се развиват радиално, сгъстяват се и отлагат материал, за който се смята, че участва в механизма на друго скъсване (Cutter, E.G., 1978, Flant anatomy: Experimentation and Interpretation. Part 1, “Cells and Tissues. 2nd ed., London: Arnold). Този слой не е непрекъснат, като лепсва в пространството заобикалящо стомиума. Отрязаците от повехналите, кафеникави прашници не показ-

ват големи аномалии по отношение на ендотелния слой, стомиума, или кутикулата заобикаляща прашника. Все пак, при сравнение с полен от V26 (фигура 3, колона V26) по-голяма съотношение от повехнали зърна лишени от вътрешни белези присъстват в локулите на трангенетичните растения, а по-големите зърна се проявяват по-хетерагенни по размер, форма, и реакция на оцветяване (фигура ЗС и 3D). Хетерогенноста показана на фигури ЗС и 3D могат да се дължат на факта, че полена е нормално разпръснат в силно дехидратирано състояние, при което протича бърза рехидратация върху близалцето, полена с флавоноидна недостатъчност може да бъде разпръснат в много по-дехидратирано състояние, отколкото нормалното, и когато се постави в течна среда за покълваме, започва да рехидратира до нормален външен вид.

26ПРИМЕР 4

ФЛАВОНОИДНИ ЕКСТРАКТИ ОТ ПЕТУНИЯ

Анализи на екстракти от полен на петуния идентифицират по-голямата част от флавоноидите като 3-0-гликозиди на кверцетина и кемпферола, 4,2’,4’,6’-тетрахидроксихалкон, и дихидро флавонол, таксифолин (Zerback, R. , Bokel, М», Geiger, Η.., and Hess, D., 1989, Phytochemistry 285897-899; Zerback, R., Dressier, K. and Hess, D., 1989, Plant Science 62:83-91; De Vlaming, P., and Koh, K.F.F., 1976, Phytochemistry 135348-349). Царевичният полен съдържа най-малко 10 глик8озида на кемпферола, кверцетина, и изорамнетина (Ceska, 0. and Styles, E.D., Phytochemistry 2351822-1823). Водни изблици от двете, дивия тип и кръстосаната петуниек<а линия V26 се осъществяват чрез накисване нгч близалцата с пинсета или обработка на поленова суспенсия на вортекс (силно разбъркване) в ^t:'EG 4000 среда (W. Jahnen, W.M. Lush, А.Е.Clarke, 1989, Plant Cell 1:501), тук и по-нататък белязан като GM, центрофугира се 5 минути в микрофюжна еипруветка и аликвоти от супернатантатг^ се прилагат директно към CMF поленовата суспенсия в GM в 96-ямково микротитърно блюдо. Осъществяват се метанолови екстракции по същия протокол, с изключение на това, че екстракта се изсушава под вакуум и се ресуспендира в GM преди прибавянето му към поленовата суспенсия» Първоначалните експерименти по запазването извличат степен от 33% покълваме като се използуват 20 (една пета от общия обем) от един воден екстракт, приготвен от 10 близалца от V26., Като контрола се приготвят екстракти по същия начин от близалца и полен от CMF растенията. При изследванията на поленоЕ<ото покълваме, единствено екстрактите от полей и близалца от V26 са способни да възстаноЕ<ят покалването и растежа на тръбата на полена с флавоноидна недостатъчност. Екстрактите от полен и близалца от див тип и CMF се изследват като следва. Близалцата или полена се екстрахират първо с 507. метанол, следван от 100% метанол, след което екстрактите се обединяват и концентрират. Продуцират се аглюкони чрез киселинна хидролиза: екстрактите се смесват об/об с 4Ν НС1, запечатват се в 2 мл ампули и се подлагат на хидролиза във вряща вода в продължение на 40 минути. Точно копирани проби се пускат на обратно-фазова С18 колона (Phenomenex Spherisorb 5 ODS 2 250 х 4.ό mm). Разтворител А е 5% оцетна киселина, а разтворител В е съставен от 5% оцетна киселина и 807. ацетонитрил» Всяко пропускане се състои от 6 минути изократен градиент (207. В) , следвано от 20 минути линеен градиент до 957. В и завършва изократно при 95% В в продължение на 14 минути. Скороста на изтичане на разтвора е 0,5 мл/мин при стайна температура. Изследва се при 360 нм с Hewlett Packard модел 1040А фотодиоден повърхностен детектор. Открива се кемпферол в екстрактите от близалца от дивия тип при 60 нг близалца, а кверцетин при значително по-ниски стойности. Идентични екстракти от обединени 150 CMF близалца или от 500 CMF прашинка не дават пикове, характерни за типичните флавоноидни спектри.

