JPH10508186A

JPH10508186A - Ｇａ４ｄｎａ、タンパク質および使用方法

Info

Publication number: JPH10508186A
Application number: JP8507594A
Authority: JP
Inventors: フイ−ファチャン，; インファンホワン，; エム．グッドマン，ホワード
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 1994-08-16
Filing date: 1995-08-15
Publication date: 1998-08-18
Also published as: CA2197753A1; US5925807A; WO1996005317A1; US6013472A; AU714449B2; AU3244995A; EP0778895A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、GA4座によってコードされるDNAおよびタンパク質に関する。本タンパク質は、種子の発芽、茎の伸長、開花、および結果のような高等植物における種々の生長および発達過程を促進する植物生長ホルモンのジベレリンファミリー(GA)の生合成に関わる酵素ファミリーのメンバーであると考えられる。より具体的には、GA4座によってコードされるタンパク質はヒドロキシラーゼである。本発明はまた、本DNAを含有するベクターおよび宿主細胞における本発明のDNAによりコードされるタンパク質の発現に関する。本発明のさらなる局面では、本発明のDNAまたはアンチセンス配列で形質転換された宿主細胞、本発明のDNAの維持、あるいは発現または発現の阻害のためのこのような宿主細胞の使用、および本発明のDNAを含むトランスジェニック植物に関する。最後に、本発明はまた、植物の生長の局面を改変するためにGA4座によってコードされるタンパク質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 GA4 DNA、タンパク質および使用方法発明の分野本発明は分子生物学および植物生長ホルモン、そして特にジベレリンの分野に関する。発明の背景ジベレリンは、高等植物において、種子の発芽、茎の伸長、開花、および結果のような種々の生長および発達過程を促進する４員環トリテルペノイド植物生長ホルモンの一大ファミリーである(Stowe,B.B.ら、Annu.Rev.Plant Physiol.8:18 1〜216(1957))。多数のGA応答性矮性変異体が、トウモロコシ、エンドウマメ、A rabidopsisのような種々の植物種から単離されている(Phinney,,B.O.ら、「Cmem ical Genetics and the Gibberellin Pathway」、Zea mays L．in Plant Growth Substance P.F.Waering編、New York:Academic(1982)101〜110頁；Ingram,T.I. ら、Planta 160:455〜463(1984)；Koornneef,M.、Arabidopsis Inf.Serv．15:17 〜20.(1978))。トウモロコシの矮性変異体(dwarf-1、dwarf-2、dwarf-3、dwarf- 5)は、生物学的に重要な代謝産物による特異的な段階を決定することによりトウモロコシGA生合成経路を特徴づけることに用いられてきた(Phinney,,B.O.ら、「 Chemical Genetics and the Gibberellin Pathway」、Zea mays L．in Plant Gr owth Substance、P.F.Waering編、New York:Academic(1982)101〜110頁；Fujiok a,S.ら、Plant Physiol.88:1367〜1372(1988))。同様の研究が、エンドウマメ(P isum sativum L.)由来の矮性変異体を用いて行われてきた(Ingram,T.J.ら、Plan ta 160:455〜463(1984))。GA欠失変異体もまたArabidopsisから単離されている( ga1、ga2、ga3、ga4、ga5)(Koornneef,M.ら、Theor.Appl.Genet.58:257〜263(19 80))。Arabidopsis ga4変異体は、エチルメタンスルホン酸(EMS)変異誘発によって誘導されたもので、発芽性GA応答性半矮性であり、その表現型は外因性のGAの反復適用によって野生型へ回復され得る(Koornneef,M.ら、Theor.Appl.Gene t.58:253〜263(1980))。 Arabidopsisにおいて、ga4変異対立遺伝子は3-β-ヒドロキシGAの変換をブロックし、GA₁、GA₈、およびGA₄の内因性レベルを減少させ、そしてGA₁₉、GA₂₀、およびGA₉の内因性レベルを増加させる(Talon,Mら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 :7983〜7987(1990))。3-β-ヒドロキシGAレベルの減少は、ga4変異体の半矮性表現型の原因である。エンドウマメle変異体もまた3-β-ヒドロキシラーゼの変化型をコードすることが示唆されてきた(Ross,J.J.ら、Physiol.Plant.76:173〜17 6(1989))。発明の要旨本発明はまず、GA4 DNAおよびGA4 DNAによってコードされるそのタンパク質に関する。本発明はさらに、GA4アンチセンスDNA、およびそれから転写されたGA4アンチセンスRNAに関する。本発明はさらに、GA4をコードするDNAを含有するベクターおよび宿主細胞中でのGA4 DNAによりコードされるGA4タンパク質の発現に関する。本発明はさらに、GA4アンチセンスDNAを含有するベクターおよび宿主細胞中でのGA4アンチセンスDNAによるGA4アンチセンスRNAの発現に関する。本発明はさらに、本発明のGA4をコードするDNAで形質転換した宿主細胞、および本発明のGA4 DNAを維持するためまたはGA4タンパク質を発現させるためのそのような宿主細胞の使用に関する。本発明はさらに、本発明のGA4アンチセンスDNAで形質転換した宿主細胞、および本発明のGA4 DNAを維持するためまたはGA4タンパク質の発現を阻害するためのそのような宿主細胞の使用に関する。本発明はさらに、本発明のGA4をコードするDNAまたはGA4アンチセンスDNAを含有するトランスジェニック植物に関する。本発明はさらに、本発明のGA4をコードするDNAまたはGA4アンチセンスDNAを用いる植物生長の改変方法に関する。本発明はさらに、本発明の組換え作製GA4タンパク質を用いる植物生長の改変方法に関する。図面の簡単な説明図１：T-DNA標識変異体(Ｔ)はga4座の対立遺伝子である。T-DNA標識対立遺伝子ga4-2(T)およびEMS誘導対立遺伝子ga4-1(ga4)は、GA3処理に応答して、シュートの伸長を生じる(それぞれT+GA₃およびga4+GA₃)。Ｗ、標準野生型、Landsberg er.；Ｔ，ga4-2；およびga4、ga4-1。図２：T-DNA挿入物のga4変異との共分離を示すDNAゲルブロットハイブリダイゼーション分析。半矮性表現型を示す個々のF2(ga4-2×tt2)のF3子孫の葉組織から単離したDNAを、レーン1〜8に示す(８サンプル)。T-DNA挿入物と関連した４つのフラグメントが全ての植物由来のDNA中に見出された。DNAサイズマーカーをKb で示す。Ｌ、標準野生型、Landsberg er.。図３：GA4遺伝子を単離するために用いたゲノムクローン(λT1〜5およびλWT6 )およびサブクローン(pT12、pT34、およびpWT32)の制限酵素地図。Ｈ、HindIII 制限酵素部位。図４：GA4 cDNAクローンのヌクレオチド配列[配列番号１]および推定アミノ酸配列[配列番号２]。cDNAおよびゲノム配列の比較から推定したイントロンの位置を、関係する線上に下向きの矢じり▼で示す。659位のヌクレオチドにおけるEMS 誘導変異を、その位置の上方に星(^*)で示す。下線領域はRNAゲルブロット分析のために用いられるPCR標識プローブの配列を示す。図５：GA4ゲノムDNAのヌクレオチド配列[配列番号３]。イントロンは下線が引かれている。ATG開始コドンを「Ａ」の上方かつ前方に下向きの矢じり▼で示す。TGA終止コドンを「Ａ」の上方かつ後方に星(^*)で示す。図６：GA4とオオムギフラバノン-3-ヒドロキシラーゼ(F3H)[配列番号４]とのアミノ酸配列比較。同一の残基を太字で示す。図７：Arabidopsisの異なる組織(長角果(silique)、花、根、および葉)におけるGA4遺伝子発現のRNAゲルブロット分析。図８：T-ga4(ga4-2)、ga4(ga4-1)およびLan(Landsberg,er)の４週齢ロゼット葉のArabidopsisにおけるga4およびGA4遺伝子発現のRNAゲルブロット分析。図９：外因性GA₃を加えた(+)または加えない(-)ga4-1のArabidopsisにおけるG A4遺伝子発現のRNAゲルブロット分析。ga4-1植物を10^-5M GA₃で噴霧しそして葉サンプルを処理後８時間および24時間後に採取した。定義「GA4」のようなイタリック体の大文字は野生型遺伝子を指し、一方「ga4」のようなイタリック体小文字は変異体遺伝子を指す。「GA4」のような大文字は、GA4遺伝子によってコードされたタンパク質、DNA 、またはRNAを指し、一方「ga4」のような小文字は、変異体ga4遺伝子によってコードされたタンパク質、DNA、またはRNAを指す。「GA_n」(下付き番号を有する)は、「ジベレリンＡ_n」化合物を指す。いくつかのジベレリンＡ_nの化学構造は、Moritz,Tら、Planta 193:1〜8(1994)中に記載される。植物は、被子植物(単子葉植物および双子葉植物)および裸子植物を包含する光合成能のある多細胞分化生物を指すものとして理解されるべきである。植物細胞は、植物の構造的および生理的単位を指すものとして理解されるべきである。用語「植物細胞」は、植物の一部または植物由来のいずれかである任意の細胞を指す。本発明によって包含された細胞のいくつかの例は、生植物の一部である分化細胞；培養中の分化細胞；培養中の未分化細胞；カルスまたは腫瘍のような未分化組織の細胞を包含する。