CN112011546A - SlMS基因在调控番茄育性中的应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同源结构域指蛋白SlMS基因在调控番茄果实育性中的应用及方法。SlMS基因的序列如SEQ ID NO.1所示，编码序列如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过植物基因编辑技术对SlMS基因进行遗传操作，可以使植物产生雄性不育，对于农作物育种具有重要的应用价值。

Description

SlMS基因在调控番茄育性中的应用及方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种同源结构域指蛋白SlMS基因在调控番茄育性中的应用及方法。
背景技术
杂种优势是指杂种后代在生长势、生活力、抗逆性、产量和品质等方面优于亲本的表现，杂种优势现象在许多蔬菜作物中均明显存在。植物雄性不育是指在有性繁殖过程中雄蕊不能正常生长或产生有活力的花粉，但雌蕊能正常发育和受精的生物学现象。利用雄性不育系来制种是实现作物杂种优势的有效方法之一。例如，番茄杂种优势十分明显，杂种一代可比亲本增产20％～40％。
按照遗传类型划分，植物雄性不育分为细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。细胞质雄性不育由细胞质基因和细胞核基因互作控制。细胞质雄性不育又分为孢子体不育和配子体不育。根据雄性不育的稳定性划分，植物植物雄性不育又可分为稳定不育型(SMS)和环境敏感不育型(ESMS)两种。按照雄性不育的表达形式，植物雄性不育又分为产孢型雄性不育、结构型雄性不育和功能型雄性不育。不论哪种划分类型，在植物生殖发育过程中，花粉的正常发育对植物是否能够完成受精作用十分关键。
目前，花粉发育在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)中已进行了广泛、深入研究。例如，研究发现参与拟南芥花粉发育的转录调控因子包括AtDYT1、AtTDF1、AtAMS、AtbHLH10、AtbHLH89、AtbHLH91以及AtMYB80、AtMYB103。AtDYT1编码bHLH转录因子并直接调节AtTDF1的表达。AtTDF1影响AtAMS的表达。AtAMS蛋白可以与AtbHLH89/91相互作用并调节AtMYB80的表达。AtDYT1和AtbHLH10/89/91之间的互作对于调节花粉发育也很重要，形成的DYT1-TDF1-AMS-bHLH10/89/91-MYB80转录级联可精确调节拟南芥花粉和绒毡层发育。
但是，目前关于调控番茄花粉发育的基因还知之甚少，利用番茄育性基因改变番茄育性的研究也甚少。
发明内容
基于此，有必要提供一种同源结构域指蛋白SlMS基因在调控番茄育性中的应用及方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种SlMS基因在调控番茄育性中的应用，所述SlMS基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在其中一些实施例中，所述SlMS基因编码的蛋白：
(1)氨基酸序列如SEQID NO.3所示的同源结构域指蛋白；
(2)序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失、添加一个或若干氨基酸残基所得到的衍生蛋白。
在其中一些实施例中，所述调控番茄育性的方法是采用敲除或者沉默CDS序列如SEQ ID NO.2所示的SlMS基因或者核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的SlMS基因。
本发明还提供一种创建雄性不育番茄的方法，利用CRISPR/Cas9系统编辑番茄SlMS基因使所述SlMS基因丧失或改变功能，所述SlMS基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在其中一些实施例中，所述CRISPR/Cas9系统包含2个gRNA，序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。
具体地，所述创建雄性不育番茄的方法包括如下步骤：构建CRISPR/Cas9载体pCP098M-SlMS，利用农杆菌介导番茄遗传转化，获得SlMS基因功能丧失的编辑植株。
在其中一些实施例中，构建CRISPR/Cas9载体pCP098M-SlMS所采用的引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
在其中一些实施例中，番茄遗传转化所用的受体材料为MicroTom。
在其中一些实施例中，鉴定所述编辑植株所采用的引物序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
在其中一些实施例中，编辑位点检测引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示。