Обработката на екстракти от близалца от див тип със смилащи протеина ензими, затопляне и преминаване през мембрана разделяща молекулите по размер, която посочва че активното съединение е малка не протеинова молекула. Молекулното тегло на активното съединение се изчислявоа като се прекарва екстракта през молекулно сито спиращо до 3000 далтона (Centricon30 -Filter, Amicon), като по този начин се остановява също, че поленовата запазваща активност преминава през филтъра. .Водни

екстракти от близалца и полен от V26 се обработват с 0.025 eg и-ници папаин в продължеание на 30 о

минути при 37 С в 100

л р еакционен обем. Ензимната активност се проверява чрез обработване с BSA (говежди серумен албумин) (0.5 мг/мл) при същите условия и чрез разглеждане на смлените продукти чрез SDS--.no лиакриламидна гел електрофореза (PAGE). Нито протеазата нита ϋ

топлинното обработване (100 С за 5 минути) не елиминират спасобноста на. екстрактите да запазят CMF поленовото попълване и растеж на тръбата.

Колективно, тези резултати показват, че присъстващите в дивия тип полен флавоноиди играят роля при покълването на полена, и че близалцата от дивия тип съдържат подобни съединения, които могат да компенсират липсата на флавоноиди в CMF полена.

ПРИМЕР 5

ФПАВОНОАОВО СПАСЯВАНЕ!. НА CMFP ФЕРТИЛИТЕТА

Биохимичното допълване на полена с флавоноидна недостатъчност от пример 1 се осъществява чрез прибавяну на ниска

концентрация сията от CMF

кемпрферол, флавонолов гликон, към полен в среда за покълваме (GM) . Кактко е суспенпо казано на фигура 4, последователния анализ осъществен в продъл жение на 12-часов период на растеж потвърждава, че покълването се инициира едновремено'и, че растежа на тръбата се извършва в същата степен и до същото ниво в запазения CMF полен (К+) в сравнение с полена от дивия тип V26, който не получава фла~ вонолова добавка (С). Запазването е почти пълно; поленът с добавка на флавоноид показва 80% честота на покълване в сравнение с V26. CMF поленът, към който е прибавен саво DMSO разтворител (К-),1 не показва значитолно покълване (1-2%), а поленовите тръби, ако въобще покълнат, никога не надминават диаметъра на две поленови зърна.

За да се потвърди, че екстрактите от близалцата на дивия тип, които са способни да запазят паленовото покълване и растежа на тръбите съдържат кемпферол, нехидролизиран екстракт се фракционира на HPLC и се анализира чрез УВ/видима абсорбционна спекчроскопия. В екстрактите от близалца на 026 се установява пик с време на задържане и типичния флавонолов спектър (абсорбционни максимуми около 260 и 360 нм) (фигура 5А и притурка). Събира се предполагаемия пик на кемпферола, изпарява се до сухо, ресуспендира се в DMSO и се прибавя към in vitro СМ средата, където предизвиква пълен отговор на покълване и растеж на тръбата от CMF полена. Повторна хроматография на тази активна фракция с автентичен кемпферол за стандарт, потвърждава, нейната чистота и идентичност. От този анализ на 150 близалца, съдържанието на кемпферол в близалцата на 026 се изчислява на 60 нг/близалце,, Като приемем, че обема на близалцето е 34 ^л (водоизместимост), флавоноловата концентрация в близалцата на V26 е около 6 Т'М, нивото на която е способно да предизвика силен отговор на кълняемост. Идентичен анали з на екстракти от събрани заедно 150 CMF близалца или от

500 CMF прашника, не дават пикове в типичните флавоноидни спектри (виж фигура 5В). Екстрактите от полен и прашници от 026 дават хроматограма подобна на тази, показана на фигура 5А и пика на елуента, с Е«реме ва задържане и УВ/видим спектър показателни за кемпферол, когато е добавен към CMF в (ЗМ напълно стимулирано поленово покълване. Този анализ потвърждава, че кемпферола присъства в полена и прашниците на дивия тип.

