JPH07503850A - 組み替えジベレリンｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み替えジベレリンＤＮＡおよびその用途関連特許出願に対するクロス・リファ レンス本出願は、米国特許出願第０７／２８０８６６号（１９８８年１２月７日 出願）の一部継続出願である米国特許出願第０７／６８８５２５号（１９９１年 ６月７日出願）の一部継続出願である米国特許出願第０７／８４４３００号（１ ９９２年２月１８日出願）の一部継続出願であり、これらは全て弓１用して本明 細書の一部とする。

発明の分野。

本発明は組み替えＤＮＡ技術に関するものである。特に本発明１ま、ｅｎｔ−カ ウレン／ンセターゼをコードしているアラビドブ／ス・り１ノアナのＧＡＩＡ伝 子座に対応するゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、係る遺伝子を含む発現ベクター、 係るベクターにより形質転換された宿主、ＧＡＩＡ伝子の調節領域、形質転換植 物において有機的に連結したヘテロローガスな遺伝子の発現を指令するための係 る調節領域の使用、他のＡ　タリアナ蛋白を実質上含まなＬＮＧＡＩ蛋白、ＧＡ ＩＡ白に結合することのできる抗体、ならびに植物細胞および組織にお１するＧ ＡＩＡ伝子の発現およびＧＡＩＡ白の存在を検定する方法に関するものである。

発明の背景。

Ａ、ジベレリン類。

ジベレリン類（ＧＡ）は、種子の発芽、葉の拡大、茎の伸長、開花、および果実 の結実に必要なノテルペノイド植物成長ホルモンの一部である。ＧＡ＋ま多くの 生理学的および生化学的研究の主題であり、ＧＡＡ合成また（ま応答のｌくター ンカベ変更された種々の植物突然変異体が研究されてきた（Ｊ、Ｅ、グラーベ、 アニュアル・レビュー・オブ・プラント・フイジオロノー、３８巻４１９−４６ ５頁（１９８７））。しカルながら、ＧＡ合成に関わる遺伝子１ままた全くクロ ーニングされていない。

ＧＡ突突変変異体最も広範な遺伝子的研究の一つは、コーンコーン等（七オレテ ィカル・アンド・アプライド・ジエネテイクス、５８巻２５７−２６３頁（１９ ８０）　；　：！−ンニ−７等、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ、、４１巻５７ −６８頁（１９８３））によって、小型のアブラナ科植物アラビドプンス・タリ アナにおいてなされている。エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）および高速中 性子突然変異生成を用いて、コーンコーンは、Ａ　タリアナのＧＡＩＡ伝子座に 位置付けられる９個の対立遺伝子を分離した（コーンニー７等（セオレテイカル ・アンド・アプライド・ジエネティクス、５８巻２５７−２６３頁（１９８０） ：コーンニー７等、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ　、４１巻５７−６８頁（１ ９８３））。

Ａ、タリアナｇａｌ突然変異体は、ＧＡの反復適用によりその表現型を野生型に 転換することのできる、非発芽性、ＧＡ一応答性、雄性不稔矯小形である（コー ンコーンおよびファン・デル・ヴイーン、セオレテイカル・アンド・アプライド ・ノエネティクス、５８巻２５７−２６３頁（１９８０））。コーンコーン等は 、高速中性子衝撃により生成された３つの独立した対立遺伝子（３１，８９，２ ９，９および６．５９）およびエチルメタンスルホナート突然変異生成により生 成された６つの独立した対立遺伝子（ＮＧ４、ＮＧ５、ｄ６９、Ａ４２８、ｄ３ ５２およびＢｏ２７）を使用して、Ａ、タリアナＧＡＩ遺伝子座の遺伝子微細構 造地図を組み立てた（図２Ａ）。高速中性子により生成された突然変異体の一つ 、３１．８９は、図２Ａに示される６つの対立遺伝子に再び結び付けられず、遺 伝子的欠失として分類された（コーンニー７等、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ 、、４１巻５７−６８頁（１９８３））。

ＧＡＩＡ伝子によりコードされている酵素は、ＧＡの生合成における重要な中間 体である（Ｊ、Ｅ　グラーベ、アニュアル・レビュー・オブ・プラント・フイノ オロジー、３８巻４１９−４６５頁（１９８７））ｅｎ　を−カウレンへのゲラ ニルゲラニルビロホスファートの変換に関わっている（バレンゼおよびコーンコ ーン、アンチセンス・インフォメーノコン・サーヴイス、１９巻２５−２８頁（ １９８２）：バレンゼ等、フィンオロジア・ブランタールム、６７巻３１５−３ １９頁（１９８６）：　Ｊ、Ａ、Ｄ、ジーヴアート、プラント・リサーチ゛　８ ６、マニュアル・リポート・オブ・ザ・ＭＳＵ−ＤＯＥ・プラント・リサーチ・ ラボラトリ−１１３０−１３１（イースト・ランンング、Ｍ＋、１９８６））。

ｅｎｔ−カウレン／ンセターゼは様々な植物から部分的に精製されてはいるもの の（ダンカン、プラント・フィジオロジー、６８巻１１２８−１１３４頁（１９ ８１））、そのアミノ酸配列は未だ決定されていない。

幾つかのｇａｌ対立遺伝子における分子の損傷を調べることにより、ＧＡＩ遺伝 子座の遺伝子的および物理的地図の直接的相関が確立され、Ａ、クリアナゲノム のこの領域について、ヌクレオチド当り１０”ｃＭという組み替え率が測定され た（：Ｉ−ンニ−７、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｂ、４１巻５７−６８頁（１ ９８３））。

ｇａｌ突然変異体は時に取得できるとは言え、ＧＡＩ遺伝子のクローニングは依 然として困難である。ＧＡＩ遺伝子およびＧＡ生合成に関わる他の遺伝子をクロ ーニングすることに伴う困難さは、有効な形質転換／選択系が取得できないこと 、ならびに利用し得る蛋白配列が無いことに最も起因するようである。

Ｂ、遺伝子クローニング。

ウィルス、原核生物または真核生物由来の、特定の所望の遺伝子配列を同定しク ローニングする能力は、分子生物学にとって極めて重要なことである。このよう なりローニングされた遺伝子配列は所望の遺伝子産物の発現に使用することがで き、故に触媒作用から遺伝子置換に至る範囲の適用のために使用できる可能性が ある。

所望の遺伝子配列の分離およびクローニングのために様々な方法が開発されてい る。初期の方法は、プロファージ統合部位に対する近位性、自己増殖能、際立っ た分子量、極めて多量であること等といった特異な性質を有する遺伝子配列の同 定および分離しかできなかった（ザ・バクテリオファージ・ラムダ、Ａ、　Ｄ、 バーンエイ編、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリン グ・ハーバ−１ＮＹ　（１９７１）；　Ｊ、Ｈミラー、エクスベリメンツ・イン ・モレキュラー・ジェネティクス、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、 コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ　（１９７２）；モレキュラー・バイオ ロジー・オブ・ザ・ジーン、Ｊ、　Ｄ、ワトスン等、（第４版）、ベンジャミン ／カミングズ、メン口・パーク、ＣＡ　（１９８７）；　Ｊ、ダーネル等、モレ キュラー・バイオロジー、サイエンティフィック・アメリカン・ブッシス、ＮＹ 、ＮＹ　（１９８６））。これらの方法は遺伝子配列の際立った性質に依存する ものであったため、これらは殆どの遺伝子配列の同定およびクローニングには大 抵（または全く）適していなかった。

際立った性質を欠（所望遺伝子配列を同定するために、充分特性決定されている 遺伝系（例えば大腸菌、サツカロミセス・セレヴイシアエ、トウモロコシ、哺乳 動物細胞等）が開発された。この方法によれば、ＵＶ光、ヒドロキシルアミン等 のような化学物質によって（Ｊ、　Ｈ，ミラー、エクスペリメンツ・イン・モレ キュラー・ジェネティクス、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コール ド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ　（１９７２）　、またはトランスポゾン標識 化のような遺伝的手段によって（Ｒ，Ｗ、デイヴイス等、ア・マニュアル・フォ ア・ジェネティック・エンジニアリング、アドヴアンスト・バクチリアル・ジエ ネティクス、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング ・ハーバ−１ＮＹ　（１９８０））　、細胞を突然変異生成させ、識別可能な遺 伝的欠失を有する突然変異体を生成させる。次いで所望の遺伝子配列を、係る突 然変異細胞の遺伝的欠失を補足する（即ち補修する）能力によって同定する。係 る遺伝子同定は、該遺伝子配列の遺伝的特性決定、および、その遺伝子配列を特 定の染色体の領域に位置せしめる遺伝子地図の組み立てを可能にした（ティラー 、バクテリオロジカル・レビューズ、３４巻１５５頁（１９７０））。組み替え ＤＮＡ技術の出現により、このような遺伝的に特性決定された遺伝子配列をクロ ーニングする（即ち物理的に分離する）ことが可能となった。成るゲノムの無作 為なフラグメントを自己増殖するベクター中に導入して、その成員の各々が特異 ｆ；　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを含む遺伝子ライブラリーを作成することができ た（Ｔ、　マニアティス等、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・ マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング ・ハーバ−１Ｎ”ｌ’（１９８２））。係るライブラリーの成員を、突然変異細 胞の欠失を補足することのできるものについてスクリーニングすることにより、 所望の遺伝子配列をクローニングすることができた。

これらの方法は多くの遺伝子配列の同定およびクローニングを可能とするが、こ れらは、識別し得る欠失を付与する突然変異を有する宿生細胞が存在し、且つ該 遺伝子配列が、宿主細胞に入り発現されることのできる遺伝子配列デリバリ−系 （例えばベクター）中にクローニングされ得る場合にのみ使用することができる 。

成る遺伝子配列を物理的に分離する能力は、突然変異またはベクターが存在しな くても所望の遺伝子配列を分離することのできる方法の開発につながった。

このような技術のうち「染色体歩行」として知られる技術においては、特定の対 照配列とハイブリダイズすることのできる遺伝子配列を分離することにより、所 望の配列を取得することができる。次に、最初に分離された配列に隣接し、そし て部分的に重複する遺伝子配列をクローニングするために、この分離された遺伝 子配列を次のハイブリダイゼーション実験の対照配列として使用する。この新た に分離された配列は、最初に分離された配列よりも所望遺伝子配列に物理的に近 いであろう。この工程を、所望の遺伝子配列が得られるまで反復する。理解でき るであろうが、遺伝的突然変異体またはベクターの不在下で遺伝子配列をクロー ニングできるためには、所望配列のヌクレオチド配列または制限エンドヌクレア ーゼ消化プロフィルに関する若干の初期情報が必要である。

別法として、ウィルスまたは細胞の染色体を特性決定して、ヌクレオチド配列ま たは制限エンドヌクレアーゼ開裂データのいずれかに基づく物理的地図（即ちＲ ＦＬＰ地図）を作成することができる。このような地図を使用して、染色体の制 限フラグメントを、これらの遺伝的機能について事前に決定することなくクロー ニングすることができる。