植物細胞子孫は、カルス；茎、根、果実、葉、または花のような植物部分；植物；植物種子；花粉；および植物胚を包含する、植物細胞由来の任意の細胞または組織を指すものとして理解されるべきである。伝播体は、有性増殖または無性増殖し得る、あるいはインビボまたはインビトロ増殖し得る任意の植物材を指すものとして理解されるべきである。そのような伝播体は好ましくは、再生植物のプロトプラスト、細胞、カルス、組織、胚、または種子よりなる。トランスジェニック植物は、その遺伝物質に安定的に取り込ませた外因性DNA を有する植物を指すものとして理解されるべきである。その用語はまた、種々の形態で細胞またはプロトプラストに導入され得る外因性DNAも包含する。種々の形態とは、例えば、環状、線状またはスーパーコイル形態の裸のDNA、ヌクレオソームまたは染色体または核またはそれらの一部分に含まれるDNA、他の分子と複合体化したまたは会合したDNA、リポソーム、スフェロプラスト、細胞またはプロトプラストに封入されたDNAを包含する。分子のフラグメントは、全長配列の使用が所望の目的を達成するために必要ではないような、全長配列のいくらかの所望の化学的または生物学的特性を保有する、アミノ酸配列またはヌクレオチド遺伝子配列の短縮化された配列を指すものとして理解されるべきである。変異は、変異細胞あるいは変異生物を生じさせる娘細胞および多分続く世代にさえも伝達され得る遺伝物質における検出可能な変化を指すものとして、理解されるべきである。変異細胞の子孫が多細胞生物の体細胞にのみ生じるものであれば、細胞の変異スポットまたは変異領域が発生する。有性生殖生物の生殖系における変異は、次の世代にその配偶子によって伝達され得、その結果、体細胞および生殖細胞の両方に新しい変異状態を有する個体が生じる。変異は、化学的または物理的構成、変異性、複製、表現型的機能、あるいは１つ以上のデオキシリボヌクレオチドの組換えに影響する検出可能な非天然の変化(あるいは組合わせ)であり得る；ヌクレオチドが付加、欠失、置換、逆転、または逆位を生じておよび生じずに新しい位置に入れ換え(transpose)され得る。変異は自発的に生じ得、および変異原の適用によって実験的に誘導され得る。核酸分子の変異変動は変異から生じる。変異ポリペプチドは変異核酸分子から生じ得る。種は、実際にあるいは潜在的に異種交雑する天然集団の一群を指すものとして理解されるべきである。核酸分子あるいはタンパク質内の種変動は、種間に生じる核酸配列あるいはアミノ酸配列の変化であり、そしてそれは目的の分子のDNA 配列決定により決定され得る。他のA.thaliana DNA(またはタンパク質)を実質的に含まない調製物とは、唯一のA.thaliana DNA(またはタンパク質)が、目的のA.thaliana DNA(またはタンパク質)のそれである調製物を指すものとして理解されるべきである。サンプル中には他のA.thalianaタンパク質に相同性のあるタンパク質が存在し得るけれども、そのサンプルはなお、そのサンプル中に含まれた相同性のタンパク質がA.th alianaから得られた遺伝子から発現されない限り、他のA.thaliana DNA(またはタンパク質)を実質的に含まないと言われる。 DNA構築物は、組換え人工DNA(線状または環状)を指すものとして理解されるべきである。 T-DNA(転移DNA)は、植物核DNAに組込まれるTi(腫瘍誘導性)プラスミドDNAのセグメントあるいはフラグメントを指すものとして理解されるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、DNAの相補種またはDNAと RNAとの間に少なくとも90％相同性を確立するように、当業者によって通常使用される条件であると理解される。より低い相同性(例えば、少なくとも70％または好ましくは80％)もまた所望され得、ハイブリダイゼーション条件を変化させることにより得られ得る。 DNA変性鎖へのハイブリダイゼーションが生じるためには３つの要件のみが存在する。(1)サンプル中には相補的な単鎖が存在せねばならない。(2)一本鎖DNA の溶液のイオン強度は、塩基が互いに到達し得るようにかなり高くなければならない；操作上、これは0.2Mより高いことを意味する。(3)DNA濃度は、分子間衝突が適切な頻度で生じるのに十分高くなければならない。３番目の条件は、再生/ ハイブリダイゼーションが起こるかどうかではなく、速度にのみ影響を与える。当業者に日常的に用いられる条件は、容易に入手可能な手順テキスト、例えば、本明細書中で参考として援用されるCuurent Protocol in Molecular Biology, I巻,2.10章,John Wiley ＆ Sons発行人(1994)またはSambrookら、Molecular Clo ning,Cold Spring Harbor(1989)に記載されている。当業者に公知であるように、最終的なハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、実際のハイブリダイゼーション条件ならびにハイブリダイゼーション後の洗浄条件を反映し、そして当業者は、所望の結果を得るためのこれらの条件を変化させる適切な様式を理解する。例えば、プレハイブリダイゼーション溶液は、所望の温度および所望のプレハイブリダイゼーション時間で固体マトリックス上の非特異的部位へのハイブリダイゼーションを可能にするために、十分な塩および非特異的DNAを含むべきである。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションのために、そのようなプレハイブリダイゼーション溶液は６×単強度クエン酸(single strength citra te)(SSC)(１×SSCは、0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム;pH7.0である)、5 ×Denhardt溶液、0.05％ピロリン酸ナトリウム、および１ml当たり100μgのニシン精子DNAを含有し得る。次いで、適切なストリンジェントハイブリダイゼーション混合物は、６×SSC、１×Denhardt溶液、１ml当たり100μgの酵母tRNA、および0.05％ピロリン酸ナトリウムを含有し得る。 DNA-DNA分析用の代替的な条件は以下を伴い得る： 1) 室温でのプレハイブリダイゼーションおよび68℃のハイブリダイゼーション； 2) 室温での0.2×SSC/0.1％SDSを用いる洗浄； 3) 所望されるように、42℃での0.2×SSC/0.1％SDSでのさらなる洗浄(中度ストリンジェンシー洗浄)；あるいは 4) 所望されるように、68℃での0.1×SSC/0.1％SDSでのさらなる洗浄(高ストリンジェンシー)。以下の組成を有する公知のハイブリダイゼーション混合物、例えば、ChurchおよびGilbert、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1991〜1995(1984)のハイブリダイゼーション混合物もまた使用され得る：１％結晶グレードウシ血清アルブミン/１m M EDTA/0.5M NaHPO₄(pH7.2)/７％SDS。さらに、代替されるが類似の反応条件がまた、Sambrookら、Molecular Cloning、 Cold Spring Harbor(1989)にも見出され得る。ホルムアミドもまた、所望されるように、プレハイブリダイゼーション /ハイブリダイゼーション溶液中に含有され得る。これらの条件は限定的または制限されることは意図されず、そして所望の目的を達成するために当業者により要求されるように調整され得ることが理解されるべきである。ベクターは、宿主において、本発明の遺伝子のような所望の配列をクローニングまたは発現するための運び屋(vehicle)として使用されるDNAエレメントであると理解されるべきである。宿主または宿主細胞は、本発明のGA4 DNAをコードする配列が取り込まれそして発現される細胞であると理解されるべきである。本発明のGA4遺伝子または本遺伝子のアンチセンスは、形質転換によってベクターの一部として宿主細胞に導入され得る。センスおよびアンチセンスの両DNA配列が、DNAは二重鎖であるため、同一宿主細胞内に存在し得る。しかし、転写の指向は、当業者(artisan)によって設計されたように作動可能に連結されたプロモーターにより指向されるように、２つの鎖のいずれかが最終的にRNAへと複製されることを指令する。詳細な説明 GA4タンパク質配列の遺伝的操作のためのプロセスは、本発明により、GA4タンパク質をコードし得る遺伝配列のクローニングを介して、そしてこのような遺伝配列の発現を介して容易になされる。本明細書中で使用される用語「遺伝配列」とは、核酸分子（好ましくは、DNA）を示すことを意図する。GA4タンパク質をコードし得る遺伝配列は、種々の供給源に由来し得る。これらの供給源としては、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、およびそれらの混合物が挙げられる。ga4ゲノムDNA の好ましい供給源は、植物ゲノムライブラリーであり、そして最も好ましくは、 Arabidopsis thalianaゲノムライブラリーである。GA4 cDNAのより好ましい供給源は、植物cDNAライブラリーであり、そして最も好ましくは、長角果（silique ）科のmRNAから作製されたArabidopsis thaliana cDNAライブラリーである。しかし、このメッセージは植物の根、葉、および花のいたる所で発現される。本発明の組換えGA4 cDNAは、cDNAが成熟GA4 mRNAをテンプレートとして用いて作製された場合、自然に存在するイントロンを含まない。ゲノムDNAは、天然に存在するイントロンを含み得るか、または含み得ない。さらに、このようなゲノムDNAは、GA4遺伝子配列の相同な（同じ供給源より単離される：天然）５'プロモーター領域および／または相同な３'転写終結領域に関連して入手し得る。さらに、このようなゲノムDNAは、GA4 mRNAの相同な５'非翻訳領域を提供する遺伝配列および／または相同な３'非翻訳領域を提供する遺伝配列に関連して入手し得る。植物において、本発明のGA4配列は、T-DNA挿入変異体を用いて同定され得る。 T-DNA挿入変異体において、変異体の表現型は、T-DNA挿入の結果である。このような変異体からのゲノムライブラリーは、T-DNAエレメント、およびT-DNAにより破壊され、従って変異体植物の表現型が導かれた自然の配列を決定するために分析される隣接配列についてスクリーニングし得る。 