Стуктурни особености, нужни за запазваща полена активност

--30Екст рактите от полен и близалца от дивия тип на пету-·· ния съдържат други съединения в допълнение към кемпферола, които също могат да стимулират покълването на полено и растежа на тръбата (виж. фигура 5fi). Следните представителни съединения за всички по-големи класове флавоноиди: флавони, флавонони, фла воноли, изофлавоноиди, халкони, антоцианини и катехини, се изследват за запазваща полена активност, както следва» Поленови зърна от петуния се суспендират в ПЕГ 4000 среда за покълваме (GM) при гъстота 1-2x10 /мл и 100у(л аликвота от суспенсията се накапват в ямки на 96-ямково микротитърно блюдо и се инкубират на стайна температура при разклащане ISO об/мин. Което и да е допълнително съединение се добавя директно към GN преди прибавянето на полена. Базовите разтвори на флавоноидите и другите химикали се приготвят директно в диметилсулфоокис (DMSO) и се прибавят към всяка ямка при крайни концентрации посочени в след9ващата таблица 3. Концентрацията на DMSO се поддържа постоянна във всеки опит на 17.» Полена се счита за покъл нал, когато тръбата е дълъга повече от диаметъра на едно паленово зърно. На практика, всички зърна, които покълват про~ дуцират тръба по-дълга от диаметрите на 5 поленови зърна. Петуния V26, като е описана в пример 1, продуцира два типа полен; около 257. от зърната са малки, без вътрешни особености и никога не покълват in vitro. Следовг^телно непълното покълвана в V26 се осъществява, когато 757. от цялото количество поленови зърна покълнат. СМЕ полена от петуния от пример 1 поддържа същото съотношение, В повечето опити за запазване, максималната честота на покълвана е 897, от жизнеспособните зърна, След 4 часа инкубиране, се преброяват минимум 1000 поленови зърна при всяко изследване. Най-ниската концентрация на изпитваните? съединения, нужна за да се получи отговор на покълвано са отбелязани в следващата Таблица 3, където RN означава няма отговор. Съединенията,които причиняват <20% покълваме при 100 са отбелязано с >100 ^М. В допълнение на изброените в таблица 3 съединения, са изпробвони и не възбуж дат отговор и не~флавоноидите р-кумарова киселина, салицилова киселина, хидроминон, хлорогенна киселина, дихидроаскорбинова киселина, нафтилфталминова киселина (NFA), 1-нафталиноцетна киселина (NAA), индол-З-оцетна киселина (IAA) и ги бе¹ релинова киселина (ВАЗ)

ТАБЛИЦА 3

Концентрация за отговор заместен въглерод

Съединение		ЕТ о	7		.·»	4’	5'“	(/\|М)
Флавоноли (Сод-СОД
галангин	ОН	он	он					1
кемпферол	он	он	он			он		1
Iso-рамнетин	он	он	он		осн^	он		1
кварцетин	он	он	он		он	он		10
морин	он	он	□н	он		он		10
мирицетин	он	он	он		он	он	он	1 оо
фи зетин	он		он		он	он		100
3-хи д р о к с и фл авон	он							> 1 оо
Дихидровлавоноли (С,-	с₃)
таксифолин	он	он	он		он	он		>100

7-хидроксифлавон

0Н

NR апигенин

ОН

0Н

NR

Флавони (С^ =С^ ) флавон

NR (продължение)

лутеолин		ОН
Ф лава но ни (-	Сз )
флаванон
нарингенин		ОН
ериодиктиол		ОН

ОН	ОН	ОН	NR
			HR
ОН		ОН	NR
он	ОН	он	NR

R-заместените позиции

Както е посочено в таЗлица 3 отговарят на флаваноиди с формула!

Както се вижда от таЗлица 3, агликоновите флавоноли успешно възстановяват максималната честота на покълвано и ка.....

пацитет на растеж на тръЗите на CMF полена, но измежду другите класове флавоноиди, единствено тясо свързаните дихидрофлавонол, таксифолин, продуцират слаЗ отговор ((3187.) при 100 ftM. Допълнително, някалка класа от не-~флавоидните съединения се изпробват, включително фенолни киселини, анти-оксиданти, и регулатори на растежа на растенията, но нито един не способен да запази попълването на полена. Следователно, способността на запазване на поленовата функция при физиологично показателни концентрации се състои във флавонолите.

От групата на изпробваните флавоноиди, се появяват пет

4.

’„“ί.

общи структурни характеристики като нужни за максималната кълняемост на полена и растежа на тръбите. Има абсолютни изисквания за една незаместена хидроксилна група при -3-въглеродно положение и за кето група при позиция 4 в С пръстена. Максималният отговор зависи от една незаместена връзка между въглеродите 2 и 3 в С пръстена и от степента замествания с хидроксилна група в А и В пръстените. Най-интересно, флавонолите гли

козилирани чрез 3 хидрокси позиция са неактивни, въпреки че са далеч най-многоБройната форма флавоноли, открити в растителните нъкани, включително полена и Близалцата на петунията. Не се получава покълваме на полена при изпитания на кверцетин-3-0-глюкозид и рутим <кверцетин-3-0- рамноглюкозид) при концентрации над 100

Нуждата от кето група на позиция 4 в пръстен С произтича от факта, че при хатехин, който няма кето група, липсва активност. Сравнението между относителните ефективности на токсифолина (β18Ζ при 100 Т'М) и кверцетина ((3 507 при .10 fM) показва, че двойната връзка между въглеродите 2 и 3 в С пръстена засилва отговора с около 30 пъти. Сравнението на кверцетин с физетин или с 3-хидроксифлавон показва, че всяка допълнителна хидроксилна група при позиция 5 или 7 на пръстен А, засилва отговора с около 10 пъти. Това засилване може широко да зависи от стабилизиращия ефект на взаимодействието между 5 хидрокскилната група и прилежащата кето група в С пръстена. Накрая, хидроксилните замяни върху В пръстена не са задължителни за пълната активност, а в същност увеличаването на

Броя на ферол с кверцетин и мурицетин)

Разликата мвоже да се дължи на слабото увеличение или нарастване на неспецифичното свързване, групите причинява отслабване на активноста сравнение на кемппричинено от по-полярното естество на флавонолите с многоброй ни хидроксилни групи

Някои не-активни флавоноиди са описани като антагонисти на влавоноидната индукция на гените ленчуковата система (Djordjevic, М.А.,

Redmond, J.W., Batley,

1987, ЕМВО 6:1173-1179; Peters,

1988, Plant Physiology 88:396-400)= He активните съединения при функцията и зслвдват за тяхната проявяват антагонизъм към действието на флавонолните агликони, както следва. CMF полена.

катко е описан е пример 1, се подлага на действието на неактивни съединения, при концентрации от 1 до .1.0^

, в продължение на 30 минути преди да се добави кемпферола към 1 ys|M= Експеримента се осъществява също така и чрез едновременно прибавяне към поленовата суспенсия, както на неактивното съединение, та.....

ка и на кемпферола при отнасяне 10:1= Честотата на поланова кълняемост се изчислява след 4 часово инкубиране и не? се установява антагоностично действие при коя да е от изпробваните комбинации. Анализират се следните неактивни съединения: апигенин, халкон, вриодектиол, флавон, флаванон, лутеолин, нарингенин, катехин, хлорогенна киселина, р-кумарова киселина, хидрохинон и салицилова киселина.

ПРИМЕР 6

УВ ВЪЗДЕЙСТВИЕ

От части заради тяхните способности за абсорбция на

УВ, се определя, че флавоноидите действат като предпазващи от

ЧВ в растенията (W. Jahnen and К. Hahlbroch, 1988, Planta 173:

453 и тук направените отпратки). За да се определи дали липсата на кълняемост при полека с флавоноидна недостатъчност се дължи на ЧВ ефекта, се осъществяват експерименти за покълване на тъмно с три вариации. Полена се събира ито са събирани и запазени (във вода) при дължение на 24 часа или (2) свежо набрани пълна тъмнина в процветя. Поленсви сус пенсии от тези два източника, в GM, с или готвят на тъмно, като се използува безопасна червена светлина.