より近年には、鑑別コロニ一または二つの異なるＲＮＡ源またはｃＤＮＡおよび ＲＮＡのいずれかを用いるライブラリー消去ハイブリダイゼーションによって、 分離されたＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーを形成させることにより、その配列が 、分離された蛋白のアミノ酸配列から推定されている合成オリゴヌクレオチド分 子を作成することによって、遺伝子クローニングが達成された。

これらの方法は、突然変異体または遺伝子配列デリバリ−系のいずれかが無くと も使用することができるものの、これらの方法は、所望の配列に天然において結 合している配列が特性決定され且つ分離された場合にのみ、または係る配列の配 列地図または制限地図が得られた場合にのみ、所望遺伝子配列の同定およびクロ ーニングを可能にする。係るデータはしばしば得られないのであるから、これら の方法は、しばしば所望の遺伝子配列の同定およびクローニングに使用できない 。

一つの菌株に存在し別の菌株には存在しない配列のクローニングのための一般的 な二つの試みが記載された。第一の試みである分別スクリーニングは、ドゥロソ フィラからｅＳＣ遺伝子をクローニングするために使用された。ゲノムライブラ リーのレプリカを探索するために、欠失を伴うおよび伴わない菌株由来のゲノム ＤＮＡを使用することは、大きなゲノムに適用することをためられせる技術的困 難性を提起する。さらに、この欠失は、どの反復配列をも含まないゲノムライブ ラリー中の少なくとも一つの挿入物全体に及ばなくてはならない。

第二の試みである競合的ハイブリダイゼーションは、分別スクリーニングに代わ る洗練された方法を提供する。この技術は、ラマー等（セル、３７巻１７１−１ ７７頁（１９８４））により、ヒトＹ染色体に特異的なりローンの分離に用いら れた。この方法によれば、女性由来の過剰の剪断されたＤＮＡを変性させ、男性 由来の少量のＤＮＡと再アニーリングする（男性由来のＤＮＡは粘着末端を有す るよう前もって処理してお（）。男性ＤＮＡの殆どは、剪断されたＤＮＡと再会 合して、粘着末端を欠くクローニングされ得ないフラグメントを生成した。しか しながら、Ｙ染色体に特異なフラグメントは、相補的制限鎖（Ｙ染色体から誘導 された）とのみ再会合できた。したがって、このような再会合は粘着末端を有す るクローニングされ得るフラグメントを形成した。この技術を用いて、デュンエ ーヌ筋ジストロフィー遺伝子座における欠失、および先天性脈絡膜欠如に対応す るＤＮＡが良好にクローニングされた。

不都合なことに、この競合的ハイブリダイゼーション法は充分程度の高い濃縮を もたらさない。例えば、上の実験においては、目的とする配列について約１００ 倍の濃縮が得られた。このような低い値では、この技術は大希釈で取り扱う場合 にしか実用的でない。事実、この希釈がゲノムの０．１％に及ぶとしても、多く の陽性と推定されるクローンは、ゲノムサザンプロットを標識し探索することに よって個別に試験しなければならない（Ｊ、サザン、ジャーナル・オブ・モレキ ュラー・バイオロジー、９８巻５０３−５１７頁（１９７５））。このように、 この方法は、そのままでは、小型の原核生物のゲノムを取り扱うのでない限り、 １ｋｂｐ　（キロ塩基対）程度の欠失に対しては実用的ではない。

したがって、要約すると、突然変異によってのみ規定される遺伝子座に対応する ＤＮＡをクローニングできるということは、大腸菌、Ｓ、セレヴインアエまたは 形質転換およびゲノムライブラリーによる相補性が可能である他の生物を用いて 仕事をする場合には、比較的単純な事である。染色体歩行技術は、もしその突然 変異体がトランスポゾン標識化によりて得られるならば、もしその遺伝子座がＲ ＦＬＰ地図中地図−カーに連鎖することができるならば、またはもしそのゲノム についての整列したライブラリーが存在するならば、遺伝的に規定された遺伝子 座をクローニングするために、他の生物に使用することができる。不都合なこと に、Ａ、タリアナのＧＡ合成突然変異体のように、興味深い表現型を有する突然 変異体が分離されてはいるがそのような方法が開発されていない生物が多数有る 。したがって、多くの遺伝子配列は上の方法を用いて分離することができない。

Ｃ０形質転換およびキメラ植物。

近年の組み替えＤＮＡおよび遺伝子技術における進歩は、受容体植物において所 望の遺伝子配列を導入し発現させることを可能にした。このような方法を使用す ることにより、改変されていない植物には通常または天然に存在しない遺伝子配 列を含むよう、植物が作り替えられた。さらに、これらの技術を用いて、天然に 存在する遺伝子配列の発現が変えられた植物が作り出された。

これらの方法の使用により作り出された植物は「キメラ」または「形質転換」植 物のいずれかとして知られている。「キメラ」植物においては、その植物細胞の うち幾らかだけが導入された遺伝子配列を含み、且つこれを発現し、一方他の細 胞は不変のままである。これに対して「形質転換ｊ植物の細胞は全て、導入され た遺伝子配列を含む。

一般に、形質転換植物は、形質転換された単一の植物細胞から作成される。多く の属の植物が単一の細胞から再生されている（Ｗ、フリート等、プログレス・イ ン・ボクニー、４９巻１９２−２１５頁（１９８７）：ｃ、プルノルド等、モレ キュラー・アンド・ジェネラル・ノエネティクス、２０８巻４６９−４７３頁（ １９８７）：Ｊ、デュランド等、プラント・サイエンス、６２巻２６３−２７２ 頁（１９８９）。これらの文献は引用して本明細書の一部とする。）。

植物細胞に外来遺伝子を運搬し、これを発現させる幾つかの方法が開発されてい る。これらは、土壌細菌Ａ　トゥメファシエンス由来の設計されたＴｉプラスミ ド（Ｍ　チャコ等、プラント・モレキュラー・バイオロジー、６巻１０１−１０ ９頁（１９８６）：　Ｊ、Ｄ、Ｇ、’）ａ−ンＸ等、ＥＭＢｏ・ジャーナル、４ 巻２４１１−２４１８頁（１９８５）　）、カリフラワーモザイクウィルスのよ うな設計された植物ウィルス（Ｄ、　Ｍ、ツヤ−等、サイエンス、２３３を４７ ８−４８１頁（１９８６））；　Ｃ，に、ツユ−１イｈ−ＪＦ、’／アイｏｏジ ー、１４０４！２８１−２８８頁（１９８５））　、植物細胞への遺伝子配列の マイクロイフジ２フフ クス、２０２巻１７９−１８５頁（１９８６）：　Ｉ，ホトウリカス等、モレキ ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス、１９９巻１６９−１７７頁（１ ９８５）Ｌ電気穿孔（Ｍ．　Ｅ．　フロム等、ネイチャー、３１９巻７９１−７ ９３頁（１９８６）；Ｈ．モリカワ等、ンーン、４１を１２１−１２４頁（１９ ８６））、およびＤＮＡ被覆粒子加速（Ｍ．ポリツク等、プロトプラズマ、１６ ２巻６１−６８頁（１９９１））を包含する。

形質転換およびキメラ植物の創生のためのこの技術の適用は、古典的な遺伝学を 用いては作り出すことのできない植物を生成させる可能性を有している。例えば 、キメラおよび形質転換植物は、天然遺伝子発現のプローブとして実質的な用途 を持っている。作物に適用する場合には、この技術は、改良された食物、繊維等 を産する可能性がある。

導入された遺伝子配列の特異的な時間的および空間的発現パターンを有するキメ ラおよび形質転換植物を生成することができる。導入された遺伝子配列の発現は 、転写およびまたは翻訳を指令する調節配列の選択を介して時間的または空間的 に調節することができる。

発明の要約。

本発明は、Ａ，タリアナのＧＡＩ遺伝子座に対応する分離されたゲノムＤＮＡお よびｃＤＮＡ，係るＤＮＡを含む発現ベクター、係るベクターにより形質転換さ れた宿主、ＧＡＩ蛋白の発現を制御する調節領域、およびヘテロローガスな遺伝 子の発現を指令するための係る調節配列の使用を目的とするものである。

本発明はさらに、実質上池のＡ、タリアナ蛋白を含まないＧＡＩ蛋白、ＧＡｌ蛋 白を結合することのできる抗体、ならびに係るＧＡＩ蛋白およびこれに対する抗 体の使用に関するものである。

本発明はさらに、ＧＡＩコード化ＤＮＡ配列により形質転換された、またはＧＡ １遺伝子の調節配列により制御されるヘテロローガスな遺伝子により形質転換さ れた、キメラおよび形質転換植物に関するものである。

本発明はさらに、ＧＡｌの発現を検出し、そしてＧＡｌ遺伝子配列と結合する調 節蛋白を分離するための、ＧＡＩ蛋白をコードしている配列およびＧＡＩ蛋白と 結合することのできる抗体の使用に関するものである。

図面の簡単な説明。

図１。本発明の好ましい態様のクローニング方法および濃縮の図式。ＤＮＡは実 線で示し、ビオチニル化ＤＮＡは斜線付きの黒／白線で示し、５ａｕ３ａアダプ ターは白抜きの線で示し、アビジンビーズは点々の付いた円で示し、放射標識さ れたフラグメントは星印を付して示しである。

図２。Ａ．タリアナＧＡＩ遺伝子座の遺伝的および物理的地図。

Ａ：！Ｊ）のＡ，タリアナｇａ−１対立遺伝子（２９．９、ＮＧ５、ＮＧ４、ｄ ６９、Ａ４２８、ｄ３２５、６．５９、ＢＯ２７、３１．８９）の、ｃＭ　Ｘ１ ０Ｍ）遺伝子地図（：ｌ−ンニー７等、Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．Ｃａｍｂ９、４１ 巻５７−６８頁（１９８３））。３１．８９における推定による欠失を水平線に より示す。

Ｂ．ＧＡ１領域の物理的地図。太い水平線は、ＧＡ−１遺伝子座を包含するラン ズバーグ・エレクタＤＮＡのＨｉｎｄｌｌ＋制限地図である。Ｈｉｎｄｌｌｌ制 限部位は、水平線の下に伸びる垂直な印によって示す。太い水平線のすぐ下の数 字は、各々のＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントの大きさをキロ塩基対で表わすも のである。３１．８９における欠失の位置は、斜線を付した囲みによって示す。

制限地図上部の水平線は、λクローンλＧＡＩ−３いプラスミドｐＧＡ１−２（ 特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条 約）の規定に従い、１９９３年１月７日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクシ３ン（ＡＴＣＣ）（ロックヴイル、メリーランド、米国２　０　８　５　 ２）に寄託されＡＴＣＣ受理番号７５３９４号により同定される）およびコスミ ドクローンｐＧＡ１−４　（特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブ ダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従い、１９９３年１月７日、アメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（ロックヴイル、メリーラ ンド、米国２０８５２）に寄託されＡＴＣＣ受理番号７５３９５号により同定さ れる）内に含まれる該配列の範囲を示している。この水平線の下の図式は、１． 　２ｋｂＨｉｎｄｌｌ＋制限フラグメント内のＧＡＩ遺伝子のエクソン（白抜き の囲み）およびイントロン（線）の位置、ならびに対立遺伝子６．５９における 挿入突然変異の位置および対立遺伝子ｄ３５２、Ａ４２８およびＢＯ２７におけ る点突然変異の位置を示している。