T-DNAは一般に、カナマイシンの耐性のような耐性選択マーカーを有し、これは、T-DNAを保持する異種交配体の同定に用いられる。このことは、変異体の表現型およびT-DNA挿入物の共分離を確認する。T-DNAがGA4遺伝子部位に挿入されたT-DNA変異体を同定すると、T-DNAはタグになる。このタグにより、ga4変異遺伝子（T-DNA挿入物の両側に隣接する）が単離され得、そして同種の非変異体からのライブラリーまたは他種から作製されたライブラリー中の他のGA4遺伝子の同定に用いられ得る（Waldenら、Plant J.，1:281-288(1991)）。次いで、DNAゲルブロット分析のようなさらなる試験が、T-DNA挿入物が目的の遺伝子（本明細書中ではga4遺伝子）中に存在することの確認のために用いられ得る。本明細書中で例示されるArabidopsis thalianaによれば、本発明のGA4（野生株）およびga4（変異体）遺伝配列の同定に用いられたArabidopsis ga4変異体植物は、３-β-ヒドロキシラーゼと呼ばれるジベレリン生合成経路の酵素が欠損している。従って、本発明のga4変異体におけるT-DNA挿入部位は、ジベレリン生合成経路の３-β-ヒドロキシラーゼをコードするGA4遺伝子内であると考えられる。イントロンを含むGA4のゲノム配列を、図５（配列番号３）に示す。GA4のcDNA 配列を、図４（配列番号１）に示す。同様に、この配列によりコードされるGA4 タンパク質の配列（配列番号２）を示す。ＧからＡへの１塩基変異が、ga4変異体の塩基659位に存在する。これは、実施例に記載されるように、化学（EMS）変異により生じた。このことは、システインからチロシンへのアミノ酸変化をもたらす。ヌクレオチドコード配列の縮重によって、そしてDNAコードが公知である事実によって、図４（配列番号２）に示される同一のアミノ酸配列をコードするすべての他のDNA配列は、本発明の実施において、決定され得、そして用いられ得る。さらに、ストリンジェントな条件下で配列番号１または３にハイブリダイズするこれらの配列はまた、本発明の実施において有用である。 GA4タンパク質またはGA4アンチセンスRNAをコードするDNA配列は、従来技術に従ってDNAベクターに挿入し得る。これには、連結のための平滑末端化または粘着末端化する工程、制限酵素消化して適切な末端を提供する工程、付着末端に適切に埋める工程、アルカリフォスファターゼ処理して望ましくない結合を妨げる工程、そして適切なリガーゼにより連結する工程を包含する。本発明の１つの実施態様において、GA4 mRNAまたはアンチセンスRNAを発現し得る発現ベクターが提供される。多様な宿主系において、所定の配列を増幅するためのベクターは、周知であり、そしてベクターが所望の遺伝配列をコードするDNAまたはRNAを含有し、そして所望の宿主において増幅されるように、当業者によって容易に改変され得る。このようなベクターは、プラスミドおよびウイルスを包含し、そしてこのような宿主は、真核生物ならびに真核細胞（例えば、植物、酵母、昆虫、植物、マウスまたはヒト細胞）および原核生物（例えば、E．coliならびにB．subtil us）を包含する。発現のために抽出され、そして第２の宿主へ形質転換される前に、所望の遺伝配列が利用可能な形態で「保持」されるシャトルベクターもまた有用である。DNA構築物は、本発明のDNAを有するものとして示した。 DNAのような核酸分子は、ポリペプチドまたはアンチセンス配列を「発現し得る」と言われる。これは、核酸分子が、このようなポリペプチドまたはアンチセンス配列をコードする核酸配列、ならびにポリペプチドまたはアンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した転写、そして必要であれば、翻訳調節情報を含む場合である。２つのDNA配列（例えば、プロモーター領域配列およびga4またはGA4遺伝子コード配列またはアンチセンス配列）は、２つのDNA配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない、（２）所望の配列の転写を指向するプロモーター領域配列の能力を妨害しない、または（３）プロモーター領域配列により転写される所望の配列の能力を妨害しない場合、作動可能に連結されると言われる。従って、プロモーターがDNA配列の転写をもたらし得る場合、プロモーター領域は所望のDNA配列に作動可能に連結される。好ましい原核生物宿主としては、E．coli、Bacillus、Streptomyces、Pseudom onas、Salmonella、Serratiaなどの細菌が挙げられる。最も好ましい原核生物宿主は、E．coliである。原核生物宿主は、発現プラスミド内の、レプリコンおよび制御配列と適合性でなければならない。好ましい真核生物宿主としては、植物、酵母、菌類、昆虫細胞、哺乳動物細胞が挙げられる。これら宿主は、従来方法で、例えば、振とうフラスコ、培養器、組織培養プレートまたはボトルにおける増殖により、所望の遺伝配列、またはGA 4もしくはga4タンパク質の産生のために利用され得る。あるいは、植物のような多細胞生物が使用され得る。１つの実施態様において、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体に組み込み得るベクターが用いられる。導入されたDNAを細胞染色体内に安定に組み込んでいる細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによっても選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対して無機栄養（prototrophy）、または殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、または銅のような重金属）などを提供し得る。選択マーカー遺伝子配列は、発現されるDNA 遺伝子配列に直接結合され得るか、またはコトランスフェクションにより同じ細胞内に導入され得る。他の実施態様において、導入された配列は、受容宿主において自律的に複製し得るプラスミドまたはウイルスベクター中に組み込まれる。任意の多種広範なベクターが、この目的のために用いられ得る。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際の重要な要素は、以下を包含する：ベクターを含む受容細胞が認識され、そしてベクターを含まないこれらの受容細胞から選択され得る場合 ;特定の宿主において所望されるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「移動（shuttle）」し得ることが所望されるか否か。所望のタンパク質をコードするDNAは、好ましくは、植物において機能し得るプロモーター領域、転写開始部位、および転写終結部位配列に作動可能に連結される。植物細胞において転写を指向する数多くのプロモーターの内の任意のものが適する。プロモーターは、構成的または誘導的のいずれかであり得る。植物におけるプロモーター機能のいくつかの例としては、天然のTiプラスミド由来のノパリンシンターゼプロモーターおよび他のプロモーター、ウイルスプロモーター（カリフラワーモザイクウイルスの35Sおよび19S RNAプロモーター（Odellら、N ature 313:810-812(1985)）を含む）、ならびに多数の植物プロモーターが挙げられる。使用され得る代替のプロモーターとしては、nosプロモーター、ocsプロモーター、およびCaMVプロモーターが挙げられる。過剰産生性植物プロモーターもまた、使用され得る。GA4遺伝子に作動可能に連結されたこのようなプロモーターは、GA4タンパク質の発現を増加させる。本発明に使用され得る過剰産生性植物プロモーターとしては、大豆由来のリブロース-1,5-ビホスフェートカルボキシラーゼのスモールサブユニット（ss）のプロモーター（Berry-Loweら、J．Molecul ar and App．Gen．1:483-498(1982)）およびクロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの二つのプロモーターは、真核植物細胞中において光誘導性であることが公知である（例えば、Genetic Engineering of Pla nts, an Agricultural Perspective，A．Cashmore，Plenum，New York 1983 29 〜38頁；Corruzi，G.ら、J．of Biol．Chem．258:1399(1983)；およびDunsmuir ，P.ら、J．of Mol．and Applied Genet．2:285(1983)を参照のこと）。植物プロモーターに作動可能に連結された、所望の遺伝子またはアンチセンス配列を含む遺伝配列は、分泌シグナル配列に連結され得る。そして、この構築物は適切なクローニングベクター内に連結され得る。一般に、宿主細胞と適合可能な種由来の複製および制御配列を含むプラスミドまたはウイルス（バクテリオファージ）ベクターが使用される。代表的に、クローニングベクターは、複製起点ならびに形質転換宿主細胞における表現型選択マーカーを提供し得る特定の遺伝子（代表的には抗生物質耐性遺伝子）を有する。選択マーカーを含むトランスジェニック植物細胞を選択するための一般的な方法は、周知であり、そして例えば、Herrera-Estrella，L.およびSimpson，J.「植物における外来遺伝子の発現」、Plant Molecular Biology，A Practical App roach，C.H．Shaw編，IRL Press，Oxford，England，131〜160頁により教示される。他の実施態様において、本発明は、植物細胞中で発現し得るGA4遺伝子をコードするDNAの外因性コピー（すなわち、植物以外に起源を有するコピー）を含む形質転換植物細胞、この場合、この前記植物細胞は、他の外来マーカー遺伝子（好ましくは、他の外来選択マーカー遺伝子）を含まない；植物細胞より再生された植物；植物の子孫または伝播体；および子孫により産生された種子に関する。植物の形質転換技術は、当該分野において周知であり、そして直接形質転換（これは、以下を包含するがこれらに限定されない：マイクロインジェクション（ Crossway，Mol．Gen．