值得说明的是，锌指蛋白可分为环指蛋白、LIM蛋白、同源结构域指蛋白等多种类型。其中，典型的同源结构域指蛋白通常包含一个或多个同源结构域指，这些结构域包含大约60个氨基酸和一个典型的C4HC3锌结合基序。但是，番茄中表达的同源结构域指蛋白的作用并未阐明。本发明首次发现通过植物基因编辑技术编辑同源结构域指蛋白及其基因可以明显调控番茄育性。
与传统育种手段相比，本发明首次通过植物基因编辑技术编辑同源结构域指蛋白SlMS基因可以获得番茄雄性不育植株，提供了一套调控植物育性、创建植物雄性不育材料的技术方案，对于农作物育种具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例3的番茄转基因植株的鉴定胶图。
图2为实施例3的番茄同源结构域指蛋白转基因系中育性改变情况图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的分子生物学实验及条件(如Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)》中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因SlMS的发现及克隆
发明人团队利用生物信息学分析结合PCR扩增的方法从番茄(Solanumlycopersicum)中克隆到一个编码同源结构域指蛋白的基因，并将此基因命名为SlMS基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，其CDS序列为SEQ ID NO.2所示。SlMS基因共有3085bp，其中1～291bp、655～979bp、1666～3085bp处为该基因的编码区，包括2037bp的开放阅读框，编码678个氨基酸，其编码蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示，分子量为77kD。
发明人团队利用生物信息学方法结合数据库发现：基因SlMS在番茄基因组数据库的ID为Solyc04g008420.1，其在辣椒基因组中的同源基因为辣椒基因组数据库ID:Capana05g000766，均在花蕾中特异地高表达。
具体地，SEQ ID NO.1所示的基因序列如下：
ATGTCGACTTTAGATCTGAGCGGATCGAAGAAAAGGAAGAGGAATAATAATGAGAGGGTATCATTTAAGTTCAAGAATTTTGGTGAACAAGGGTTTCCTATAGAGTTCATTGGGTGCAATTTTGACCAAAATGTTAAACTTCTTTTGGAATTTGCACAACAAGAAAATGGGAGTATTTGGTCATTTCAATTGGAAGTTCATAGACATCCACCAATGCATGTGTTCCTATTTGTTGTTGAAGAACAAGTTGAATTGTCACTCAATCCTCATTGCAAACATTGTCAATACATAGGTAATATCACTACCGAAAATTATTACAAGTTCACGTGAAATTTAAATTCTAAATCTGTCACGGAAAAAAAAAGAAATTAATAGAACATTTGGAACATATAGTGATTAGTAACTTCATTTGTTAGGTTTGTGTTTGGTGAAATTAAATCAAATACTAAGTGAAATTACTAAAATATAGTACTAAAAAAATTAAATTTGCTTTGCATGACTTTTATGTTATTAATATAAATCAAATTCTCTTAATTTCTTTCGTATATTTACCTTTTCATATTTTAACTTTCTTAATGAAAAACTAGTTATGCCACCGTTTAACTATCGACGTATAAAAGTTAAACTCATCAAAGTACTTATGCATGGCCTCAGGATGGGGCAACAATTTGATGTGCAACAAGAAGTACCATTTTCTATTGGCTTCAAAGGACACAATTGGAGCTTGTGTAGAAGGAGGAAATGGACAAAAATACAAATATAAAACAGATGTTAATAATATTATTGGTGGAGAAATAATTAAAAGTAAGTTAAATTTGATAGAAATAGAAGGTCATATGATGCATGGTGTGTTTCATTCTAATGGTTTTGGGCATTTGATTTGTGTCAATGGATCATTGGAAACTCCTACTTCTTCTGACTTGCCTGGTCACTCAATTATGGACTTTTGGGATCGACTTTGCATTGGACTTCGTGCTAGGTTTGTCATCATCAACTTAATTTACTATTTTCGTTTTATTTTATCTGACGGGGTTTGATTCAACTTGAAATTTGACTAACAAAGAAAATATATATAATTTATGATTTTAAACTTATTAGAACATATTTGTAATCGGGTGCGGAGTTAAAATGCCACAATTGATGAAAGCTGCATACATTATATATACAAGATCAATAAAATTTCATGTAACATAACGATAATTGCTTGTTTTCTTCCTGCGTTTACTTTTTTATATATATTTCGTCTCTACTATCTTTGTAGCTGAAAAAATAGTAGAATAGAAAGTTTAAAAGTTACATTATTTTGAAATACATAAATATGCCTTTCGTTATAGAACATTATAAACAAATATCACATAAAACGAAACAAAAATACACTAGTGTATGTTCAAACTGTTTTGTTAGGAGTAGTGTCATGTTAAACTCTGTGTTCAATCAAGCACACATTGCATAAAACGATACACAAGGAGTATCTTTTATGCTTTTATGCACCCCTTAGCCTTAATCATCGTATTTATCTAAATTATATATCCTTCATTTTCCTTTAAACTTGCACTTAAAGTCATAAATAACTTTCTACTTTTTCAAAAAGTCAACAACTTTAGATTATCAAAATGATTAATATTTGAGATCGAAAACAATAATAATTTCTCTATGTTTTTGAAGGAAAGTAAGCTTAAGAGATATCTCAACAAAGAAAGGGATGGATCTAAGGCTACTCAACACATTAGCCTATGGTGAGCCATGGTTTGGTCGATGGGGTTACAAATTTGGGCGTGGGAGCTTTGGTGTTACACAAGAAACATATCAAAGTGCAATTAATGCCTTACAAAACATGCCATTAGCTTTATTAGCACATCATCATCACCATATAGGGATTATAAATATTAATGAGATATTAATAGTGTTATCAAGGTACCAAATGTTATCTGGTCACTCATTAGTCACACTTTGTGATGCCTTTCATTTCATGTTGGAGCTCAAATCAAGGATCCCAAAGGAAAACAATAATCTTACCTCATGTTATCCAGGGCTATTAGTTGACACAACTTGTAGATGGTCACCTAAACGCGTTGAAATGGCTATTAGGGTTGTTGTGGAAGCCCTAAAAGGGGCTAAATCGCGATGGGTGTCTAGGCAAGAGGTTCGTGATGCTGCTCGTGCTTATATTGGTGATACAGGGTTGCTTGATTTCGTTCTCAAGTCATTAGGGAATCATATTGTTGGTAAGTATCTGGTTCGTCGATGCTTAAATCCAGTGACTAAAGTTTTGGAATATTGTTTAGAGGATATATCTAAAGCATTTCCTAAACAAGATCAAGGTTTTAGGGTCAATGACTCAAAAGGGAAACAACAATACAAAATCACATTGGCGCAACTTATGAAGGACATACATTTCTTGTACAACAATATTCTAAAAGAGCATAAGGGATTAATGTCAAATTATACGGGCGTCTTTGCTACAATCCCAACAGCTTCTAGAATAATCCTAGACACGAAGTACTTCCTCAAGGAATACAGAGAGGTATCAGAGCCAGATACAAGAATTGAACCAGATAAATCCAAGATTTATTGCGCGATTATGTTGGCAATCAAGGATGGATTTGGTGTTGAAGAAAAAGTAATGACCCCATTTGAGTGTTTCTTAATGAGAAAAGATGTGACATTTGATGAGCTAAAAATTGAAGTTGAAAAGGCTTTTGGGGATATTTATTTGGGATTAAGGAACTTTACCACAAGATCAATTAACAACTTGATAAGCCCAATTAGTGGAATAGAATTGGTGTTTAATGTGGTGAAACCAGGAAGCAAGATTGTTTTAGGAGGGGTAATAATGTCAAATAATGATGATATTAATATTATTAATAATGGAGGGATATTTGAAGGAATTAAGAATAATAATATTATTATGGATTGTATTTGTGGGACTAAAGATGAAGATGGTGAAAGGATGATTTGTTGTGATATTTGTGAAGTTTGGCAACACACTAGGTGTGTTAATATACCAAATCATGAAGCAATTCCAGATATATTTCTTTGTAATAAGTGTGAGCAAGATATCTTACAATTTCCTTCATTACCTTAG
SEQ ID NO.2所示的基因序列如下：