図３゜各々３１８９および５．５９ＤＮＡにおける欠失および挿入の検出。

（Ａ）ｐＧＡｌ−１由来の２５０ｂｐＳａｕ３Ａフラグメント（実施例１参照） 、および（Ｂ）３１．８９における欠失領域全体に及ぶ、ｐＧＡｌ−２（ＡＴＣ ＣＮｏ、７５３９４）由来の６ｋｂフラグメント（９１Ｂ）によって探索された サザンプロットに対するオートラノオグラムを示す。プロットＡおよびＢはいず れも、ランズバーグ・エレクタから分離されたＨ４ｎｄｌｌｌ消化ＤＮＡ　（軌 跡１）、ならびに三つのｇａ−１突然変異体、３１．８９（軌跡２）、２９．９ （軌跡３）、および６．５９（軌跡４）を含んでいる。８図中の矢印は、３１． 　８９（４，２ｋｂ）および６．　５９　（１，３および３．３ｋｂ）における 改変されたＨｉｎｄｌｌ＋フラグメントを示す。

図４゜野生型およびＧＡＩ遺伝子を含む形質転換植物の写真およびサザンブロッ ト。

（Ａ）６週齢のＡ　タリアナ・ランズバーグ・エレクタ植物の写真。左から右へ 、ｇａ−１突然変異体（３１，８９）　、ｐＧＡｌ−４（ＡＴＣＣＮｏ、７５３ ９５）由来の２０ｋｂ挿入物を含む形質転換ｇａ−１突然変異体（３１，８９） 、野生型ランズバーグ・エレクタ植物。（Ｂ）ｐＧＡｌ−２（ＡＴＣＣＮｏ。

７５３９４）由来の６ｋｂフラグメント、および（Ｃ）ｐＧＡｌ−４（ＡＴＣＣ Ｎｏ、７５３９５）（図２参照）のためのベクターであるｐＯｃＡ１８ＤＮＡを プローブとしたサザンブロソトについてのオートラノオグラムを示す。プロット ＢおよびＣは、ランズバーグ・エレクタ（Ｂの軌跡１）、コランビア（Ｂの軌跡 ２、Ｃの軌跡ＩＬ　３１．８９　（Ｂの軌跡３、Ｃの軌跡２）、およびｐＧＡ　 １−４　（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９５）により形質転換された二つのＴ３世代形 質転換ｇａ−１（３１，８９）植物（Ｂの軌跡４．５：Ｃの軌跡３．４）からの Ｈｉｎｄｌ１１消化ＤＮＡを含む。

図５゜ＧＡＩ　ｃＤＮＡプローブを用いた２、８ｋｂ　ｍＲＮＡの検出。３２Ｐ −標識された０、９ｋｂ　ＧＡＩ　ｃＤＮＡまたはｃａｂ　ｃＤＮＡ（葉緑素ａ ／ｂ−結合蛋白遺伝子）で探索されたＲＮＡプロットのオートラノオグラム。Ｒ ＮＡは、野生型４適齢植物（軌跡１）、５週齢野生型植物（軌跡２）、未熟な野 生型長角果（軌跡３）、および４週齢ｇａ−１突然変異体３１．８９植物（軌跡 ４）由来のものであった。

図６゜ＧＡＩ遺伝子の部分的ｃＤＮＡ配列（配列番号１）、ＧＡＩ　ｍＲＮＡに 対し相補的なＧＡＩ　ＤＮＡ鎖を５°−３°方向に示す。ＧＡＩ変異体ｄ３５２ は、４２５位のＧの代わりにＡが置換されている外は、示されているものと同一 の配列を有する。ＧＡＩ変異体Ａ４２８は、４２０位のＣの代わりにＴが置換さ れている外は、示されているものと同一の配列を有する。ＧＡＩ変異体ＢＯ２７ は、２４６位のＣの代わりにＴが置換されている外は、示されているものと同一 の配列を有する。

図７゜ＧＡＩ遺伝子の部分的ｃＤＮＡ配列（配列番号２）。示されているＧＡＩ 　ＤＮＡＩＪＩはＧＡＩ　ｍＲＮＡと類似であり、図６に示される鎖に対し相補 的である。ＧＡＩ変異体ｄ３５２は、４７９位のＣの代わりにＴが置換されてい る外は、示されているものと同一の配列を有する。ＧＡＩ変異体Ａ４２８は、４ ８４位のＧの代わりにＡが置換されている外は、示されているものと同一の配列 を有する。ＧＡＩ変異体ＢＯ２７は、６５８位のＧの代わりにＡが置換されてい る外は、示されているものと同一の配列を有する。

好ましい態様の説明。

ゲノム消去を用いて、ＧＡの合成に関わる遺伝子を分離した。ゲノム消去は、あ るひとつの液酸集団に存在し他の集団には存在しない遺伝子配列を濃縮し、そし てクローン的に分離する方法である。ＧＡＩ遺伝子のクローニングを表わす本明 細書に概説される方法に従う時、ＧＡ合成に関わる他の遺伝子を分離することも また可能である。

Ａ、　Ａ　タリアナからのＧＡ−１遺伝子。

ゲノム消去の技術を用いて、Ａ、タリアナのＧＡＩ遺伝子座によりコードされて いるＧＡの合成に関わる遺伝子をクローニングした（以後、ＧＡＩ遺伝子、実施 例１）。

本発明の一つの態様において、ＧＡＩ蛋白をコードしているゲノムもしくはＣＤ ＮＡ　（配列番号１）を含むベクター、またはそのフラグメントが提供される。

特に、係るベクターは、池のＡ、タリアナＤＮＡを実質上歯まない、大量のＧＡ １配列を産生ずることができる。

与えられた配列を様々な宿主系において増殖させるためのベクターは良（知られ ており、且つ、そのベクターがＧＡＩ配列を含み所望の宿主中で増殖するよう、 当業者によって容易に改変されることができる。このようなベクターはプラスミ ドおよびウィルスを含み、このような宿主は真核生物および細胞、例えば酵母、 昆虫、植物、マウスまたはヒトの細胞、ならびに原核生物、例えば大腸菌および Ｂ、スティルスを含む。

本明細書において用いられるように、試料またはベクター中に存在する唯一のＡ 、タリアナＤＮＡがひとつの特異的配列を有する時、その配列は「他のＡ　タリ アナＤＮＡを実質上歯まない」と表現される。

本明細書中使用されるｒＤＮＡ組み立て物」とは、組み替えの、人間が作成した ＤＮＡを意味する。

本明細書中使用される「そのフラグメント」とは、そのＧＡＩ配列全体のうちの 任意のポリヌクレオチド部分集合を意味する。最も好ましいフラグメントは、Ｇ ＡＩによりコードされている酵素の活性部位、またはＧＡＩ蛋白および遺伝子各 々の調節領域を含むフラグメントである。

本発明のさらなる態様において、他のＡ　タリアナ蛋白を実質上歯まない、大量 のＧＡ１蛋白を発視し産生ずることのできる発現ベクターが記載される。

本明細書において用いられるように、試料中に存在する唯一のＡ、タリアナ蛋白 が、発現される蛋白である時、その蛋白は「他のＡ　タリアナ蛋白を実簀上含ま ない」と表現される。他のＡ　タリアナ蛋白に対しホモローガスな蛋白が試料中 に存在したとしても、試料中に含まれるそのホモローガスな蛋白がＡ　タリアナ から得られる遺伝子から発現されない限り、その試料はやはり他のＡ　タリアナ 蛋白を実質上歯まないと言える。

ＤＮＡのような核酸分子は、これが、転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチ ド配列を含み、且つ係る配列が、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配 列と「有機的に連結している」ならば、該ポリペプチドを「発現することができ る」と表現される。有機的な連結とは、調節ＤＮＡ配列および発現がめられるＤ ＮＡ配列が、遺伝子配列の発現を可能とさせるような様式で結合している連結で ある。遺伝子配列の発現に必要な調節領域の正確な性質は生物毎に異なるが、一 般に、原核生物においては、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指令する）およ び、ＲＮＡに転写された時に遺伝子合成の開始信号を送るＤＮＡ配列を、いずれ も含む、プロモーター領域を含んでいるであろう。このような領域は通常、転写 および翻訳の開始に関与する５°−非コード化配列、例えばＴＡＴＡボックス、 キャッピング２列、ＣＡＡＴ配列等を含むであろう。

所望ならば、非コード化領域３′ないしＧＡＩ遺伝子をコードしている遺伝子配 列を上記の方法によって取得することができる。この領域は、終止およびポリア デニル化といったようなその転写終止調節配列を保持していることができる。

したがって、ＧＡＩ遺伝子をコードしているＤＮＡ配列に本来隣接する３゛−領 域を保持することによって、転写終止シグナルを供給することができる。転写終 止ノブナルが発現宿主細胞中で良好に機能しない場合は、その宿主細胞において 機能する３゛領域で置換することができる。

二つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をも たらさず、（２）ＧＡＩ遺伝子配列の転写を指令するプロモーター領域配列の能 力を妨害せず、または（３）プロモーター領域配列により転写されるＧＡＩ遺伝 子配列の能力を妨害しないならば、その二つのＤＮＡ配列（例えばプロモーター 領域配列およびＧＡＩ遺伝子コード化配列）は、有機的に連結していると表現さ れる。即ち、プロモーター領域は、そのプロモーターがＤＮＡ配列の転写を行な うことができるならば、そのＤＮＡ配７１１に対して有機的に連結していること になる。

したがって、ＧＡＩ遺伝子を発現するためには、適当な宿主により認識される転 写および關訳シグナルが必要である。

本発明は、原核生物または真核生物いずれかの細胞におけるＧＡＩ遺伝子蛋白（ またはその機能的誘導体）の発現を包含する。好ましい原核生物宿主は、大腸菌 、バンルス、ストレプトミセス、ツユ−トモナス、サルモネラ、セラティア等の ような細菌を包含する。最も好ましい原核生物宿主は大腸菌である。特に興味深 い細菌宿主は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）　、Ｅ 。

ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０（Ｆ ゛、ラムダ、プロトトロフ（ＡＴＣＣ２７３２５））　、およびその他の腸内細 菌、例えばサルモネラ・ティフィムリウムまたはセラティア・マルセセンス、な らびに種々のシュードモナス種を包含する。このような条件の下で、ＧＡＩ遺伝 子はグリコノル化されないであろう。原核生物宿主は発現プラスミド中でレプリ コンおよび調節配列と共存し得なくてはならない。

原核生物細胞（例えば大腸菌、Ｂ、スブティリス、ンユードモナス、ストレプト ミセス等）中でＧＡＩ遺伝子（またはその機能的誘導体）を発現させるためには 、ＧＡＩ遺伝子コード化配列が機能的原核生物プロモーターと有機的に連結して いることが必要である。係るプロモーターは構成的であるか、またはより好まし くは調節的（即ち誘導的または抑制的）のいずれであってもよい。構成的プロモ ーターの例は、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ −ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーター等 を包含する。誘導的な原核生物プロモーターの例は、バクテリオファージλの主 要な右および左プロモーター（Ｐ、およびＰ、）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ。