Genetics 202:179-185(1985)）、ポリエチレングリコール形質転換（Krensら、Nature 296:72-74(1982)）、高速物体注入（high velocity ballistic penetratoion）（Kleinら、Nature 327:70-73(1987))、プロトプラストと他の存在物（ミニセル、細胞、リソソーム、または融合可能な脂質表層体のいずれか）との融合（Fraleyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:1859-1863( 1982)）、エレクトロポレーション（Frommら、Proc．Natl．Acad．Sci. USA 82: 5824(1985)）、および米国特許第5,231,019号に示される技術）、ならびに本明細書中の記載および以下に記載されるAgrobacterium tumefaciens仲介の形質転換を含む（Hoekemaら、Nature 303:179(1983)、de Framondら、Bio/technology １:262(1983)、Fraleyら、WO84/02913、WO84/02919およびWO84/02920、Zambrysk iら、欧州特許第116,718号、Jordanら、Plant Cell Reports 7:281-284(1988)、 Lepleら、Plant Cell Reports 11:137-141(1992)、Stompら、Plant Physiol．92 :1226-1232(1990)およびKnaufら、Plasmid ８:45-54(1982)）。形質転換の他の方法は、葉片（leafdisk）形質転換技術であり、Horschら、Science 227:1229-1 230(1985)に記載される。形質転換技術は図４（配列番号２）のGA4アミノ酸配列をコードするDNAを利用し得、植物内で発現し得る、図４（配列番号１）のGA4 DNA配列、図５（配列番号３）のGA4ゲノム配列、それらのフラグメントまたはアンチセンス配列を包含する。図４（配列番号２）のGA4アミノ酸配列をコードする遺伝子の範囲内に、本発明のGA4配列の機能誘導体、ならびに変異体、アナログ、種遺伝子（species ）、対立遺伝子および変異誘導体が含まれる。本明細書中で使用されるGA4発現の調節は、タンパク質の天然に存在するレベルの増加または減少を必然的に伴う。特に、GA4をコードするRNAの翻訳は、アンチセンスクローニング技術を用いて減少され得る。一般に、アンチセンスクローニングは、GA4をコードするRNA（センス）に相補的なRNA（アンチセンス）をコードする発現モジュール（module）の作製を必要とする。センス鎖を発現する細胞におけるアンチセンスRNAの発現により、２つのRNA種間のハイブリダイゼーションが生じ、その結果、翻訳が阻止される。あるいは、GA4タンパク質の過剰発現が、適切なプロモーター、エンハンサー、および他の修飾物により達成され得る。当業者は、植物におけるアンチセンス遺伝子の使用を記載する参考文献を知っている（van der Krolら、Gene 72:45-50(19 88); van der Krolら、Plant Mol．Biol．14:467-486(1990); Zhangら、Plant C ell 4:1575-1588(1992)）。代表的に使用される他の外来マーカー遺伝子（すなわち、外因的に誘導された遺伝子）としては、以下の選択マーカーが挙げられる；カナマイシン耐性をコードするneo遺伝子（Potrykusら、Mol．Gen．Genet 199:183-188(1985)）；ビアラホス耐性を示すbar遺伝子；グリホセート耐性をコードする変異体EPSPシンターゼ遺伝子（Hincheeら、Bio/technology 6:915-922(1988)）；ブロモキシニル（b romoxynil）耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子（Stalkerら、J．Biol．Chem. 263 :6310-6314(1988)）；イミダゾリノンまたはスルホニルウレア耐性を与える変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ALS）（欧州特許出願番号第154,204号）；メトトレキセート耐性DHFR遺伝子（Thilletら、J．Biol．Chem．263:12500-12508）、およびβ-グルクロニダーゼ（GUS）またはＲ座遺伝子を単独、もしくはＣ座遺伝子との組み合わせを含むスクリーニングマーカー（Ludwigら、Proc. Natl．Ac ad．Sci．USA 86:7092(1989); Paz-Aresら、EMBO J．6:3553(1987)）。あるいは、所望のタンパク質を発現するための遺伝構築物は、機械的に組換え DNAを転移させるためマイクロピペットの使用により、植物細胞内に直接マイクロインジェクトされ得る。遺伝材料はまた、細胞により取り込まれる遺伝材料との沈澱複合体を形成するポリエチレングリコールの使用により植物細胞内へ直接転移され得る（Paszkowskiら、EMBO J．３:2717-22(1984)）。所望の遺伝子はまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る。（Frommら、「エレクトロポレーションによる単子葉および双子葉植物細胞に転移された遺伝子の発現」Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．82:5824(1985)）。この技術において、植物プロトプラストは、所望の遺伝構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポレートされる。高い場強度の電磁波的衝撃が、可逆的に生体膜を透過性にし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは、細胞壁を再形成し、分裂し、そして植物カルスを形成する。所望の遺伝子を発現する形質転換植物細胞の選択は、上記の表現型マーカーを用いて達成され得る。所望の遺伝子を植物へ導入する他の方法は、所望の遺伝子で形質転換されたAg robacterium tumefaciensを用いて植物細胞を感染させることである。当該分野において周知の適切な条件下で、形質転換植物細胞を生育させ、シュート、根を形成させ、そしてさらに植物へと発育させる。所望の遺伝配列は、Agrobacteriu m tumefaciensのTiプラスミドに連結され得る。Tiプラスミドは、Agrobacterium tumefaciensによる感染で植物細胞に伝播し、そして安定に植物ゲノムに組み込まれる。Horschら、「植物における外来の機能遺伝子の継承」Science，233:496 -498(1984); Fraleyら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A．80:4803(1983); Feld mann，K.A.ら、Mol．Gen．Genet.，208:1-9(1987);Walden，R．ら、Plant J., 1 :281-288(1991)。現在、Agrobacteriumを用いた植物細胞を形質転換するための異なる方法がいくつか存在する。（１）Agrobacteriumと培養された単離プロトプラストとの共培養、または、（２）Agrobacteriumによる細胞または組織の形質転換。方法（１）は、プロトプラストの培養および培養プロトプラストからの植物の再生を可能にする確立された培養系を必要とする。方法（２）は、植物細胞または組織がAgrobacteriumにより形質転換され得ること、および形質転換細胞または組織が完全な植物へ再生されることを誘導し得ることを必要とする。バイナリー系において、感染体を得るために、２つのプラスミドが必要とされる：プラスミドを含むT-DNAおよびvirプラスミドである。しかし、日常的には、植物の形質転換の最も簡単な方法の１つは、外植片接種（explant inoculation）である。これは切片組織を適切な形質転換ベクターを含むAgrobacteriumとのインキュベートを含む（Plant Genetic Transformation and Gene Expression，A Laboratory Manual，Oxford: Blackwell Scientific P ublications(1988); Walden、Genetic Transformation in Plants，Milton Koyn es: Open University Press(1988)）。プロトプラストが単離され得、そして完全な再生植物を与えるために培養され得る植物のすべては、所望の遺伝子の発現に用いられ得る。例えば、適切な植物としては、以下の属由来の種が挙げられる。Fragaria属、Lotus属、Medicago属、Onobrychis属、Trifolium属、Trigonella属、Vigna属、Citrus属、Linum属、G eranium属、Manicot属、Daucus属、Arabidopsis属、Brassica属、Raphanus属、S inapis属、Atropa属、Capsicum属、Datura属、Hyoscyamus属、Lycopersion属、N icotiana属、Solanum属、Petunia属、Digitalis属、Majorana属、Cichorium属、 Helianthus属、Lactuca属、Bromus属、Asparagus属、Antirrhinum属、Hemerocal lis属、Nemesia属、Pelargonium属、Panicum属、Pennisetum属、Ranunculus属、 Senecio属、Salpiglossis属、Cucumis属、Browallia属、Glycine属、Lolium属、 Zea属、Triticum属、Sorghum属、およびDatura属。Agrobacteriumにより形質転換され得るさらなる植物種としては、Ipomoea属、Passiflora属、Cyclamen属、M alus属、Prunus属、Rosa属、Rubus属、Populus属、Santalum属、Allium属、Lili um属、Narcissus属、Ananas属、Arachis属、Phaseolus属、およびPisum属が挙げられる。植物再生技術は、当該分野において周知であり、そして以下の文献で示される技術を包含する；Handbook of Plant Cell Culture、第１〜３巻、Evansら編、M acmillan Publishing Co.