ATGTCGACTTTAGATCTGAGCGGATCGAAGAAAAGGAAGAGGAATAATAATGAGAGGGTATCATTTAAGTTCAAGAATTTTGGTGAACAAGGGTTTCCTATAGAGTTCATTGGGTGCAATTTTGACCAAAATGTTAAACTTCTTTTGGAATTTGCACAACAAGAAAATGGGAGTATTTGGTCATTTCAATTGGAAGTTCATAGACATCCACCAATGCATGTGTTCCTATTTGTTGTTGAAGAACAAGTTGAATTGTCACTCAATCCTCATTGCAAACATTGTCAATACATAGGATGGGGCAACAATTTGATGTGCAACAAGAAGTACCATTTTCTATTGGCTTCAAAGGACACAATTGGAGCTTGTGTAGAAGGAGGAAATGGACAAAAATACAAATATAAAACAGATGTTAATAATATTATTGGTGGAGAAATAATTAAAAGTAAGTTAAATTTGATAGAAATAGAAGGTCATATGATGCATGGTGTGTTTCATTCTAATGGTTTTGGGCATTTGATTTGTGTCAATGGATCATTGGAAACTCCTACTTCTTCTGACTTGCCTGGTCACTCAATTATGGACTTTTGGGATCGACTTTGCATTGGACTTCGTGCTAGGAAAGTAAGCTTAAGAGATATCTCAACAAAGAAAGGGATGGATCTAAGGCTACTCAACACATTAGCCTATGGTGAGCCATGGTTTGGTCGATGGGGTTACAAATTTGGGCGTGGGAGCTTTGGTGTTACACAAGAAACATATCAAAGTGCAATTAATGCCTTACAAAACATGCCATTAGCTTTATTAGCACATCATCATCACCATATAGGGATTATAAATATTAATGAGATATTAATAGTGTTATCAAGGTACCAAATGTTATCTGGTCACTCATTAGTCACACTTTGTGATGCCTTTCATTTCATGTTGGAGCTCAAATCAAGGATCCCAAAGGAAAACAATAATCTTACCTCATGTTATCCAGGGCTATTAGTTGACACAACTTGTAGATGGTCACCTAAACGCGTTGAAATGGCTATTAGGGTTGTTGTGGAAGCCCTAAAAGGGGCTAAATCGCGATGGGTGTCTAGGCAAGAGGTTCGTGATGCTGCTCGTGCTTATATTGGTGATACAGGGTTGCTTGATTTCGTTCTCAAGTCATTAGGGAATCATATTGTTGGTAAGTATCTGGTTCGTCGATGCTTAAATCCAGTGACTAAAGTTTTGGAATATTGTTTAGAGGATATATCTAAAGCATTTCCTAAACAAGATCAAGGTTTTAGGGTCAATGACTCAAAAGGGAAACAACAATACAAAATCACATTGGCGCAACTTATGAAGGACATACATTTCTTGTACAACAATATTCTAAAAGAGCATAAGGGATTAATGTCAAATTATACGGGCGTCTTTGCTACAATCCCAACAGCTTCTAGAATAATCCTAGACACGAAGTACTTCCTCAAGGAATACAGAGAGGTATCAGAGCCAGATACAAGAATTGAACCAGATAAATCCAAGATTTATTGCGCGATTATGTTGGCAATCAAGGATGGATTTGGTGTTGAAGAAAAAGTAATGACCCCATTTGAGTGTTTCTTAATGAGAAAAGATGTGACATTTGATGAGCTAAAAATTGAAGTTGAAAAGGCTTTTGGGGATATTTATTTGGGATTAAGGAACTTTACCACAAGATCAATTAACAACTTGATAAGCCCAATTAGTGGAATAGAATTGGTGTTTAATGTGGTGAAACCAGGAAGCAAGATTGTTTTAGGAGGGGTAATAATGTCAAATAATGATGATATTAATATTATTAATAATGGAGGGATATTTGAAGGAATTAAGAATAATAATATTATTATGGATTGTATTTGTGGGACTAAAGATGAAGATGGTGAAAGGATGATTTGTTGTGATATTTGTGAAGTTTGGCAACACACTAGGTGTGTTAATATACCAAATCATGAAGCAATTCCAGATATATTTCTTTGTAATAAGTGTGAGCAAGATATCTTACAATTTCCTTCATTACCTTAG
SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列如下：
MSTLDLSGSKKRKRNNNERVSFKFKNFGEQGFPIEFIGCNFDQNVKLLLEFAQQENGSIWSFQLEVHRHPPMHVFLFVVEEQVELSLNPHCKHCQYIGWGNNLMCNKKYHFLLASKDTIGACVEGGNGQKYKYKTDVNNIIGGEIIKSKLNLIEIEGHMMHGVFHSNGFGHLICVNGSLETPTSSDLPGHSIMDFWDRLCIGLRARKVSLRDISTKKGMDLRLLNTLAYGEPWFGRWGYKFGRGSFGVTQETYQSAINALQNMPLALLAHHHHHIGIININEILIVLSRYQMLSGHSLVTLCDAFHFMLELKSRIPKENNNLTSCYPGLLVDTTCRWSPKRVEMAIRVVVEALKGAKSRWVSRQEVRDAARAYIGDTGLLDFVLKSLGNHIVGKYLVRRCLNPVTKVLEYCLEDISKAFPKQDQGFRVNDSKGKQQYKITLAQLMKDIHFLYNNILKEHKGLMSNYTGVFATIPTASRIILDTKYFLKEYREVSEPDTRIEPDKSKIYCAIMLAIKDGFGVEEKVMTPFECFLMRKDVTFDELKIEVEKAFGDIYLGLRNFTTRSINNLISPISGIELVFNVVKPGSKIVLGGVIMSNNDDINIINNGGIFEGIKNNNIIMDCICGTKDEDGERMICCDICEVWQHTRCVNIPNHEAIPDIFLCNKCEQDILQFPSLP
实施例2构建CRISPR/Cas9载体pCP098M-SlMS
本实施例构建含2个gRNA的CRISPR/Cas9载体pCP098M-SlMS的方法包括如下步骤：
(1)CRISPR/Cas9植物表达通用载体pCP098M的构建
以pHellsgate8载体(Helliwell et al.Functional Plant Biology,2002,29:1217-1255)质粒为模板，利用引物M-F:ggcgaagaagaagaagtgagctcCTGCTTTAATGAGATATGCGAGAC和M-R:gatacgaacgaaagctctgagctcTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGA扩增含有NOS启动子、NPTII基因、OCS终止子的转录单元。经过1％琼脂糖凝胶电泳检测并用OMEGA胶回收试剂盒纯化回收。用SacI酶切质粒pCP098(中国农业科学院崔霞研究员提供，通过MTA协议方式获得)，酶切后的大片段产物用OMEGA胶回收试剂盒回收。将PCR纯化产物和线性化的pCP098质粒用重组酶(诺唯赞生物科技有限公司)重组连接获得重组质粒。重组质粒经过热激转化到大肠杆菌感受态细胞trans5α中，阳性克隆PCR检测并测序验证无误后保存用于后续研究。所改造的载体命名为pCP098M。
(2)使用网站CRISPR-P2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计靶点，靶点序列分别为：CGGATCGAAGAAAAGGAAG(SEQ ID NO.4)和ATTTGTTGTTGAAGAACAA(SEQ IDNO.5)。设计如表1所示的引物，送至引物公司合成。
表1 CRISPR/Cas9载体构建所用的引物
Figure BDA0002590770420000091
(3)以pCP043质粒(中国农业科学院崔霞研究员提供，通过MTA协议方式获得)为模板，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶进行基因编辑载体片段的扩增，反应体系和反应程序分别见下表2和表3。
表2基因编辑片段扩增反应体系
组分 体积/μL
10×Buffer 25
dNTPs(10mM) 1
pCP043质粒DNA(100-400ng/μL) 1
PHD-ZF-cas9-F(10mM) 2
PHD-ZF-cas9-R(10mM) 2
Phanta(1.0U/μL) 1
ddH<sub>2</sub>O 18
共计 50
表3扩增反应程序
Figure BDA0002590770420000092
其中，“/”指无。
扩增所得产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小(约600bp)，然后对扩增所得片段挖胶回收，测定回收产物浓度。将扩增片段回收产物与pCP098M质粒分别用BsaI酶切(37℃，>1h)并电泳和挖胶回收，pCP098M载体回收16kb左右的线性大片段作为载体骨架。
利用T4 DNA Ligase将BsaI酶切后的目的基因片段与线性化的pCP098M载体骨架进行连接，反应程序为25℃、2h，获得载体pCP098M-SlMS。
于42℃条件下进行热激转化，将载体pCP098M-SlMS转入大肠杆菌Trans5α感受态(北京全式金生物技术有限公司)，置于37℃、200r/min条件下进行复苏，然后将菌液涂在含有100mg/L卡那霉素的固体培养基，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆采用菌落PCR鉴定。挑取单克隆加入含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，以菌液为模版进行片段扩增，检测引物为PHD-ZF-Cas9-F和PHD-ZF-Cas9-R。使用1％琼脂糖凝胶进行检测，选取3个条带大小正确的单克隆进行测序。
选取测序结果正确的单克隆扩繁并提取质粒。同时，菌液中加入等量50％的甘油，-80℃保存备用。提取的质粒采用电转的方法导入GV3101农杆菌感受态细胞中，将菌液涂布在含有100mg/L卡那霉素和35mg/L利福平的固体培养基，28℃培养2d。进一步对农杆菌采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，选取正确的克隆，-80℃保存，以备后期的植物遗传转化使用。