１ａｃＺ、Ｉａｃｌおよびｇａｌプロモーター、Ｂ、スブティリスのα−アミラ ーゼ（＋、ウルマネン等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６２巻１７ ６−１８２頁（１９８５））およびシグマ−２８−特異的プロモーター（Ｍ、Ｚ 。

ギルマン等、ノーン、３２巻１１−２０頁（１９８４））、バラルスのバクテリ オファージのプロモーター（Ｔ、Ｊ、　グリッツアン、ザ・モレキュラー・バイ オロジー・オブ・ザ・バンク、アカデミツク・プレス、Ｉ　ｎｃ、　、ＮＹ　（ １９８２））、ならびにストレプトミセスのプロモーター（Ｊ、　Ｍ　ウォード 等、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ンエネティクス、２０３巻４６８−４ ７８頁（１９８６））を包含する。

原核生物のプロモーターはＢ、　Ｒグリツク（Ｊ、Ｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１０．１巻２７７−２８２頁（１９８７））；Ｙ、セナティエンポ（ビオキミー 、６８巻５０５−５１６頁（１９８６））；およびＳ、ゴッテスマン（アニュア ル・レビュー・オブ・ジェネティクス、１８巻４１５−４４２頁（１９８４）） により総説されている。

原核生物細胞における適正な発現には、遺伝子配列コード化配列の上流にリボゾ ーム結合部位の存在が必要である。係るリポゾーム結合部位は、例えばり、ゴー ルド等（アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー、３５巻３６５− ４０４頁（１９８１））により開示されている。

好ましい真核生物宿主は、インビボまたは組織培養のいずれかの、酵母、真菌、 昆虫細胞、哺乳動物細胞を包含する。宿主として有用な哺乳動物細胞は、ＶＥＲ ＯもしくはＣＨＯ−Ｋｌのような繊維芽細胞起源の細胞、またはハイブリドーマ ５Ｐ２１０−ＡＧ１４もしくは骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ｓｇ８のようなリンパ系起源の 細胞、およびそれらの誘導体を包含する。好ましい哺乳動物宿主細胞は、５Ｐ２ １０およびＪ５５８Ｌならびに正しい翻訳後処理のためのより優れた能力を提供 できる１ＭＲ３３２のような神経芽細胞腫セルラインを包含する。

哺乳動物宿主に対して、ＧＡＩ遺伝子の発現のために幾つかの可能なベクター系 が利用できる。宿主の性質に応じて広範囲の転写および翻訳調節配列が使用でき る。この転写および翻訳調節ノブナルは、その調節ノブナルが高い発現レベルを 有する特定の遺伝子配列に付随しているならば、ウィルス起源、例えばアデノウ ィルス、つ／乳頭腫ウィルス、ンミアンウイルス等から誘導することができる。

別法として、哺乳動物の発現産物、例えばアクチン、コラーゲン、ミオンン等か らのプロモーターもまた使用することができる。抑制または活性化を行なう転写 開始調節ノブナルを選択して、その遺伝子配列の発現をモジュレートすることが できる。興味深いのは温度感受性調節／グナルであって、温度を変えることによ り発現が抑制または開始され、または化学的（例えば代謝産物）２１節の支配下 に置かれる調節シグナルである。

酵母は、これが翻訳後ペプチド修飾を実行することもできるという点で、実質上 有利である。酵母中での所望蛋白の産生に利用することのできる高コピー数のプ ラスミドおよび強いプロモーター配列を利用する幾つかの組み替えＤＮＡ法が存 在する。酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子配列産物上のリーダー配列 を認識し、リーダー配列を持つペプチド（即ちプレペプチド）を分泌する。

酵母がグルコースに富む培地で増殖する時に大量に産生される解糖酵素をコード している活発に発現される遺伝子配列からのプロモーターおよび終止要素を含ん でいる一連の酵母遺伝子配列発現系のいずれを利用することもできる。既知の解 糖遺伝子配列は、極めて有効な転写調節シグナルをも提供することができる。

例えば、ホスホグリセラードキナーゼ遺伝子配列のプロモーターおよびターミ不 −ターングナルを利用することができる。

もう一つの好ましい宿主は昆虫細胞、例えばドゥロソフィラの幼虫である。昆虫 細胞を宿主として使用すると、ドゥロソフィラのアルコールデヒドロゲナーゼプ ロモーターが使用できる。Ｇ、　Ｍ、ルピン、サイエンス、２４０巻１４５３− １４５９頁（１９８８）。別法として、バキュロウィルスのベクターを、昆虫細 胞中で大量のＧＡＩ遺伝子を発現するよう設計することもできる（Ｂ、　Ｒ，ン ヤスニー、サイエンス、２３８巻１６５３頁（１９８７）＋Ｄ、ｗ、ミラー等、 ンエネティック・エンジニアリング（１９８６）、Ｊ、に、セットロウ等線、プ レナム、８巻２７７−２９７頁）。

上に論じたように、真核生物宿主中でのＧＡＩ遺伝子の発現には、真核生物の調 節領域が必要である。係る領域は一般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するに足るプ ロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターは、マウスのメタロチオ ネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｄ、ハマー等、ジャーナル・オブ・モレキ ュラー・アンド・アプライド・ジエネティクス、１巻２７３−２８８頁（１９８ ２））、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（Ｓ、　マクナイト、セル、３１ 巻３５５−３６５頁（１９８２））：ＳＶ４０初期プロモーター（Ｃ，ベノイス ト等、ネイチャー（ロンドン）、２９０巻３０４−３１０頁（１９８１））：酵 母ｇａ１４遺伝子配列プロモーター（Ｓ、　Ａ、ノヨンストン等、プロンーデイ ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（ＬＩＳＡ） 　、７９巻６９７１−６９７５頁（１９８２）　；Ｐ、　Ａ、ンルヴアー等、プ ロ／−デイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（ Ｕ　Ｓ　Ａ）、８１巻５９５１−５９５５頁（１９８４））を包含する。

広く知られているように、真核生物のｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコー ドしているコドンにおいて開始する。このため、真核生物プロモーターおよびＧ ＡＩ遺伝子をコードしているＤＮＡ配列の間の連結が、メチオニンをコードする ことのできる（即ちＡＵＧ）いかなる介在コドンをも含まないことを確実にする ことが望ましい。このようなコドンの存在は、融合蛋白（そのＡＵＧコドンがＧ ＡＩ遺伝子コード化ＤＮＡ配列と同じ読み取り枠内にある場合）またはフレーム ノット突然変異（そのＡＵＧコドンがＧＡＩ遺伝子コード化配列と同じ読み取り 枠内にない場合）のいずれかの形成をもたらす。

ＧＡＩ遺伝子コード化配列および有機的に連結したプロモーターは、受容体原核 生物または真核生物細胞中に、非複製ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）分子として導入 することができるが、これは直線状分子であっても、また、より好ましくは共有 結合で閉じた環状分子であってもよい。このような分子は自律的復製ができない ので、ＧＡＩ遺伝子の発現は、導入された配列の一過性発現によって起こり得る 。

別法として、導入される配列を宿主染色体中に組み込むことにより、永続的発現 を起こすことができる。

成る態様において、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体中に統合することので きるベクターが使用される。導入されるＤＮＡを染色体中に安定に組み込んだ細 胞は、発現ベクターを含む宿主細胞を選択させるための１またはそれ以上のマー カーをさらに導入することにより、選択することができる。このマーカーは、栄 養要求性の宿主に対するプロトトロフィー、生物致死剤耐性、例えば抗生物置、 または銅のような重金属等、を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝 子配列は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列と直接連結することができ、または 同時トランスフェクションにより、同じ細胞中に導入することができる。−末鎖 結合蛋白ｍＲＮＡの最適な合成のためには、さらなる要素が必要であるかも知れ ない。これらの要素は、スプライスノブナル、ならびに転写プロモーター、エン ハンサ−１および終止シグナルを包含し得る。このような要素を含んでいるｃＤ ＮＡ発現ベクターは、Ｈ，オカヤマ、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ ロジー、３巻２８０頁（１９８３）により記載されているものを包含する。

好ましい態様において、導入される配列は、受容体宿主において自律的複製が可 能であるプラスミドまたはウィルスベクター中に組み込まれる。この目的のため に広範囲のベクターのうち任意のものを使用することができる。特定のプラスミ ドまたはウィルスベクターを選択する際に重要な因子は、そのベクターを含む受 容体細胞が認識され、該ベクターを含まない受容体細胞から選択されることの容 易さ、特定の宿主中での所望のベクターのコピー数、および、そのベクターが異 なった種の宿主細胞間を「シャトル」できることが望まれるかどうが、というこ とを包含する。好ましい原核生物ベクターは、大腸菌中での複製が可能なプラス ミドを包含する（例えば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１、ｐｓｃｌｏｌ、ｐＡｃＹ Ｃ１８４、πＶＸ０このようなプラスミドは、例えば、Ｔ　マニアティス等（モ レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリ ング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ　（１９８２ ））により開示されている。バンルスプラスミドはｐｃ１９４、ｐｃ２２１、ｐ Ｔ１２７等を包含する。このようなプラスミドは、Ｔ　グリンツアン（ザ・モレ キュラー・バイオロジー・オン・ザ・バラリ、アカデミツク・プレス、ＮＹ（１ ９８２Ｌ　３０７−３２９頁）によって開示されている。好適なストレプトミセ スプラスミドは、ｐｌＪｌｏｌ　（Ｋ、Ｊ　ケンダール等、ジャーナル・オン・ バクテリオロジー、１６９巻４１７７−４１８３頁（１９８７））　、およびφ Ｃ３１のようなストレプトミセスバクテリオファージ（Ｋ、Ｆ　チャタ−等、ン クスス・インターナショナル・ンンポノアム・オン・アクティツマイセターレス ・バイオロジー、アカデミアイ・カイト、ブダペスト、ハンガジー（１９８６） 　、４５−−ズ・オン・インフエクンヤス・ディジーノズ、８巻６９３−７０４ 頁（１９８６））およびＫ　イザキ（ジャパニーズ・ジャーナル・オン・バクテ リオロジー、３３巻７２９−７４２頁（１９７８））によって総説されている。

好ましい真核生物プラスミドは、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０．２ミクロン環 状ＤＮＡ等、またはこれらの誘導体を包含する。このようなプラスミドは当分野 において良く知られている（Ｄ、ボトウノユタイン等、マイアミ・ウィンター・ ノンボジアム、１９巻２６５−２７４頁（１９８２）：Ｊ、Ｒ，ブローチ、ザ・ モレキュラー・バイオロジー・オン・ノ・イースト・サツカロミセス、ライフ・ サイクル・アンド・インへりタンス、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ トリ−、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ、４４５−４７０頁（１９８１ ）：Ｊ、Ｒ，ブローチ、セル、２８巻２０３−２０４頁（１９８２）；Ｄ、ｐ、 ボロン等、ジャーナル・オン・クリニカル・ヘマトロジー・アンド・オンコロジ ー、１０巻３９−４８頁（１９８０）：Ｔ、マニアティス、セル・バイオロジー ニア・コンブリヘンンヴ・トリータス、３巻、ノーン・ンークエンス・エクスプ レッション、アカデミツク・プレス、ＮＹ、５６３−６０８頁（１９８０）’） 。