、New York、NY（それぞれ、1983、1984、1984）;Pred ieriおよびMalavasi、Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 17:133-142(198 9);James，D.J.ら、J．Plant Physiol．132:148-154(1988);Fasolo ,F.ら、Plan t Cell，Tissue，and Organ Culture 16:75-87(1989);ValobraおよびJames、Pla nt Cell，Tissue，and Organ Culture 21:51-54(1990);Srivastava，P.S.ら、Pl ant Science 42:209-214(1985);RowlandおよびOgden、Hort．Science 27:1127-1 129(1992);ParkおよびSon、Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 15:95-105 (1988);NohおよびMinocha、Plant Cell Reports 5:464-467(1986);BrandおよびL ineberger、Plant Science 57:173-179(1988);Bozhkov，P.V.ら、Plant Cell Reports 11:386-389(1992);Kvaalenおよびvon Arnold、Plant Cell，Tissu e，and Organ Culture 27:49-57(1991);TremblayおよびTremblay、Plant Cell， Tissue，and Organ Culture 27:95-103(1991);GuptaおよびPullman、米国特許第 5,036,007号;MichlerおよびBauer、Plant Science 77:111-118(1991);Wetzstein ，H.Y.ら、Plant Science 64:193-201(1989);McGranahan，G.H.ら、Bio/Technol ogy 6:800-804(1988);Gingas，V.M.、Hort Science 26:1217-1218(1991);Chalup a，V.、Plant Cell Reports 9:398-401(1990);GingasおよびLineberger、Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 17:191-203(1989);Bureno，M.A.ら、Phys．P lant．85:30-34(1992);およびRoberts，D.R.ら、Can．J．Bot．68:1086-1090(19 90)。培養プロトプラストからの植物再生は、以下に記載される；Evansら、「プロトプラストの単離および培養」、Handbook of Plant Cell Culture 1:124-176（ MacMillan Publishing Co.，New York，1983）;M.R．Davey、「植物プロトプラストの培養および再生における近年の進展」、Protoplasts、1983-Lecture Proc eedings、19-29頁（Birkhauser，Basel，1983）;P.J．Dale、「穀物および他の抵抗性作物のプロトプラスト培養および植物再生」、Protoplasts、1983-Lectur e Proceedings、31-41頁（Birkhauser，Basel，1983）;およびH．Binding、「植物の再生」、Plant Protoplasts、21-37頁（CRC Press，Boca Raton，1985）。植物再生のための技術は、種毎において変化するが、一般的に、所望の遺伝子の複数コピーを含む形質転換プロトプラストの懸濁物が最初に提供される。次いで、胚形成が、プロトプラスト懸濁物より、天然の胚と同様の成熟段階および発芽段階まで誘導され得る。一般的に培養培地は、種々のアミノ酸およびホルモン（例えばオーキシンおよびサイトカイニン）を含有する。グルタミン酸およびプロリンの培地への添加もまた有益である（特に、トウモロコシおよびアルファルファのような種において）。形質転換植物細胞より成長した成熟植物は、自殖され、同系交配植物を産生する。同系交配植物は、GA4の増加発現を促進する組換えDNA配列を含む種子を産生する。再生植物より得られる花、種子、葉、枝、実などのような部分は、これらの部分が除草剤耐性細胞を含むならば本発明に包含される。再生植物の子孫および変種体、ならびに変異体もまた、本発明の範囲内に包含される。本明細書中で使用される変種は、変種がアセチル化速度の増加により遺伝耐性植物をさらに含むならば、安定的および遺伝的（性的に植物子孫に伝播される遺伝可能な変化様式を含む）な表現型の変化を説明する。また、本明細書中で使用される変異体は、放射線照射のような環境条件の結果、または十分に確立された遺伝の法則に従い特性が減数分裂的に伝播される遺伝変化の結果としての変種を説明する。本発明のGA4コードDNAを含み、そして他の外来マーカー遺伝子を含まない植物は、一旦植物に挿入された外来マーカー遺伝子の除去が、GA4遺伝子の除去することなく不可能であり得る場合に有益である。発現された外来遺伝子の数を最少化するために、外来マーカー遺伝子が存在しないことがしばしば所望される。このことは、Tiプラスミドの境界間のGA4コードDNAを提供することにより達成され得る。 T-DNA挿入変異体（ga4-2）およびEMS誘導変異体（ga4-1）ともに、遺伝子内に配列変化を含む。変異体の対立遺伝子内の変化は、正常な転写を妨害する。GA4 タンパク質の推定アミノ酸配列は、多様な植物種由来のフラバノン-3-ヒドロキシラーゼおよびACCオキシダーゼの配列に対して類似性を示す（Meldgaard，M.、 Theor．Appl．Genet．83:695-706(1992);Britsch，L.ら、J．Bio.Chem．8:5380- 5387(1992);Deikmann，J.ら、EMBO J．7:3315-3320(1988)）。 GA4遺伝子産物は、3-β-ヒドロキシラーゼであると考えられる。3-β-ヒドロキシラーゼは、茎生長の調節に重要である（Ingramら、Planta 160:455-463(198 4)。従って、本発明のGA4は、富化、およびこのような茎伸長、開花、および結果を容易にするために植物に適用され得る。あるいは、GA4をコードするDNAは、植物宿主中へ遺伝的に挿入され得る。形質転換され得るすべての植物は、本発明の範囲内に包含される宿主であることが意図される（好ましくは、双子葉植物）。例えば、このような植物としては以下の属由来の種が挙げられる；Fragaria属、Lotus属、Medicago属、Onobrychi s属、Trifolium属、Trigonella属、Vigna属、Citrus属、Linum属、Geranium属、 Manihot属、Daucus属、Arabidopsis属、Brassica属、Raphanus属、Sinapis属、A tropa属、Capsicum属、Datura属、Hyoscyamus属、Lycopersion属、Nicotiana属、Solanum属、Petunia属、Digitalis属、Majorana属、Cichorium属、Helianthus 属、Lactuca属、Bromus属、Asparagus属、Antirrhinum属、Hererocallis属、Nem esia属、Pelargonium属、Panicum属、Pennisetum属、Ranunculus属、Sencio属、 Salpiglossis属、Cucumis属、Browalia属、Glycine属、Lolium属、Zea属、Triti cum属、Sorghum属、Malus属、Apium属、Datura属、エンドウのle変異体、Arabad opsisのga4変異体、およびトウモロコシのような単子葉植物のdwarf-1変異体。本発明のGA4 DNAまたはアンチセンス配列を含むトランスジェニック宿主として、本発明の方法に有用な市販の農業作物の例としては、穀類、マメ類、野菜類、および果物類が挙げられ、これらは、ダイズ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、アルファルファ、綿、ナタネ種子、イネ、タバコ、ライムギ、トマト、インゲンマメ（bean）、エンドウマメ（pea）、セロリ、ブドウ、キャベツ、脂肪種子、リンゴ、イチゴ、クワ、ジャガイモ、ツルコケモモ、およびレタスを包含するが、これらに限定されない。これまでに本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示として提供される以下の実施例を参考にしてさらに容易に理解され得る。そして、特定しない限り、これは本発明を限定することを意図しない。実施例実施例１−方法植物、ならびにRNAおよびDNAの単離 ga4変異体をM．Koornneef(Agricultural University，Wageningen，The Nethe rlands)から得た。T-DNA標識ga4変異体を、pBIN19ベクター(Clontech，Palo Alt o，CA，「pBin19 in MC1022」として）を用いたAgrobacteriumの根の形質転換により生成した(Bevan，M.，Nucl．Acids．Res．12:8711〜8721(1984)）。T-DNA標識化および挿入変異誘発は、Waldenら、Plant J.，1:281〜288(1991); Meinke． Dev．Gen.，12:382〜392(1991)に記載されている。植物を、明所16時間／暗所８時間のサイクルを使用して温室条件下で生育させた。DNAおよびRNA単離のための組織を、植え付け後、約３〜４週間で採集し、抽薹する前に液体窒素で凍らせ、そして-70℃で貯蔵した。ゲノムDNAを、Watson，J.C.ら(DNA．Methods．Enzymol . 118:57〜75(1986))の方法を使用して単離した。全RNAを、Ausubel，F.M.ら(Cu rrent protocols in Molecular Biology，New York: Green Publishing Associa tes Wiley Interscience(1989))の方法を使用して単離した。