Третият вариант се нуждае от приготвянето на поленовата суспен™ ия от свежо набраните цветове на светло, но с прибавяне на флавоноловия разтвор на тъмно. Всички индивиди се увиват във фолио, а след това се инкубират както е описано в пример ег

Ня ма забележим ефект на светлината върху честотата на покълване, контролата, така и за полена с флавоноидна недос или без добъвка на флавоноли

За да се определи повлияването на самоопрашваенто от

УВ светлината, зряли петуниеви растения се отглаждат в продъл жение на няколко седмици под 610 нм филтър, както е оисан от □коло две седмици за да се образуват’петуниевите пъпки и да узреят., следователно само тези пъпки, които са образувани след като растенията са постаьезни под филтъръ, и по този начин не са облъчени със светлина над

610 нм, се изследват и се самоспрашват. Не се осъществява засяване със семе от СМЕ само- кръст тосването <10 опита), но всички кръстосвания на V26-контрола се осъществяват при същите условия за пълно засяване в саксии

ПРИМЕР 7

ЕФЕКТ ОТ ВРЕМЕТО

ЗА ИЗЛАГАНЕ НА ФЛАВОНОЛ

Количеството време за подлагане на флавонол, нужно за

пълното покълване и максималното прорастване на тръбата, се определя като варира времето за което покълващия полен е в присъствие на флавонол. Концентрацията на кемпферол, изчислена да дава приблизително максимално запазване, лесно отстраним чрез промиване (0.5 крайна), се прибавя към 60 х 15 мм блюдо, съдържащо суспенсия от 5 мл полен с флавоноидна недостатъчност в GM, и получената суспенсия непрекъснато се разклаща при 150 об/мин. При времето, отбелязано на таблица 4, се отнемат 400 рл аликвоти, центрофугерат се, промиват се с 1 мл GM за отстраняване на кемпферола, отново се центрофугират, ресуспендират се в 400 GM и се разделят на порции. Една 100ув(л аликвотна част отново се прибавя към O.S^t’M кемпферол (контрола), но другата част се остава да прорастне без допълнително излагане на флавонол (третиране). Остава се растежа да продължи в продължение на всичките изминала 4 часа от приготвянето на началната суспенсия, след което се изчислява степента на кълняемост и дължината на тръбата, при двете - третираното и контролното покълване. Резултатите се съдържат в следващата таблица 4:

Третиран полен

ТАБЛИЦА 4

Контрола и з ла г а н е покълване (7.) * (мин?

о	3. /	4- / “	Ч ЕТ 1 . uJ
10	6.6	4-/-	4> “7
20	15.7	4-/-	9» 2
•30	13. 8	4/ —	1.7

дължина на тръбата покълване (7.) *

2х	48.3	+ /-	/*» ег Z. a U
О V	551. 5	+ /--	8.6
:-Зх	47.9	+-/-	7. 0

44.4 !-/38»9 +/- 2.9

47.3 +/- 3.6

48.4 +/- 1.3

47.7 +/- 2.2

-37(продъ лжение)

* означава +/- SEM, п=3 ** отнася се до диаметъра на поленовите зърна

Както се вижда от таблица 4, измереното нарастване на кълняемоста се установява чрез време на излагане само 10 мин (таблица 1)., Време на излагане от 1 до 2 часа е нужно за максимална степен на покълване и дължина на тръбата.

ПРИМЕР 8

IN VIVO ЗАПАЗВАНЕ НА ФЕРТИЛИТЕТА

Способността сам да се възстанови фертилитета на СМЕ петуния чрез прибавян на флавонтол агликон към полена по вре ме на опрашването се изследва чрез преброявай на сполучливите опрашвания, като резултат на само-кръстосване на CMF пету ния, осъществено в присъствие на прибавени флавоноли. Преди само-опрашването, флавонолните агликони се прилагат или (i) директно към близалцето или (ii) размесени със свежо събрания полен. Най-сполучливата техника, измерена чрез количеството посадани семена, изисква прилагането на флавонола към близалцето 12-16 часа преди само-опрашването. Осъществяват се 47 само-кръстосвания с прибавяне на кемпферол или кверцетин, и бли зо 607. (27 извън 47) продуцират семенни шушулки. Броя на семе на за шушулка варира от 31 до 287, а при тедстовете за покълване >907. от семената от всяка една шушулка са жизнистпособни. Всяко само-кръстосване, извършено без прибавяне на флавоноли 030 опита) не води до засаждане на семена.