その組み立て物を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために製造されると、 そのＤＮＡ組み立て物は様々な好適な手段：形質転換、トランスフェクション、 接合、プロトプラスト融合、電気穿孔、燐酸カルシウム沈澱、直接マイクロイン ノエク／ヨン等のうち任意の手段によって適当な宿主細胞中に導入することがで きる。ベクターの導入の後、受容体細胞を、ベクター含有細胞の増殖を選択する 選択培地中で増殖させる。クローニングされた遺伝子配列の発現は、ＧＡＩ遺伝 子またはそのフラグメントの産生をもたらす。これは形質転換されたそのままの 細胞において起こり得、またはこれらの細胞の分化を誘導した後に起こり得る（ 例えば、神経芽細胞腫細胞に対してはブロモデオキシウラシルの投与によって、 等）適当な宿主において発現させた後、このＧＡＩ蛋白は、免疫クロマトグラフ ィーまたはＨＰＬＣのような標準的技術を用いて容易に分離して、他のＡ、タリ アナ蛋白を含まないＧＡＩ蛋白を生成することができる。

染色体歩行技術を使用することにより、当業者は池のＧＡＩの全長ゲノムコピー ならびにＧＡＩコード化領域の５°の調節配列を含むクローンを容易に分離する ことができる。

本明細書中使用される「全長ゲノムコピー」とは、蛋白のコード化領域全体を含 むＤＮＡセグメントを意味する。

本明細書中使用される「調節配列」とは、有機的に連結したＤＮＡ配列の転写お よび／または翻訳を指令することのできるＤＮＡ配列を意味する。係る調節配列 は、プロモーター、リポゾーム結合部位、および調節蛋白結合部位を包含するこ とができるが、これらに限定されない。当業者は、５゛ないしコード化領域に見 いだされる配列を、コ〉・ピユータ−プログラム「モチーフ」および「コンセン サス」により認識されるような既知の調節配列モチーフと比較することによって 、一定の調節配列を容易に同定することができる。

詳細には、本明細書に開示されるＧＡＩＤＮＡ配列を、染色体歩行を介してＡ。

タリアナのゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。Ａ　タリア ナについてのゲノムＤＮＡライブラリーは、市販品が入手可能である（クロンチ ク・ラボラトリーズ・Ｉｎｃ、、およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション）か、または当分野で知られる様々な技術を用いて作成することができ る（サムプルツク等、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュ アル、コールド・スプリング・バーバー・プレス（１９８９））。本明細書に開 示される配列に対し５゛または３′で一部重複し存在するクローンを分離するこ とにより、配列番号１とハイブリダイズする配列を同定し分離した。係る配列は ベクターＰＧＡＩ−４（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９５）およびλＧ、Ａ１−３に含 まれている。

調節配列は、コード化領域に対し５゛に存在する配列である。本発明に係る好ま しい調節配列は、ＧＡＩ開始コドン（ＡＴＧ／Ｍｅ　ｔ）の約−２ｋｂ−Ｏｂｌ ）。

５゛に現われる配列である。より好ましい配列は、約−５００ｂｐ−Ｏｂｐに現 われ、最も好ましい配列は約−２５０ｂｐ−Ｏｂｐに現われる。

当分野において知られる技術および本明細書に記載されるクローンを使用して、 ＧＡＩ遺伝子の機能的誘導体ならびにこの遺伝子の調節配列を生成することが今 や可能である。このような誘導体は、当業者に、所定の生物活性を特異的配列お よび／または構造に結び付け、次いで生物学的または物理的性質の変化した誘導 体を設計し生成させることを可能にする。

ＧＡＩ配列の機能的誘導体の製造は、位置指定突然変異生成により達成すること ができる（サムプルツク等、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・ マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス（１９８９））。位置指 定突然変異生成は、所望の突然変異したＤＮＡ配列を含む特異的オリゴヌクレオ チドの使用により、機能的誘導体の産生を可能にする。

配列の変異を導入する部位は前もって決定するが、突然変異自体は前もって決定 される必要が無い。例えば、所定の部位における突然変異の挙動を最適化するた めに、標的領域において無作為の突然変異生成を実施し、新たに作られた配列を 、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。

このように作り生された機能的誘導体は、ヘテロローガスな遺伝子と有機的に連 結する時、天然に存在する配列と同じ定性的生物活性を表わし得る。しかしなが らこの誘導体は、植物ホルモンに応答した時の誘導のレベルのような性格におい て、実質上具なっているかも知れない。

置換、除去、または挿入の正確な影響を、それがなされる前に予言することは難 しい。当業者は、その誘導体の機能性が常套的スクリーニング検定によって評価 され得ることが理解できるであろう。例えば、位置指定突然変異生成により製造 された機能的誘導体は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のようなリポータ−遺 伝子と有機的に連結することができ、次いでキメラ遺伝子を、キメラもしくは形 質転換植物における、または一過性発現系における植物ホルモン応答性について 定性的にスクリーニングする二とができる。

リポータ−遺伝子およびＧＡＩ！ｌ１１５要素を用いて、ＧＡＩプロモーターの 強さおよび組繊特異性を変える突然変異を作り出すことができる。ＧＡＩ！１節 要素の配列を分析することにより、当業者は、ＧＡ１ブａモーターに存在する様 々な蛋白結合モチーフ、およびこれらの領域に対する直接的突然変異生成活性を 認識するであろう。

本発明に係る別の態様において、ＧＡＩ蛋白と結合する抗体が提供される。

詳細には、ＧＡ１蛋白と結合する抗体を、当分野において知られる技術を用いて 様々な方法で作製することができる。特に、このような方法の一つにおいては、 発現宿主または植物組織のいずれかから精製されたＧＡ１蛋白を用いて適当な哺 乳動物宿主を免疫する。当業者は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗ＧＡ １抗体両方の作製のために既知の方法を容易に適合させることができるであろう （バーロウ、アンティボディーズ、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス（ １９８９））。

別法として、抗ＧＡｌ抗体を合成ペプチドを用いて作製することができる。本明 細書に記載されるＧＡＩ遺伝子によりコードされている推定アミノ酸配列を用い て、適当な宿主に投与される時にＧＡＩ蛋白に結合する抗体が作製されるような 合成ペプチドを作成することができる。

本発明に係る別の態様において、ＧＡＩ遺伝子の発現または細胞もしくは組織に おけるＧＡＩ蛋白の存在を検出するための方法が記載される。

詳細には、本発明に係る抗体およびＤＮＡ配列を用いて、当業者は、インサイト ゥハイブリダイゼーン２ン、ＥＬＩＳＡ、および蛋白または核酸プロッティング 技術のような既知の検定フォーマットを、ＧＡＩをコードしているＲＮＡ、また はＧＡＩ蛋白自体の存在を検出するために容易に適合させることができる。係る 検出系を利用することにより、ＧＡＩ遺伝子を転写または翻訳する特異的組織お よび細胞の同定か可能となる。

Ｂ　その発現がＧＡＩ遺伝子に類似する遺伝子を含む形質転換またはキメラ植物 。

本発明の別の態様においては、該植物が、ＧＡｌと同じ時間的および空間的様式 で発現される１またはそれ以上の外部から供給される遺伝子を含む、キメラまた は形質転換植物を作り出す方法が記載される。

詳細には、キメラまたは形質転換植物は、これが外部から供給される発現モジュ ールを含むように生成される。発現モジュールは、ヘテロローガスな遺伝子と有 機的に連結したＧＡＩ遺伝子の調節要素を含む。

先に述べたように、ＧＡＩ遺伝子の！ｌｌ！５領域は、ＧＡＩ開始コドン（Ｍｅ ｔ）に対し約−２ｋｂないしＯｂｐ、５°の領域に含まれる。当業者は、この領 域を含む発現モジニールまたはそのフラグメントを容易に作り出すことができる 。

ヘテロローガスな遺伝子を調節領域に連結する方法およびこれに続ズヘテロロー ガスな遺伝子の発現は、当分野において良く知られている（ワイスバッハ等、メ ンッズ・フォア・プラント・モレキュラー・バイオロジー、アカデミツク・プレ ス、サンディエゴ、ＣＡ　（１９８８）　）。当業者は、植物細胞形質転換のた めの方法、例えば電気穿孔、Ｔｉプラスミド媒介形質転換、粒子加速、および植 物再生を、ＧＡＩ！！ｉ節要素の利用に容易に適合させるであろう。発現モジュ ールにおいては、全形の再生植物を与えるためのプロトプラストが分離され培養 され得る全ての植物は、本発明に係る発現モジュールをもって形質転換すること ができる。発現の効率は、利用される植物に応じて植物種間で異なるであろう。

しかしながら、当業者は、ＧＡ　１！ｉｔ節要素が機能するであろう植物の種類 を容易に決定することができる。

本発明の別の態様において、キメラまたは形質転換植物中でのＧＡｌをコードし ているＲＮＡの翻訳をモジニレートする方法が記載される。

本明細書中で使用されるモジュレーションとは、天然に起こる翻訳レベルの増強 または低下を包含する。

詳細には、ＧＡＩフード化ＲＮＡの翻訳は、アンチセンスクローニングの技術を 用いて低下させることができる。アンチセンスクローニングは植物系において有 効であることが立証されており、当業者によって容易にＧＡＩ遺伝子の利用のた めに適合させることができるＣオエラー等、サイエンス、２５４巻４３７−４３ ９頁（１９９１））。

一般に、アンチセンスクローニングは、ＧＡｌをコードしているＲＮＡ　（セン ス）に対して相補的なＲＮＡ　（アンチセンス）をコードしている発現モジュー ルの生成を包含する。センス鎮を発現する細胞中でアンチセンスＲＮＡを発現さ せることにより、二つのＲＮＡ種間のハイブリダイゼーションが起こり、結果と して翻訳のブロックをもたらす。

本発明の別の態様において、ＧＡＩ蛋白の活性をモジュレートする方法が記載さ れる。

詳細には、抗ＧＡＩ抗体をコードしている発現モジュールを用いて植物を形質転 換することにより、形質転換またはキメラ植物中でのＧＡＩの活性を抑制するこ とができる。発現された抗体は１ｊｌｌＧＡ１と結合し、その結果、該蛋白の機 能する能力を損なうであろう。

当業者には、抗ＧＡＩ抗体をコードしているＤＮＡが当分野において知られる技 術を用いて容易に得られることが認識できるであろう。一般に、このようなりＮ Ａは、抗ＧＡｌ抗体を産生ずるハイブリドーマから分離されるｍＲＮＡから生成 されるｃＤＮＡとして得られる。係るハイブリドーマを取得する方法は先に記載 した。