ライブラリーの構築およびスクリーニング T-DNA挿入変異体のゲノムライブラリーga4-2を、λFIX IIベクター（Stratage ne，La Jolla，CA - Stratagene Undigested λFIXII Vector Cloning Kit Inst ruction Manualを参照のこと）中に構築し、そしてGigapack II Goldパッケージ抽出物(Stratagene)を用いてパッケージした。このga4-2ならびにLandsbergゲノムライブラリーおよびLandsberg cDNAライブラリーを、E.coli ER1458株にプレートした(New England Biolabs(Beverly，MA)-Cat．No．401-C，202〜203頁を参照のこと、また、Raleigh，E.A.，Meth．Enzymol.，152:130〜141(1987)およびB ullock，W.O.ら、BioTechniques，5:376〜378(1987)を参照のこと）。あるいは、ArabidopsisゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーは、Arabidopsis Bio logical Resource Center，Ohio State Universityから入手し得る。ゲノムライブラリーをE.coli NM554株にプレートし得、そしてcDNAライブラリーをE.coli Y 1090株にプレートし得る（両方ともStratagene由来）。 DNAゲノムライブラリーは以下のように得られ得る。初めにCsCl DNAを調製し、Sau3AIで部分的に消化する。消化後、部分充填反応を行う。部分充填用反応混合物は、以下の通りである。 40μl DNA 6μl Sau3AI 緩衝液 10× 2.5μl 0.1M DTT 1μl 100mM dATP 1μl 100mM dGTP 5μl クレノウ酵素 4.5μl H₂O 37℃で30分後、反応をフェノール-クロロホルムで終了させると、DNAが得られる。次いで、DNAを0.7％の低融点アガロースゲル上にロードし、電気泳動後、10〜 23kbの間のバンドをゲルから切り出す。次いで切り出したバンドを有するゲルを、67℃で融解する。次いで、単離したDNAを以下の結合混合物中に置く。２μl λFixII、消化前アーム(2μg) １μg ゲノムDNA、部分充填 0.5μl 10×結合緩衝液 0.5μl 10mM ATP(pH 7.05) 0.5μl T4 DNAリガーゼ約1.5μl H₂O(最終容量は５μl) ４℃で一晩結合後、GIGAPACKII GOLDを用いてDNAをパッケージする。プラークリフト(plaque lift)を、Hybondフィルター(Amersham Corp.)を用いて作製し、次いで２分間オートクレーブした。フィルターを、下記のDNAおよびR NAゲルブロット分析について記載しているように、プローブとハイブリダイズした。DNA のサブクローニングおよび配列決定バクテリオファージλDNAを、Grossberger，D.(Nucl．Acids．Res．15:6737(1 987))のmini-prep方法に従ってER1458溶解物から調製した。DNAフラグメントをp Bluescript KS^-ベクター(Stratagene)中にサブクローン化し、それを用いてJM10 9を形質転換した。二本鎖DNAをプラスミドのクローンから単離し、そしてCsClバンディングにより精製した。配列決定を、α-³⁵S-dATPおよびシークエナーゼ(United States Bi ochemical Corp.)を用い、二本鎖DNA配列決定についての製造者のプロトコルに従って行った。配列分析を、Sequence Analysis Software package(Genetics Co mputer Group，Inc.，Madison，WI)およびNational Center for Biotechnology InformationのBlast network service(Bethesda，MD)を用いて行った。DNA およびRNAゲルブロット分析 DNAの電気泳動をTris-酢酸-EDTA緩衝液中で行い、続いて25mM NaHPO₄中でBiot ransフィルター（International Chemical and Nuclear Corp.）に移した。RNA サンプルの電気泳動を、MOPS/EDTA緩衝液を用いてRNAaseインヒビターを含むアガロースゲル中で行い、そしてDNAについてと同様にフィルターに移した。フィルターをStratalinker(Stratagene)を用いてUV架橋し、80℃で１時間、乾かした。放射活性プローブを１ml Sephadex G-50スピンカラムを用いて非組込みヌクレオチドから分離し、電子レンジで変性した(Stroop，W.G.ら、Anal Biochem．182 :222〜225(1989))。１時間のプレハイブリダイゼーションおよび一晩のハイブリダイゼーションを、Church，G.M.ら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:1991-1995 (1984))により記載されたハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃で行った。フィルターを２×SSC中、室温で15分間１回、次いで0.1×SSCおよび0.1% SDS中、6 0℃で30分間２回、洗浄した。湿ったフィルターを、増感スクリーンを用いて-80 ℃でオートラジオグラフィーした。フィルターを、再プロービングの前に２mM T ris-HCl(pH8.0)、１mM EDTA、0.2% SDS中、70℃で30分間、２回、ストリッピングした(Church，G.M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:1991〜1995(1984))。実施例２ ga4 の半矮性T-DNA挿入変異対立遺伝子の特徴付け半矮性変異体を、Agrobacterium tumefaciens媒介の根の形質転換により、Ara bidopsis thaliana(Landsberg erecta)から生成した(Valvekens，D.ら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 85:5536〜5540(1988))。この変異トランスジェニック植物は、外因的に添加されるGA₃に応答してそのシュートを伸長する（図１）。ga4-1 植物(ga4xT)を用いたga4-2植物の相補性分析において、このトランスジェニック植物はga4座の対立遺伝子である挿入変異を有することが明らかになった。Arabi dopsis中に数種の異なるジベレリン応答性変異体が存在し、従って、対立性を試験するために、トランスジェニック植物を、ペア様組合せ(pairwise combinatio n)によりこれらの変異体と交雑した。Arabidopsis中の他の遺伝学的に特徴づけられた半矮性変異体を用いる相補性分析において、トランスジェニック植物とEM S誘導ga4植物(Koornneef，M.ら、Theor．Appl．Genet.58:257〜263(1980)) との間の交雑は、その変異表現型と相補しないことが明らかになった（図１）。従って、トランスジェニック植物における変異はga4座の対立遺伝子である。変異表現型およびT-DNA挿入物の共分離を試験するために、半矮性の特性を示したトランスジェニック変異体のT1子孫を、Arabidopsis tt2植物または野生型C 24のいずれかと異系交雑した(Arabidopsis Biologlcal Resource Center - Ohio State University)。しかし、当業者は、F1子孫を得るために任意のArabidopsi s thalianaを用いてga4-2と異系交雑を行い得ることは公知である。これらの２つの交雑由来の自家受精F2子孫を、T-DNAによりコードされるカナマイシン耐性マーカーの分離について試験した。子孫を50mg/Lのカナマイシンを含む無菌培地で増殖し、カナマイシンの感受性植物に対する耐性植物の比を、その生存度により決定した。両交雑由来の約3/4のF2子孫が、カナマイシンに対して耐性があるので（表Ｉ）、このデータは、トランスジェニック植物中の１つのT-DNA挿入部位が存在することを示す。２つの交雑由来の自家受精F2子孫もまた、変異表現型の分離について試験した。両方の交雑の結果（表II）は、得られたF2子孫の1/4が半矮性表現型を表すことを示し、これは、この半矮性表現型が単一の劣性変異として遺伝されることを示している。これらの２つの独立した試験からのデータは暗示的であるが、ga4対立遺伝子がT -DNAの挿入物により標識されると結論するには不十分である。従って、この挿入物の存在および変異形質とのその連結を、DNAゲルブロット分析によりさらに試験した。実施例３ DNA ゲルブロット分析自家受精F2植物由来の20個のF3子孫（トランスジェニック植物×tt2）を、それらの半矮性表現型から選択し、次いでDNAゲルブロット分析によりT-DNA挿入物および変異表現型の連結についてさらに試験した。DNAを、個体のF3子孫の葉組織から単離し、そしてHindIIIで消化した。アガロースゲルから分離し、転移した後、DNAゲルブロットをT-DNAボーダー(border)配列を含む³²Ｐ標識pBIN19プラスミドでプローブした(Bevan，M.，Nucl．Acid．Res．12:8711〜8721(1984))。このプローブは、T-DNA挿入物の存在を確認したすべての代表的なトランスジェニック植物由来のDNAにハイブリダイズする（図２）。図２に示した結果の場合、DNAをHindIII化し、電気泳動で分離し、ナイロンフィルターに結合させ、次いでT-DNAボーダー配列を含む³²P標識pBIN19プラスミドにハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションパターンは、T-DNA挿入物およびT-DNA／植物接合に相関する。T-DNA挿入物に関連した４つのフラグメントをすべての植物において可視化し（レーン１〜８、図２）、そして半矮性表現型と共分離した。従って、この挿入部位は複合T-DNAユニットを含む。野生型コントロール(Landsberg er) とのハイブリダイゼーションは存在しない。