-38“

Доминантния CHF белег, проявен от петуния с флавоноидна недостатъчност, е тясно свързан с втория доминантен ген, придавъш, резистентност към канамицин (KAN) (Napoli С, Lemieux С and Jorgensen R, 1990, Introduction of a chemeric chaicone synthase gene into petunia results in reversible co-repression of homologous genes in trans., Plant Cell 25 279-289). KAN маркера се използува за тестване на разделянето на CMF характеристиката в семената, продуцирани чрез само-кръстосване на растения с флавоноидна недостатъчност в присъствие на прибавени флавоноли. Прясно събрани семена се подлагат на повърхностна стерилизация в 20% белина, промиват се със стерилна вода и се накисват в продължение на 30 минути в 100 ppm GA3 разтвор преди да се прехвърлят в съдовете за попълване (lxMS, 3mM NFS йрН 5.би, 1хВ5 витаминозна смес, 3% захароза и 0.2% втвърдителен ΰ

агент), съдържащи 100 у»г/мл канамицин. След прорастване при 23 С с прибавка на 16/8 носов фотопериод, се изчислява резистентноста към канамицин чрез скриниране за присъствие на истински листа и странични корени, нито един от които не се продуцира от млади стръкчета, чувствителни към канамицин. В следващата таблица 5, Р-стойност представлява наблюдаваното ниво на значимост за една степен на свобода chi-square goodness-of-fit тест.

ТАБЛИЦА 5 млади стръкчета шушулка общо

KAN Р (3s 1)

ΚΑΝ

1	75	58	17	0.74
	65	50	15	0.83
3	81	59	Е?**?	0. 75

съотношение ΚΑΝ

Както е показано на таблица 5, семената fr/мл канамицин, разделен на резистетност чувствиетелност, както се очаква за хетерозигот ниу доминантен белег, както е показано на таблица 5

ПРИМЕР 9

ПОЛЕВО ИЗСЛЕДВАНЕ

Полевото изследване се осъществява, като се използу-

ва естествено срещащ се в природата мутант на царевица с флавоноидна недостатъчност, бял полен, с дефектна CHS активност, който продуцира бял, не-функционален полен, само-стерилен (Е.Н

Coe, S.M. McCormick, S.A. Modena,

72:318). Използуваните царевични растения жават стабилни рецесивни мутации при С2 и наследствени родители. Растенията бял полен растения,

1981 бял , J. Hered полен прите се поддържат чрез кръстосване с полен от изогенни носещи единично функционално копие на

Растенията са мъжки стерилни при само кръстосвания и не продуцират видими флавоноидни в коя да е тъкан, включително полена и семената

CHS (С2/с2 пигментации

Използуват се стандартни генетични полеви техники, за подсигуряване да не достигне заразен полен свилата на растенията с бял полен. ОсЕен това, блока с бял полен се заобикаля с вариант с пигментирано зърно, така че всяко заразено зърно може незабавно да бъде разпознато. Мутантния бял полен от 50-100 растения се събира от плекчетата върху косата, обединява се, и се разделя на две части. Едната част се използува както си е за кръстосване, а другата се смесва в отношение приблизително 20:1 със сухи флавоноли (кверцетин, кемпферол или смес 50:50 от двата).

—40.....

Приготвената свила с бял пален се опрашват или с нетретирания бя,л полен или с бял полен с прибавка на флавонол, и се незабавно се затварят в торбички, Зрялите класове се събират 45 дена след опрашването. Кръстосванията с бял полен’са обикновено с около 200 зърна на клас, и това число рутинно се постига в допълнителните биохимични само-кръстосвания. Общо се осъществяват 45 само-кръстосвания в присъствие на добавени флавоноли и всички от тях (1005Ω продуцират съвсем пълни класа.....

ве. докато само-кръстосванията (45 опита) извършени без добавка на флавоноиди показват наличие на зърна под 17. от нормалното.

Горепосочените експериманти потвърждават, че флавонолите са нужни за функционирането на полена както следва;

(i) метанолни и водни екстракти от близалца от див тип и полена може напълно да възстанови кълняемоста и растежа на тръбата на полена с флавоноидна недостатъчност; (ii) тези екс тракти съдържат същите флавоноли, които показват активност при in vitro изследването за запазване фертилитета, описано тук;

(i i i ) с пое о б-нос та за спасяване поленовата кълняемост и пълно

то възстановяване на растежа на тръбата in vitro и пълното засаждане на зърната in vivo, се ограничава до спицифичен клас флавоноиди , флавоноловите агликони; (iv> ефективната концен трация на. флавонолите варира според структурата, но някои съединения показват подчертан ефект при степен по-малка от 10 добри при физиологични концентрации на тези съединения.