Ｃ植物における遺伝子発現の研究のための系。

本発明の別の態様において、ＧＡＩ遺伝子の誘導の原因となる蛋白および分子相 互作用を同定する方法が記載される。

詳細には、ＧＡＩ遺伝子の調節配列を用いて、これらの配列と結合する蛋白を分 離することが可能である。

特異的ＤＮＡ配列と結合することのできる調節因子を分離する方法は当分野で良 く知られている。係る方法の一つは親和クロマトグラフィーである。調節配列を 含むＤＮＡを、セファロースのような適当なマトリックスに固定し、クロマトグ ラフィーにおける親和マトリックスとして使用する（Ｂ、　アーカンジオーり等 、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・バイオケミストリー、１７９巻３５９−３ ６４頁（１９８９））。

ＧＡ　１！ｌｉ節要素を結合する蛋白は、ＧＡＩ遺伝子を発現する植物組織から 抽出することができる。このような方法で得られた蛋白抽出物を、固定化ＧＡＩ ！ＩＩ節領域を含むカラムに適用する。該ＤＮＡ配列に結合しない蛋白をカラム から洗い流し、該ＤＮＡ配列と結合する蛋白を塩勾配を用いてカラムから除去す る。このようにして得られたＤＮＡ結合蛋白は、イオン交換クロマトグラフィー 、高速液体クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーのような 方法を用いてさらに精製することができる。

ＤＮＡ結合蛋白の精製の間に、この蛋白はゲル遅延検定を用いて容易に検定する ことができる・（Ｍ、　Ｍ、ガーナ−等、ヌクレイツク・アシド・リサーチ、９ 巻３０４７頁（１９８１）およびＭ、フリート等、ヌクレイツク・アシド・リサ ーチ、９巻６５０６頁（１９８１））。

ＤＮＡ結合蛋白が精製されると、部分的アミノ酸配列が該蛋白のＮ末端から得ら れる。別法として、この蛋白をトリプンン処理によりマツピングし、一方のフラ グメントのアミノ酸配列を決定することもできる。

次に、推定されたアミノ酸配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを生成させ る。このプローブの配列は、その生物によりてより頻繁に使用される（コドン偏 向）ことが知られているコドンに基づくことができ、または、このプローブは該 ポリペプチドをコードし得る全ての可能なコドンの組合せの混合物から成るよう にすることもできる（縮重）。

このようなプローブを使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのいずれか を、ＤＮＡ結合蛋白をコードしている配Ｆ１１についてスクリーニングすること ができる。ＤＮＡ結合蛋白をコードしている遺伝子が得られると、この結合蛋白 をコードしているＤＮＡの配列を決定することができ、この遺伝子を、発現系を 用いた大量の蛋白の取得のために使用することができ、または、突然変異分析を 実施して、該ＤＮＡと相互作用する蛋白内部の機能的領域をさらに規定すること ができる。

別法として、ＧＡ　１！ＩＩ節要素と結合する蛋白を、サウスウエスタンプロツ ティングの技術を用いて係る蛋白を発現するクローンを同定することにより、分 離することかできる（Ｚ、Ｄ　ノヤーブ等、ビオキミカ・工・ビオフイジ力・ア クタ、１０４８巻３０６−３０９頁（１９９０）、Ｃ，Ｖ、ギュンター等、Ｇｅ ｎｅｓＤｅｖ、　、４巻６６７−６７９頁（１９９０）、およびＭ、　Ｄ、ウォ ーカー等、ヌクレイツク・アンス・リサーチ、１８巻１１５９−１１６６頁（１ ９９０））。

サウスウエスタンプロットにおいては、発現された蛋白をコロニーまたはプラー ク転移によりフィルター上に固定したｃＤＮＡ発現ライブラリーを、標識された ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングした。標識されたＤＮＡ配列は、特定のＤＮ Ａ配列に結合することのできる蛋白を発現するコロニーまたはプラークに結合す るであろう。標識されたＤＮＡ配列に結合する蛋白を発現するクローンを精製し 、ＤＮＡ結合蛋白をコードしているｃＤＮＡ挿入物を分離し配列決定することが できる。分離されたＤＮＡを使用して、さらなる精製および研究のために大量の 該蛋白を発現させ、該ｃＤＮＡに対応するゲノム配列を分離し、または該結合蛋 白の機能的誘導体を生成させることができる。

Ｄ　他の植物種から分離されたＧＡＩとホモローガスなりＮＡｏこれまで詳細に 記載されてきたＡ、タリアナから分離されたＤＮＡ配列を使用して、今度は他の 植物変種からホモローガスな配列を分離することが可能である。

詳細には、配列番号１のＧＡＩ　ＤＮＡ配列またはそのフラグメントを使用して 、当業者は常法を用いて、ホモローガスなりＮＡ配列を得るために、他の植物変 種からゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのいずれかをスクリーニングすること ができる。ホモローガスな配列を取得することにより、今度は植物界におけるＧ ＡＩ遺伝子の進化を研究することが可能となる。

さらに、種々の材料から分離されたＧＡＩの酵素活性における相違、およびその 相違と配列の差Ｒ（ダイバージェンス）との相関を調べることにより、特定の機 能上の変化を蛋白内の領域に関連付けることが可能となる。

このように詳細に記載されてきた本発明はＧＡＩ遺伝子を目的とするものであっ た。当業者には、本明細書に記載された方法を用いて、ＧＡ合成の原因となる他 の酵素をコードしているＤＮＡを得ることができるということが認識できるであ ろう。

このように本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照す ることによってより容易に理解でき、この実施例は例示のために供されるもので ありで、特記しない限り本発明の限定を意図するものではない。

実施例 実施例Ｉ Ａ、タリアナ・ランズバーグ・エレクタＤＮＡおよびｇａｌ　３１．８９ＤＮＡ の間のゲノム消去を、以下の修飾を施して先に記載（シュドラウスおよびアウス ベル、ブロンーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエ ンシズ・ＵＳＡ、８７巻１８８９−１８９３頁（１９９０））されたように実施 した。

Ａ　タリアナ・ランズバーグ・エレクタＤＮＡおよびｇａｌ突然変異体（３１゜ ８９）ＤＮＡを分離し、記載のようにＣｓＣ１勾配遠心により精製した（アウス ベル等、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、１巻（ グリーン・パブリッシング・アソシエイッ／ウィレイーインターサイエンス、ニ ューヨーク、１９９０））。消去の第一サイクルにおいて、５ａｕ３Ａで消化シ たランズバーグ・エレクタＤＮＡ０．２５μｇを、剪断し光ビオチニル化してお いたｇａｌ突然変異体３１．８９ＤＮＡ１２．５とハイブリダイズさせた。その 後のサイクル毎にビオチニル化３１．８９ＤＮＡ１０μｇを加えた。３μｇＤＮ Ａ／μｍの濃度で少な（とも２０時間のハイブリダイゼーションを６５℃で実施 した。５サイクルの消去の後に、増幅された生成物を５ａｕ３Ａアダプターにラ イゲーノヨンし、ＰＣＨにより増幅しそしてｐＵｃ１３のＳｍａ　Ｉ部位にライ ゲーンジンした。

５サイクルの消去的ハイブリダイゼーションの後、残ったＤＮＡフラグメントを 、野生型ＤＮＡには存在するが３１．８９ＤＮＡには欠けている配列について濃 縮した。これらのＤＮＡフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により 増幅し、クローニングした。調査した６つのクローンのうち一つ（ｐＧＡｌ−１ ）が、３１．８９ＤＮＡから除去された２５０ｂｐＳａｕ３Ａフラグメントを含 んでいた。

ランズバーグ・エレクタおよびｇａｌ対立遺伝子３１．８９．２９，９および６ ．５９由来のＨｉｎｄｌｌ＋消化ＤＮＡ１μｇを１％アガロースゲル上で分画し 、シーンスクリーンメンブレン（二ニー・イングランド・ヌクレアー）に転移さ せ、ゲル精製しｓｘｐで標識しておいたｐＧＡｌ−１およびｐＧＡｌ−２（ＡＴ ＣＣＮｏ、７５３９４）中の２５０ｂｐおよび６ｋｂ挿入物で探索した。図３゜ ハイブリダイゼーション条件は、チャーチおよびギルバート、プロシーディング ズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ、８１巻 １９９１−１９９５頁（１９８４）の記載と同一であった。

ｐＧＡｌ−１中の挿入物は、野生型ランズバーグ・エレクタならびにｇａｌ突然 変異体２９．９および６５９から分離されたＤＮＡ試料中の１．４ｋｂ　Ｈｉｎ ｄｌｌ！フラグメントとはハイブリダイズしたが、３１．８９ＤＮＡとはハイブ リダイズしなかった（図３Ａ）。

ｐＧＡｌ−１により同定された３１．８９ＤＮＡ中の欠失の大きさを決定するた めに、ｐＧＡｌ−ＩＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、３ １８９中の欠失に対応するより大きなゲノムフラグメントを分離した。これらの クローニングされたフラグメントを図２Ｂに示す。

λＦＩＸ中に組み立てられたランズバーグ・エレクタのゲノムライブラリーから 、Ｕｐ樟識ｐＧＡ１−１をプローブとして使用してλＧＡＩ−３を分離した（ヴ オイタス等、ンエ不ティクス、１２６巻７１３−７２１頁（１９９０））。λＧ Ａ１−３由来の６ｋｂ　５ａｌｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐブルースクリプ トＩＩ　ＳＫ（ストラタジーン）のＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩサイトにライゲー ンＢンすることにより、ｐＧＡｌ−２（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９４）が得られた 。クローニングされたＤＮＡを植物のゲノム中に有効に転移させるために必要な Ｔ−ＤＮＡ境界を含む（オルスゼフスキー等、ヌクレイツク・アンド・リサーチ 、１６巻１０７６５−１０７８２頁（１９８８））二性（バイナリ−）ベクター ｐＯｃＡ１８　（オルスゼフスキー等、ヌクレイツク・アンド・リサーチ、１６ を１０７６５−１０７８２頁（１９８８））中に組み立てられたＡ、タリアナ生 聾型コランビアＤＮＡのゲノムライブラリーから、ｐＧＡｌ−４（ＡＴＣＣＮ。

７５３９５）を分離した。

ｐＧＡｌ−１（図２Ｂ）中の挿入物に及んでいる６ｋｂフラグメントを含むプラ スミドｐＧＡ１−２　（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９４）を用いて、野生型Ａ、タリ アナおよび幾つかのｇａｌ突然変異体由来のＨｉｎｄｌＩＩ消化ＤＮＡを含有す るサザンプロットを探索した。図３Ｂおよび４Ｂに示されるように、ｐＧＡｌ− ２（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９４）は、３１．８９突然変異体由来のＤＮＡには存 在しない、野生型ＤＮＡ中の４つのＨｉｎｄｌｌｌフラグメント（１，Ｏｋｂ、 １．２ｋｂ、１．４ｋｂおよび５．６ｋｂ）とハイブリダイズした。除去突然変 異は３１．８９ＤＮＡに余分のＨｉｎｄｌｌＩフラグメント（４，２ｋｂ）を生 成した。これらの結果およびさらなる制限地図作成（示されていない）は、３１ ．８９ＤＮＡ中の欠失は５ｋｂであって、Ａ、タリアナゲノムのｏ、　ｏｏｓ％ に相当することを示した（５ｋｂ／１０５ｋｂ）Ｃ図２Ｂを参照されたい）。