従って、分離試験（表Ｉおよび表II ）およびDNAゲルブロット分析（図２）の両方の分析は、T-DNA挿入物がトランスジェニック植物中の半矮性変異の原因であること(T-DNA標識対立遺伝子をga4-2 と呼ぶ)、およびT-DNA挿入物がga4座にしっかりと連結していること(EMS誘導対立遺伝子をga4-1と呼ぶ)を示す。実施例４ GA4 遺伝子の単離ゲノムライブラリーを、ga4-2植物のF4子孫から単離されたDNAで構築した。すべての構築物をpBluescript KS^-にサブクローン化した。ゲノムクローンλT1-5 を、プローブとして³²Ｐ標識pBIN19ベクターを用いてga4-2ゲノムライブラリーをスクリーニングすることで誘導した。プラーク精製後、クローンλT1-5を、制限酵素分析により特徴付けした（図３）。1.2kbのHindIIIフラグメントサブクローンpT12はT-DNA／植物DNA接合を含み、そしてT-DNA挿入切断点に配列決定することにより、挿入部位を同定するために用いた。ゲノムクローンλWT6を次のように得た。λT1-5中のT-DNA挿入部位に対応するサブクローンpWT32をプローブとして用いて、葉のcDNAライブラリーおよびga4-1 ゲノムライブラリーをスクリーニングした。 T-DNA挿入部位に対応する領域を同定するために、ゲノムクローンのHindIIIフラグメントをプラスミドベクターpBluescript KSにサブクローン化した。1.2Kb のHindIIIフラグメントサブクローンpT12は、T-DNA／植物DNA接合を含み、そしてこれを用いて、T-DNA挿入切断点に配列決定することにより、この挿入部位を同定した。隣接する3.4KbのHindIIIフラグメントサブクローン由来の植物配列pT 34を用いて、対応する野生型ゲノムクローンλWT6を単離した（図３）。λWT6由来の3.2KbのHindIIIサブクローンは、λT1-5中のT-DNA挿入部位に対応する配列を含み、そしてこれをプローブとして用いて、葉のcDNAライブラリーおよびga4- 1ゲノムライブラリーをスクリーニングした。単離された全長ga4ゲノムおよびcD NAクローンスパン配列は、クローンpT34およびpWT32の両方を含んだ。実施例５ヌクレオチドおよびアミノ酸配列 GA4 cDNAは、359のアミノ酸のオープンリーディングフレームを有する1077ヌクレオチドである（図４；配列番号１および配列番号２）。１つの433塩基対イントロンが存在し、このイントロンの位置はcDNAおよびゲノム配列（配列番号３）の比較から推定した。T-DNA／植物DNA接合の配列分析は、T-DNA挿入がイントロン内にあることを示す。この配列分析では、オープンリーディングフレームの２つの可能なAUG開始コドン（ヌクレオチド位置１およびヌクレオチド位置10）が明らかにされ、これらの両方は翻訳開始のための「Kozak」共通配列に相同ら、EMBO J．6:43-48(1987))。決定された配列が確かにGA4座であることを確認するため、他の対立遺伝子ga4 -1由来のゲノムフラグメントを単離し、配列決定した。このga4-1対立遺伝子を、同じ遺伝的背景であるLandsberg er中でEMS変異誘発により生成した。ga4-1の配列分析は、EMS誘導変異がヌクレオチド659で起こることにより（図４）、ＧからＡへの１つのヌクレオチドの変化およびシステインからチロシンへの対応するアミノ酸の変化が生じることを示す。コード領域における、アミノ酸変化に至るこのヌクレオチドの変化は、おそらくga4-1変異に起因している。オオムギのフラバノン-3-ヒドロキシラーゼ(F3H、配列番号４)に対してGA4のアミノ酸配列の配置は、24%のアミノ酸同一性を示す（図６）。図６は、Arabido psis由来のGA4遺伝子およびオオムギ由来のフラバノン-3-ヒドロキシラーゼ(F3H )の推定されるアミノ酸配列の配置を示す(Meldgaard，M.，Theor．Appl．Genet. 83:695〜706(1992))。さらに、ペチュニア(petunia)由来の1-アミノシクロプロパン-1-カルボキシレートオキシダーゼ(エチレン生成酵素)のアミノ酸配列の配置は、18%のアミノ酸同一性を示す（データは示さず）。この配列類似性に基づいて、GA4遺伝子がGA生合成に関与するヒドロキシラーゼ、特に3-β-ヒドロキシラーゼをコードすることが結論される。この結論は、A rabidopsis ga4変異体は3-ヒドロキシ-GAおよび3,13-ヒドロキシ-GAのレベルを減らし、そしていくつかの例外として、13-ヒドロキシ-GAおよび非3,13-ヒドロキシ-GAを蓄積することを示した生化学的研究(Talon，M.ら、Proc．Natl．Acad. Sci．USA 87:7983〜7987(1990))に基づく情報と一致している。ジベレリン生長因子がいたるところに存在する性質のために、同様の活性および遺伝子配列が、農業上重要な穀物（例えば、トウモロコシ、エンドウマメ、オオムギ、ジャガイモ、ダイコン、ナタネ、ムラサキウマゴヤシ、セロリ、ブドウ、キャベツ、レタス、ニンジン、キュウリ、カボチャ、スイカ、コメおよびインゲンマメ）においてGA4に対応する同族遺伝子について見い出されるようである。実施例６ ga4 変異体はga4 mRNAを過剰発現する GA4遺伝子発現のパターンを研究するために、全RNAを異なる組織のタイプから単離し、そしてRNAゲルブロットを³²Ｐ標識PCR GA4特異的プローブとハイブリダイズさせた。1.4Kbの転写物が、根、花および長角果に見られた（図７）。より多くのRNAをゲル上にロードする場合、同サイズの転写物を葉において検出した。このデータを、図８の「Lan」サンプルに示す。この遺伝子は試験された異なる組織（根、葉、花および長角果）中のいたるところで発現するが、このメッセージは長角果において最も豊富である。４週齢ロゼット葉において野生型および変異体の間で区別的な発現が存在する。野生型と比べてEMS誘導ga4-1植物においては、３〜４倍以上のメッセージが発現されるが、T-DNA標識ga4-2植物においては、メッセージは検出されない（図８）。ga4-1植物中で検出されたga4メッセージの過剰発現は、Arabidopsisのロゼット葉上に10^-5Ｍの外因性GA₃の適用により抑制され得る。この転写抑制は、最初の処理後８時間に検出され得、そして24時間まで続く（図９）。 EMS誘導ga4-1変異体および外因性GA₃による転写調節におけるga4メッセージの過剰発現は、ジベレリン生合成経路の調節についていえば、新たな発見である。 Arabidopsisにおける末端ジベレリンはGA₁およびGA₄であり、これらは茎伸長を効果的に引き起こす(Talon，M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:7983〜7987 (1990))。GA₃は、トウモロコシの栄養組織中に低レベルで存在することが示された。GA₃はGA₂₀からGA₅を経て生合成され、そしてGA₁はトウモロコシ中のGA₃の産生物である(Fujioka，S.ら、Plant Physiol．94:127〜131(1990))。Arabidopsis 中でのGA₃の生合成の証拠はないが、実験では、外因性GA₃が、Arabidopsisおよび他の種（例えば、トウモロコシ、キャベツ、マメ、コメ、エンドウマメ、スイカ、カボチャおよびキュウリ）の茎伸長を促進するのに活性であることを示している。この生物学的活性は、GA₃自身または末端GA（例えば、トウモロコシの提案された経路中で示されるようなGA₁）のいずれかにより誘導され得る(Fujioka ，S.ら、Plant Phiysiol．94:127-131(1990))。野生型植物において、細胞のジベレリンの濃度および比率は、合成と利用との間の平衡によって維持される。ga 4-1植物では、この平衡は、変異およびそれに伴う3-β-ヒドロキシラーゼの触媒活性の減少（それぞれGA₉およびGA₂₀の蓄積ならびにGA₄およびGA₁の減少を導く）によって乱される。この変異遺伝子は、タンパク質の変異形態（おそらく不活性または活性が小さい）の翻訳を導くか、あるいは翻訳をまったく導かないかのいずれかである。ga4-1植物において検出されるようなga4メッセージの過剰発現および外因性GA₃による転写の抑制は、転写のフィードバック調節機構を示す。ga4-1植物におけるこれらの結果を説明するための１つの仮説としては、GA4タンパクの調節ドメインはインタクトてあるが、レベルが減少した外因性GA₄およびGA₁は末端GA および外因性GA₃の適用によるフィードバック制御を減らし、このことは、Arabi dopsisにおいて末端GAの蓄積をもたらし、フィードバック機構を回復させる。 3-β-ヒドロキシル化が茎生長の調節に重要であることは、以前に確立されている(Ingram，T.J.ら、Planta 160:455-463(1984))。本発明者らの結果は、活性 GAの特性および区画化が茎生長において重要な役割を果たすことに加えて、分子調節メカニズムもまた、ジベレリン生合成の制御において重要な役割を果たすことを示す。実施例７ GA4 タンパク質の発現 GA4タンパク質を、配列番号１または配列番号３のDNA構築物、あるいはプロモーターに作動可能に連結された配列番号２のアミノ酸配列をコードするDNAを含むDNA構築物で、宿主を形質転換することにより発現させる。このGA4タンパク質を、形質転換宿主細胞中の構築物から発現させる。実施例８植物中での遺伝子発現植物中での遺伝子の発現は、この遺伝子がGA4の同一の時間的および空間的発現パターンを有するように指向される。この遺伝子は、発現モジュールを創出するためにGA4 DNAの調節配列に作動可能に連結され、次いで植物を発現モジュールで形質転換する。実施例９ GA4 タンパク質をコードするRNAの翻訳の調節植物中のGA4タンパク質をコードするRNAの翻訳は、アンチセンスGA4 RNAをコードする発現ベクターを生成することにより調節される。次いで、この植物は、アンチセンスGA4 RNAをコードする発現ベクターでトランスフェクトされる。実施例１０ GA4 タンパク質をコードするDNAのクローニング GA4タンパク質をコードするDNA分子を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下て、DNA配列番号１またはDNA配列番号３の配列またはアンチセンス配列に所望のDNA分子をハイブリダイズさせることによりクローン化する。