Флавоноидите се продуцират фактически от всички класове растения, от гъби, мъхове и папрати, до голосеменни и покритосеменни. При предишните проучвания на флавоноидите често се изполбзували сухи листа или коренна тъкан от хербаризи-41

рани индивиди; следователно липсват добри показания за това колко разпространено е било наличието на флавоноиди. Тяхното повсемесно присъствие в растителните тъкани и факта, че флавоноидите са били идентифицирани в поленови екстракти от няколко твърде далечни видове, означава, че флавоноидите са универсална съставна част на полена» Повечето растителни флавоноли се срещат като 3-0-гликозилирани Еидов<е (J.B. Harbome and С. A, Williams, 1988, in The Flavonoids, Advances in Research Since 1980 J.B. Harbome, Eds. (Chapman and Hail, London) chaps. 7, 8), и това е преобладаващата форма в полена на петунията (0. Ceska and E.D. Stylesq 1984, Phytochemistry 23:1822). Единствено ar ли конната форма може да запази тюленовата функция, ко ето предполага, или че нормално присъстват ниски не-уловими количества агликони, или че е нужна гликозидазна активност за продуцирането на агликони, нужни за фертилизацията.

Полена осигурява нормалнто място на достъп за манипулиране на працеса на фертилизация. Загубата на флавонолова активност, коята се получава при CMF растенията, действа като естествен гаметостатик, а не като гаметоцид. Пълната мъжка активност може да бъде възстановена чрез външно приложение на флавоноли към полена с флавоноидна недостатъчност. В допнълнение към фактора, нужен за фертилизацията на висшите растения, значително предимство на настоящето изобретение е развитието на обратима мъжки стерилна система за продуциране на хибридни семена.

Тъй като предпочитаният вариант на изобретението е илюстриран и описан, ще бъде оценено многобройните промен да могат да бъдат направени без да се излиза извън замисъла и обхвата на изобретението.

.. I

Claims

ПЕЕТЕ Η Ц И И

1. Метод за регулиране фертилитета на растенията, характеризиращ се с това, че се блокира продукцията или активноста на флавонолите на ние>ото на полена в растението, за получаване на растени с условно мъжки фертилитет, притежаващо инхибирана способност за покълваме и растеж на тръбата.
2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че продуцирането на флавоноли в растението е блокира- но чрез инхибиране продукцията или активноста на флавоно-3 хидроксилаза в растението.
3., Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, не продуцирането на флавоноли в растението е блокирано чрез инхибиране продукцията или активноста на халкок син тетаза в растението.
4.

Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се това, че включва освен това възстановяване активноста на флафланолите на нивото на полена в растението, за запазване способноста за кълняемост или растеж на тръбата на растението.
5. Метод, съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че включва освен това и възстановяване на продукцията или активноста на флавонон-З-хидроксилаза в растението, за запазване способноста за кълняемост или растеж на тръбата на растението,
6. Метод, съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че включва освен това и въ зстановяване ria продукцията или активноста на халкон синтетаза в растението, за запазване способноста за кълняемост или растеж на тръбата на рас тението

Метод за възстановяване растителния фертилитет на растения.

с условно мъжки фертилитет, с флавоноидна недос татъчност, характеризиращ се това, че полена на рестението се поставя вконтакт с известно количество флавоноли, способни да възстановят фертилитета, ефективни за засилване кълня емоста или растежа на тръбата на растението

8.

Метод, съгласно претенция 7, характеризираш, се с формула:

флавонола, въ зстановяващ фертилитета е съединение характеризираща се с това, че R , R , R , R , R , R и R са водород, хидроксил или алкокси, притежаващи от 1 до 3 атома.
9. Метод, съгласно претенция 8, характеризираш, се с това, че не-повече от два R -R са хидроксил или метокси, а останалите R -R са водорад, и R и R са водород, хидрок си л и ли мето кси.

ίθ. Метод, съгласно претенция 8. характеризиращ се с това, че флавонола, възстановяваш, фертилитета се подбира измежду групата галангин, кемпферол, изи-рамнетин, кверцетин и морин