３つの系列の証拠が、突然変異体３１．８９中の特性決定された５、０ｋｂ欠失 がＧＡＩ遺伝子座に対応することを示している。第一に、λＧＡＩ−３（図２Ｂ ）をハイブリダイゼーションプローブとして用い、Ｈ，Ｇ、ナム等、プラント・ セル、１巻６９９−７０５頁（１９８９）に詳説される方法により実施されたＲ ＦＬＰマツピング分析は、先にコーンニーフ等（ジャーナル・オン・ヘレディテ ィー、７４巻２６５−２７２頁（１９８３））によりＧＡＩ遺伝子座がマンピン グされた位置と一致する染色体４の最上部のテロメア近位領域にλＧＡＩ−３が 位置することを示した。

第二に、３１．８９における欠失に及ぶ野生型（コランビア）ＤＮＡの２０ｋｂ 挿入物を含むコスミドクロ−：／１）ＧＡＩ　４　（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９５ ）（図２Ｂ）は、アグロバクテリウム・トゥメファンエンスの媒介する形質転換 体の表現型により決定されるように、３１．８９におけるｇａ−１突然変異を補 足した。

ｐＧＡｌ−４を白むアグロバクテリウム・トゥメファシエンス菌株ＬＢＡ４４０ ４を用いて、ｇａｌ突然変異体３１．８９の根の外植体に感染させ、カナマイノ ン耐性（Ｋｍ’）形質転換植物を、記載のように（ヴアルヴエケンス等、ブロ／ −ディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエン／ズ・ＵＳ Ａ、８５巻５５３６−５５４０頁（１９８８））選択した。外因性ＧＡの不在下 で種子を付ける１３０のＫｍ’植物が再生された（７１世代）。４つの異なるＴ １植物の各々からの５０ないし３００個の種子は、ｇａｌおよびＫｍ’表現型の １００％の連鎖を示し、これはｇａｌ／Ｋｍ’表現型についておよそ３：１に分 離した（７２世代）。

形質転換ｇａｌおよび野生型植物の種子を、ＩＸムランゲ・アンド・スコーグ塩 および２％ンユクロースを含有しカナマイシンを含むまたは含まないアガロース 平板（ＭＳ平板）上で発芽させた。ｇａｌ突然変異体３１８９の種子は、ＭＳ平 板上で発芽させる前に４日間１００μＭのＧＡ３に浸した。７日齢の苗を土壌に 移した。

矯小表現型を示すために、発芽後の突然変異体３１．８９にはさらなるＧＡ３を 与えなかった。図３のために記載されるようにサザンプロット分析を実施した。

ｐＧＡｌ−４（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９５）中の挿入物をコランビア生態型から 分離した。Ｂ図の軌跡１および２に見られるように、ｐＧＡｌ−２（ＡＴＣＣＮ ｏ、７５３９４）はランズバーグ（５，６ｋｂ）およびコランビア（５，０ｋｂ ）ＤＮＡの間にＲＦＬＰを検出した。Ｂ図の軌跡１．２および３におけるＤＮＡ はＣｓＣｌ密度勾配遠心によって精製し、一方Ｂ図の軌跡４および５のＤＮＡは ミニブレブ法によって精製した。この事は、軌跡４および５に比較して軌跡１． ２および３のハイブリダイズバンドの移動度における、重要度の低い相違を説明 している。

３１．８９ゲノム中に統合されたｐＧＡｌ−４（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９５）の 挿入物を含む幾つかの独立したＴ２世代形形質換植物は、正常な発育に、外因性 ＧＡを必要としなかった。この形質転換植物の発芽、茎の伸長、および種子の結 実は、外因性ＧＡ処理を行なわない野生型植物と同じであった。ｐＧＡｌ−２（ ＡＴＣＣＮｏ、７５３９４）由来の６ｋｂフラグメントをプローブとして用いる サザンプロット分析は、二つの独立した１３世代形質転換植物中に、内因性ｇａ １　３１．８９遺伝子座（４，２ｋｂ）および野生型ＧＡＩ　ＤＮＡ（５゜０． １．４．１，２および１．０ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌ１７ラグメント）の両者が存在 することを示した（図４Ｂ）。

プローブとしてＴＬＤＮＡ境界配列を含むベクターｐＯｃＡ１８を用いるさらな るサザンプロット分析は、いずれの形質転換植物のゲノムにも、二つの境界フラ グメントしか存在しない事を示した（図４Ｃ）。これらの結果は、野生型ＧＡＩ 　ＤＮＡが、両方の形質転換植物のゲノム中、単一の遺伝子座に組み込まれてい ることを示した。

第三に、３１．８９中の５．Ｏｋｂ欠失がＧＡＩ遺伝子座に対応するという決定 的な証拠を得るために、本発明者等は、４つのさらなるｇａｌ対立遺伝子が、ゲ ノム地図により予想された順で、３１．８９において除去された領域内で野生型 配列からの相違を含んでいることを示した。この分析を補助するために、ポリＡ を含み且つ１．２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント（図２Ｂ）に対応する部分 的ＧＡＩ　ｃＤＮＡクローン（０，９ｋｂ）（配列番号１）を、Ａ、クリアナ生 態型コランビアの長角果（莢）から分離したＲＮＡから組み立てられたｃＤＮＡ ライブラリーから分離した。このｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列の比較により 、１．２ｋｂ　Ｈ４ｎｄｌｌｌフラグメント中の４つのエクソンおよび３つのイ ントロンが推定された（図２Ｂ、配列データは示されていない）。このｃＤＮＡ クローンの同定は、１．２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ１１フラグメントがＧＡＩ遺伝子の ３゛末端に位置することを示し、そして、ｇａｌ対立遺伝子３１．８９、Ｂ。

２７．６．５９、ｄ３５２およびＡ４２８における突然変異もまたＧＡＩ遺伝子 の３゛末端に位置するに違いないことを示唆した。

３１．８９対立遺伝子に加えて、これとは別の二つのｇａｌ対立遺伝子、６゜５ ９および２９．９が、高速中性子突然変異生成によって誘導された（コーンシー ン等、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ、、４１巻５７−６８頁（１９８３））。

図３Ｂに示されるように、６．５９ＤＮＡ中の１．２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌ１７ラ グメントが、隣接する１、４ｋｂおよび５．６ｋｂフラグメントを変更すること なく１．３ｋｂおよび３．３ｋｂの新たなフラグメント２個と置き換えられた。

さらなるサザンプロット分析および６．５９ＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ生成物の直 接ＤＮＡ配列決定は、この６５９対立遺伝子が、ｃＤＮＡクローンにより規定さ れた最後のイントロン中の１．２ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントに３．４ｋ ｂまたはそれ以上の挿入を含んでいることを示した（図２Ｂ）。プローブとして ｐＧＡｌ−２（ＡＴＣＣＮｏ、７５３９４）（図２Ｂ）およびｐＧＡｌ−４（Ａ ＴＣＣＮｏ、７５３９５）を使用するサザンブロ・ノド分析は、２９．　９ＤＮ Ａには目視し得る欠失または挿入が無いことを示した。３つのさらなるｇａｌ対 立遺伝子、Ａ４２８、ｄ３５２およびＢＯ２７は、遺伝子地図上の６．５９対立 遺伝子にまたはその近傍に位置する（図２Ａ）。ＢＯ２７、Ａ４２８およびｄ３ ５２突林変異体ＤＮＡ鋳型から増幅されたＰＣＲ生成物の直接配列決定は、３つ の突然変異体全てにおいて、１．２ｋｂＨｉｎｄｌ１１フラグメント中の最後の 二つのエクソン内にある、単一のヌクレオチド変化を明らかにした（図２Ｂ）。

この遺伝子地図の一方の側を規定する突然変異体Ｂｏ２７は、最も遠位のＧＡＩ エクソンに単一のヌクレオチド変化を含んでいた。突然変異体Ｂｏ２７、Ａ４２ ８およびｄ３５２中の単一のヌクレオチド変化は、突然変異体Ａ４２８およびｄ ３５２の漏出表現型と整合するミスセンス突然変異をもたらす（コーンシーン等 、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ、　、４１巻５７−６８頁（１９８３））、突 然変異体Ｂｏ２７、Ａ４２８およびｄ３５２に観察される塩基変化がＰＣＲの所 産である、またはＧＡＩ遺伝子座の高度な多形性によるものであるとは考えにく い。

何故なら、突然変異体ＮＧ４およびＮＧ５両者から増幅され配列決定された１゜ ２ｋｂＨｉｎｄｌｌｌフラグメントは野生型配列を持っていたからである。さら に、このＰＣＲ生成物を直接配列決定し、調査された各対立遺伝子につき二つの 独立した増幅の産物を用いて、配列分析を２回実施した。

本発明者等は、コーンシーン等（Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ、　、４１巻５ ７−６８頁（１９８３））により報告された異なるｇａｌ対立遺伝子間の組み替 え頻度を使用して、塩基対当りの組み替え頻度がＧＡＩ遺伝子座内ではおよそＩ Ｑ”５ｃＭであることを算出した。この計算は、ｇａｌ対立遺伝子Ａ４２８また はｄ３５２およびＢＯ２７（図２Ａ）の間の報告された組み替え頻度０．５ＸＩ Ｑ”ｃＭ、ならびに、ｄ３５２およびＢＯ２７ならびにＡ４２８およびＢＯ２７ での突然変異がそれぞれ４３２および４２７ｔｌに分離するという本発明者等の 観察に基づくものである。この計算は、突然変異体２９．９およびＢＯ２７によ り定義されるＧＡＩ遺伝子座の全体の大きさがおよそ７ｋｂであることを示唆す る。この、予想された遺伝子座の大きさは、ハイブリダイゼー／ヨンブローブと してＧＡＩ　ｃＤＮＡを用いて野生型植物に検出された２、８ｋｂ　ｍＲＮＡを 収容できる（図５）。

根および長角果ＲＮＡを前記のように幾らかの花芽および茎を加えた未熟な長角 果から調製した外は、植物全体から、４週齢および５週齢植物のポリ（Ａ）ＲＮ Ａを調製した（アウスベル等、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・ バイオロジー、１巻（グリーン・パブリッシング・アソシエイツ／ウイレイーイ ンターサイエンス、ニューヨーク、１９９０）：マニアテイス等、モレキュラー ・クローニング　ア・ラボラトリ−・マニュアル、１９７−２０１頁（コールド ・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・））−ｔ　＜ 　−１Ｎ）′、１９８２））。各試料のＲＮＡおよそ２μｇを１％アガロースゲ ル上でサイズ分画しくマニアティス等、モレキュラー・クローニング、ア・ラボ ラトリ−・マニュアル、１９７−２０１頁（コールド・スプリング・）１−バー ・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ、１９８２））　、シ ーンスクリーンメンブレンに転移させ、ＧＡＩ　ｃＤＮＡからの３２Ｐｌ！ｌ識 ０．９ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせた（図５） 。ＲＮＡプロットはさらに、Ａ、タリアナｃａｂ遺伝子（ＡＢ１６５）を含む” ＰｔｊＡ識１．　６５ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントとハイブリダイズさせた（リ ュートウイラー等、ヌクレインり・アンド・リサーチ、１４巻４０５１−４０６ ４頁（１９８６））。軌跡３におけるｃａｂプローブのハイブリダイゼーシヨン の減少は、ｃａｂ遺伝子が長角果において高度に発現されないという事実を反映 している。