プローブ配列にハイブリダイズするこれらのDNA分子を選択し、そして宿主細胞に形質転換する。GA4を発現するこの形質転換体を選択し、そしてクローン化する。実施例１１ GA4 タンパク質をコードするDNAをクローニングするためのハイブリダイゼーション条件 GA4タンパク質をコードするDNAをクローニングするためのハイブリダイゼーション条件の１つの可能なセットは以下の通りである：１）１時間プレハイブリダイズさせる；２）ハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃で一晩ハイブリダイズさせる；そして３）室温で２×SSC中で15分間、１回洗浄し、次いで60℃で0.1×SSCおよび0.1%S DS中で30分間、２回洗浄する。実施例１２植物の茎伸長の刺激図４[配列番号２]に示されるアミノ酸配列をコードするDNA構築物をトランスジェニック植物に挿入することにより、植物の茎伸長を刺激する。このトランスジェニック植物は、当該分野で公知のいくつかの方法（本明細書中で前述された方法を含む）のいすれかで産生される。この茎の伸長は、Fragaria、Lotus、Medicago、Onobrychis、Trifolium、Trig onella、Vigna、Citrus、Linum、Geranium、Manihot、Daucus、Arabidopsis、Br assica、RaPhanus、Sinapis、Atropa、Capsicum、Datura、Hyoscyamus、Lycoper sicon、Nicotiana、Solanum、Petunia、Digitalis、Majorana、Cichorium、Heli anthus、Lactuca、Bromus、Asparagus、Antirrhinum、Hererocallis、Nemesia、 Pelargonium、Panicum、Pennisetum、Ranunculus、Sencia、Salpiglossis、Cucu mis、Browalia、Glycine、Lolium、Zea、Triticum、Sorghum、Malus、Apium、およびDaturaにおいて、刺激され得る。実施例１３矮性植物の産生トランスジェニック植物を産生するために、相同性組換えによりGA4遺伝子をブロックすることにより、またはGA4アンチセンスDNAで形質転換することにより、矮性植物を産生する。cDNA配列を用いてアンチセンス構築物を構築し得、次いでこの構築物をAgrobacteriumベクターを用いて植物に形質転換する(Zhangら、P lant Cell 4:1575-1588(1992年12月))。部分的なアンチセンス配列でさえアンチセンスとして用いられ得、そして同族の外因性遺伝子に干渉し得る(van der Kro lら、Plant Mol．Biol．14:457〜466(1990))。この植物を、Valvekensら(Proc． Natl．Acad．Sci．USA 85:5536〜5540(1988))のプロトコルに従って、このアンチセンス構築物で形質転換する。矮性植物は、商業的価値があることは公知である。例えば、リンゴ、サクランボ、モモ、セイヨウナシおよびネクタリンの矮性樹は市販されている(Burpee Ga rdens Catalogue 1994，122〜123頁)。実施例１３分子量マーカー組換え的に産生されたGA4タンパク質を、当該分野で慣用的な方法で精製する( Current Protocol in Molecular Biology、第２巻、10章、John Wiley & Sons, Publishers(1994))。推定されたアミノ酸配列は公知であるので、このタンパク質の分子量を正確に決定し得、そしてこのタンパク質をゲル電気泳動のために分子量マーカーとして用い得る。GA4タンパク質の分子量は、推定されたアミノ酸配列に基づいて計算すると、39.5kDaである。結論本発明者らは、GA4タンパク質の全長ゲノムクローンおよび全長cDNAクローン、ならびにそれらの配列を入手した。GA4座はジベレリン生合成に関与するヒドロキシラーゼをコードすると考えられる。本明細書中で記載されたすべての参考資料は、本開示中で参考として援用される。明示および理解の目的のために、本発明を例示および実施例により、十分に説明してきたので、開示された実施態様に対して一定の変化および改変が行われ得ることは当業者に明らかであり、そしてそのような改変は本発明の範囲内であることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ (72)発明者ホワン，インファン大韓民国 660−701 チンジュ，ゲヨンサンナショナルユニバーシティ，プラントモレキュラーバイオロジーアンドバイオテクノロジーリサーチセンター（番地なし) (72)発明者グッドマン，ホワードエム. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02159，ニュートンセンター，ザレッジーズロード 10

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号２のアミノ酸配列をコードするDNAから本質的になるDNA構築物。２．前記DNAが配列番号１あるいは配列番号３のDNAである、請求項１に記載のDN A構築物。３．配列番号２のアミノ酸配列をコードするDNAを含むDNA構築物。４．前記DNAが配列番号１あるいは配列番号３のDNAである、請求項３に記載のDN A構築物。５．請求項１〜４のいずれか１項に記載の配列を含むベクター。６．請求項５に記載のベクターで形質転換された宿主。７．前記宿主が細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物からなる群から選択される、請求項６に記載の宿主。８．前記宿主が植物細胞である、請求項７に記載の宿主。９．前記植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項８に記載の宿主。１０．請求項８に記載の植物細胞から再生した植物。１１．請求項１０に記載の植物の子孫。１２．請求項１１に記載の植物の伝播体。１３．請求項１１に記載の子孫によって生産された種子。１４．GA4タンパク質を発現するための方法であって、 1）プロモーターに作動可能に連結された請求項１〜４のいずれか一項に記載の構築物で宿主を形質転換する工程； 2）該形質転換宿主細胞中で該構築物の該DNAから該GA4タンパク質を発現させる工程、を包含する、方法。１５．遺伝子がGA4の同一の時間的および空間的発現パターンを有するような、植物における該遺伝子の発現を指向させる方法であって、 1）発現モジュールを創出するために該遺伝子をGA4の調節配列に作動可能に連結する工程、および 2）パート(1)の該発現モジュールで該植物を形質転換する工程、を包含する、方法。１６．植物においてGA4をコードするRNAの翻訳を調節する方法であって、 1）アンチセンスGA4 RNAをコードする発現ベクターを生成する工程； 2）パート(1)の該発現ベクターで該植物をトランスフェクトする工程、を包含する、方法。１７．単離されたDNA構築物であって、該構築物が１つの核酸配列から本質的に成り、そして該核酸配列が： 1）GA4ポリペプチドをコードし、そして 2）ハイブリダイゼーションがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施されるとき、配列番号１または配列番号３のDNAのセンスあるいはアンチセンス配列にハイブリダイズする、 DNA構築物。１８．GA4タンパク質をコードする単離されたDNA分子であって、該DNA分子が： 1）配列番号１のDNAまたは配列番号３のDNAのセンスまたはアンチセンス配列に所望のDNA分子をハイブリダイズさせる工程であって、ここで該ハイブリダイゼーションがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される、工程； 2）該配列にハイブリダイズする該集団のそれらのDNA分子を選択する工程；および 3）該GA4タンパク質をコードするパート(2)のDNA分子を選択する工程、を包含するプロセスによって調製される、DNA分子。１９．請求項１７または１８に記載のGA4タンパク質をコードする単離されたDNA 分子であって、該DNA分子が、 1）１時間プレハイブリダイズさせる工程； 2）ハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃で１晩ハイブリダイズさせる工程；および 3）室温で2×SSC中で15分間、１度洗浄し、次いで60℃で0.1×SSCおよび0 .1％SDS中で30分間、２度洗浄する工程、を包含するプロセスによって調製される、DNA分子。２０．GA4タンパク質をコードするDNA分子をクローニングする方法であって、 1）配列番号１のDNAまたは配列番号３のDNAのセンスまたはアンチセンス配列に所望のDNA分子をハイブリダイズさせる工程であって、ここで該ハイブリダイゼーションがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される、工程； 2）該配列にハイブリダイズする該集団のそれらのDNA分子を選択する工程； 3）宿主細胞にパート(2)の該DNAを形質転換する工程；および 4）該GA4を発現する形質転換体を選択する工程、包含する、方法。２１．請求項２０に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション条件が 1）１時間プレハイブリダイズさせる工程； 2）ハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃で１晩ハイブリダイズさせる工程；および 3）室温で2×SSC中で15分間、１度洗浄し、次いで60℃で0.1×SSCおよび0 .1％SDS中で30分間、２度洗浄する工程、から本質的になる、方法。２２．植物の茎の伸長を刺激する方法であって、トランスジェニック植物中に図４[配列番号２]に示したアミノ酸配列をコードするDNA構築物を挿入する工程を包含する、方法。２３．トランスジェニック矮性植物を生産する方法であって、GA4遺伝子またはC DNAのアンチセンス構築物で植物を形質転換する工程を包含する、方法。２４．３-β-ヒドロキシラーゼレベルの減少によって生じる矮性植物。２５．ga4座の変異を含有する、請求項２４に記載の矮性植物。