予想された通り、２．８ｋｂ　ＲＮＡは欠失突然変異体には検出されなかった（ 図５）。Ａ、タリアナの連鎖地図はおよそ６００ｃＭであり、ゲノムの大きさは およそ１．０８ｘｌＯ’ｂｐである（グツドマン等、非公開の結果）。これは、 塩基対当りおよそ６ｘ１．Ｏ”’ｃＭに相当し、ＧＡＩ遺伝子座において観察さ れた組み替え頻度と良く一致する。

Ａ、タリアナＧＡＩ遺伝子のクローニングは、ＧＡ生合成の部位および＊ａを研 究する様々な実験機会を提起した。ｅｎｔ−カウレンは最初に提唱されたＧＡ生 合成の中間体であるため、ｅｎｔ−カウレンの形成に必要なＧＡＩ遺伝子がＧＡ 生合成の調節の要点であると思われる（Ｊ、Ｅ、グラーベ、アニュアル・レビュ ー・オン・プラント・フィジオロジー、３８巻４１９−４６５頁（１９８７）； ＴＣ，モーア、バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー・オン・プラント ・ホーセンス、１１３−１３５頁（ンユプリンガーーフェアラーク、ニューヨー ク、１９８９））。事実、ｅｎｔ−カウレンの生合成は、未熟な種子、茎端、ｇ 柄、および幼若な伸長しつつある節間付近の托葉といったような、迅速に発育し つつある組織で優先的に起こることが示された（Ｔ、Ｃ，モーア、バイオケミス トリー・アンド・フィジオロジー・オン・プラント・ホーセンス、１１３−１３ ５頁（ンユブリンガーーフェアラーク、ニューヨーク、１９８９）；チヤツクお よびコールバラ、プラント・フィジオロノー、８０巻５４４−５４８頁（１９８ ６））。

ゲノム消去は労働集約的ではなく、本明細書に報告された結果は、もし成る方法 が、欠失を高頻度で生成させるのに利用できるならば、ゲノム消去が他の非必須 Ａ、タリアナ遺伝子のクローニングに日常的に使用できることを示している。

高速中性子突然変異生成により誘導される突然変異体３１．８９におけるｇａｌ 除去（コーンニーフ等、Ｇｅｎｅｔ、Ｒｅｓ、Ｃａｍｂ、　、４１巻５７−６８ 頁（１９８３）　ル、　Ｗ、　Ｍ、デラート、［Ｘ−レイ−アンド・ファスト・ ニュートロン−インデユースト・ミューテインミンズ・イン・アンドドブシス・ タリアナ、アンド・ジ・イフェクト・オン・ノチオトレイトール・アボン・ザ・ ミュータント・スペクトラム」、博士論文、ワーゲニンゲン（１９８０）；フー ンニーフ等、ミューテインヨン・リサーチ、９３巻１０９−１２３頁（１９８２ ））に加えて、Ｘ線およびγ線照射もまた、ｃｈｌ−３（ウィルキンソンおよび クローフォード、プラント・セル、３巻４６１＝４７１頁（１９９１））、ｔ　 ｔ　−３（ＢジャーレイおよびＨ，Ｍ、グツドマン、非公開の結果）およびｇｌ −１遺伝子座（Ｄ、　マーシス、私的情報）においてＡ、クリアナ中の短い存立 し得る欠失を誘導することが示された。

実施例２　アンチセンスＧＡＩ　ＲＮＡの発現。

センス鎖ＧＡＩ　ＲＮＡに対し相補的なＲＮＡを発現するような発現ベクターを 前記のようにして組み立てた。このアンチセンスＧＡＩ　ＲＮＡは、与えられた 宿主植物中で構成的に発現されるプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウ ィルス３５Ｓプロモーターを用いて、構成的な様式で発現される。これとは別に 、アンチセンスＲＮＡは、組織特異的プロモーターを用いて組織特異的な様式で 発現される。前記のように、このようなプロモーターは当分野において良く知ら れている。

一つの例において、アンチセンス組み立て物ｐＰＯ３５（オエラー等、サイエン ス、２５４巻４３７−４３９頁（１９９１））をＢａｍＨｒおよび５ＡＣＩで切 断し、ｔＡＣＣ２ｃＤＮＡ配列を除去する。ｔＡＣＣ２ｃＤＮＡを除去した後、 このベクターをＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ夏のフレノウフラグメントで処 理して末端を埋め、配列番号１に記載される配列をこのベクター中に平滑末端ラ イゲーションする。ライゲーションしたベクターを適当な大腸菌菌株の形質転換 に使用する。

ライゲーションされたベクターを含むコロニーをコロニーハイブリダイゼーショ ンまたはサザンブロツティングを用いてスクリーニングし、該ベクター中に含ま れる３５Ｓプロモーターから転写される時アンチセンスＲＮＡを生成する方向に ＧＡｌｃＤＮＡを含むベクターを得る。

このアンチセンスＧＡ１ベクターを、適正な方向を有していると同定されたコロ ニーから分離し、ＤＮＡを、前記の技術、例えば電気穿孔またはアグロバクテリ ウム／Ｔｉプラスミド媒介形質転換のうちの一つによって、植物細胞中に導入す る。

形質転換された細胞から再生された植物はアンチセンスＧＡＩ　ＲＮＡを発現す る。発現されたアンチセンスＧＡＩ　ＲＮＡはセンス鎖ＧＡＩ　ＲＮＡと結合し 、その結果翻訳を妨げる。

結論。

本発明をその特定の態様と結びつけて記載してきたが、本発明はさらなる修飾が 可能であるということ、また、この出願は、一般に、本発明の原理に従い、且つ 、本発明の属する分野内の既知の習慣または慣例の範囲内にあり、そして付記さ れる請求項の範囲内にあるような前記開示の本質的な特徴に適用され得るような 本開示からの逸脱を包含する、本発明の任意の変化、用途、または適応に及ぶこ とが意図されているということが理解されるであろう。

配列表 （１）　一般的情報 （ｉ）　特許出願人：サン、タイ・ビングツドマン、ハワード・エム オスベル、フレデリック・エム （ｉｆ）　発明の名称：組み替えジベレリンＤＮＡおよびその用途（ｉｉｉ）　 配列の数：２ （ｉｖ）　連絡先・ （Ａ）　名宛人；スターン・ケスラー・ゴールドスティンアンドフォックス（Ｂ ）　通り：コネチカット・アベニュー１２２５１（Ｅ）　国、アメリカ合衆国 （Ｆ）　Ｚｌ：２００３６ （Ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ）　媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）　コンピューター＝夏ＢＭ　ＰＣ適合（Ｃ）　オペレーｆイングＨンスｙ Ｌ：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）　ソフトウェア　パテントイン８１． Ｏ，バージョン＃１．　２５（ｖｉ）　本出願のデータ： （Ａ）　出願番号： （Ｂ）　出願日。

（Ｃ）　分類。

（ｖｉｉｉ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名　ンンバラ、ミノエル・ニー（Ｂ）　登録番号＋３３，８５１ （Ｃ）　参照／竪ＦＩＩ号＋０６０９．３７５０００４（１ｘ）　電話連絡先情 報： （Ａ）　電話番号：　（２０２）４６６−０８００（Ｂ）　ファックス番号：　 （２０２）８３３−８７１６（２）　配列番号１の情報： （１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：９０３ （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１： （２）　配列番号２の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ、９０３ （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数・両形態 （Ｄ）　トポロジー・直鎮状 （スｉ）　配列：配列番号２： αｅ　１０３ ＦＩＧ、１ ３１．８９ Ａ４２８　Ｂｏ２７ （Ｇ　−Ａ）　（Ｇ−Ａ） ＦＩＧ、２Ｂ ５．６ｋｂ−ｗ　−・ ＃　、　−ｓ４．２ｋｂ Ｊ＼ ・４３Ｌ３ｋｂ １．０ｋｂ−優　−−１ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／６８　 Ａ　９４５３−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、　ＳＥ ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲＩ （７２）発明者　グツドマン、ハワード・エムアメリカ合衆国マサチューセッツ ０２１５９、ニュートン・センター、ザ・レッジス・ロード１０番 （７２）発明者　オスベル、フレデリック・エムアメリカ合衆国マサチューセッ ツ０２１６１、ニュートン、レイク・アベニュー２７１番

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．アラビドプシス・タリアナのＧＡ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ組み立 て物。
2. ２．ＧＡ１蛋白をコードしているＤＮＡ配列を実質上含まない、ＧＡ１遺伝子の 調節配列。
3. ３．請求項１または２に記載の配列を含むベクター。
4. ４．請求項３に記載のベクターのひとつによって形質転換された宿主。
5. ５．該宿主が細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物より成る群から選ばれる、 請求項４に記載の宿主。
6. ６．遺伝子がＧＡ１と同じ時間的および空間的発現パターンを有するような、植 物中での該遺伝子の発現を指令する方法であって、該方法が、１）該遺伝子をＧ Ａ１の調節配列と有機的に連結して、発現モジュールを作り出し、そして、 ２）該植物を発現モジニール（１９）により形質転換する、工程からなる方法。
7. ７．該調節配列が、ＧＡ１コード化領域の約−２ｋｂないし０ｂｐ、５′の配列 を含む、請求項６に記載の方法。
8. ８．該調節配列が、ＧＡ１コード化領域の約−５００ｂｐないし０ｂｐ、５′の 配列を含む、請求項６に記載の方法。
9. ９．該調節配列が、ＧＡ１コード化領域の約−２５０ｂｐないし０ｂｐ、５′の 配列を含む、請求項６に記載の方法。
10. １０．１）アンチセンスＧＡ１ＲＮＡをコードしている発現ベクターを生成させ ； ２）該植物を、発現ベクタ−（１）によりトランスフェクトする、工程からなる 、植物においてＧＡ１をコードしているＲＮＡの翻訳をモジュレートする方法。
11. １１．１）ＧＡ１蛋白に結合することのできる抗体、またはそのフラグメントを コードしている発現ベクターを生成させ；２）植物を該発現ベクターにより形質 転換する、工程からなる、植物においてＧＡ１蛋白の活性をモジュレートする方 法。
12. １２．ＧＡ１蛋白を結合することのできる抗体、またはそのフラグメント。
13. １３．ＧＡ１遺伝子の調節領域に結合することのできる蛋白。
14. １４．１）該細胞または該組織を、ＧＡ１蛋白またはＧＡ１をコードしているＲ ＮＡに結合することのできる物質とインキュベートし；そして、２）結合した物 質の存在を検出する、 工程からなる、ＧＡ１を発現する組織または細胞を同定する方法。
15. １５．ＧＡ１蛋白に結合することのできる該物質が、抗体、またはそのフラグメ ントである、請求項１４に記載の方法。
16. １６．ＧＡ１をコードしているＲＮＡに結合することのできる該物質が、ＲＮＡ およびＤＮＡより成る群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。