实施例3番茄遗传转化
将构建好的CRISPR/Cas9载体pCP098M-SlMS利用农杆菌介导转入受体材料MicroTom番茄品种(南京丰硕园艺科技有限公司)中，番茄遗传转化方法参考(Ouyang etal.The Journal of Horticultural Science and Biotechnology,2005,80:517-522)，共得到15株抗性植株。
如图1所示，PCR检测发现：其中11株为阳性植株。PCR检测所采用的引物信息如表4所示：
表4转基因材料阳性检测引物信息
引物名称 序列(5'-3')
CP098M-GH-F GTTCAAGGTCCTGGGCAACAC(SEQIDNO.8)
CP098M-GH-R GATCTCGACCGAATCGAAGCAC(SEQIDNO.9)
利用如下表5所示的引物序列扩增阳性植株两靶点间序列，并利用一代测序分析编辑情况。发现其中4株靶点得到了编辑，分别命名为SlmsCR-9、SlmsCR-5、SlmsCR-14、SlmsCR-15。在4株基因编辑植株中，SlmsCR-9为纯合缺失突变，SlmsCR-5、SlmsCR-14、SlmsCR-15均为杂合缺失突变。
表5编辑位点检测引物
引物名称 序列(5'-3')
CR-SlMS-F CTTGCTTTCTGCGATAGATTTGC(SEQIDNO.10)
CR-SlMS-R GAAGTTACTAATCACTATATGTTCC(SEQIDNO.11)
另外，经长期观察研究发现，所有基因编辑植株营养及生长状况基本正常，与番茄MicroTom无明显差异，可开花结果。但是，不论是纯合编辑植株SlmsCR-9，还是杂合编辑植株SlmsCR-5、SlmsCR-14和SlmsCR-15，所结果实均无种子。例如，图2显示了其中一个编辑番茄植株的无籽果实状况。
进一步地，利用番茄MicroTom的花粉对纯合编辑植株SlmsCR-9进行授粉，可以得到有种子的果实，且种子可以正常发芽、结实。因此，编辑SlMS基因能够通过控制番茄花粉发育而调控番茄育性。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> SlMS基因在调控番茄育性中的应用及方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3085
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcgactt tagatctgag cggatcgaag aaaaggaaga ggaataataa tgagagggta 60
tcatttaagt tcaagaattt tggtgaacaa gggtttccta tagagttcat tgggtgcaat 120
tttgaccaaa atgttaaact tcttttggaa tttgcacaac aagaaaatgg gagtatttgg 180
tcatttcaat tggaagttca tagacatcca ccaatgcatg tgttcctatt tgttgttgaa 240
gaacaagttg aattgtcact caatcctcat tgcaaacatt gtcaatacat aggtaatatc 300
actaccgaaa attattacaa gttcacgtga aatttaaatt ctaaatctgt cacggaaaaa 360
aaaagaaatt aatagaacat ttggaacata tagtgattag taacttcatt tgttaggttt 420
gtgtttggtg aaattaaatc aaatactaag tgaaattact aaaatatagt actaaaaaaa 480
ttaaatttgc tttgcatgac ttttatgtta ttaatataaa tcaaattctc ttaatttctt 540
tcgtatattt accttttcat attttaactt tcttaatgaa aaactagtta tgccaccgtt 600
taactatcga cgtataaaag ttaaactcat caaagtactt atgcatggcc tcaggatggg 660
gcaacaattt gatgtgcaac aagaagtacc attttctatt ggcttcaaag gacacaattg 720
gagcttgtgt agaaggagga aatggacaaa aatacaaata taaaacagat gttaataata 780
ttattggtgg agaaataatt aaaagtaagt taaatttgat agaaatagaa ggtcatatga 840
tgcatggtgt gtttcattct aatggttttg ggcatttgat ttgtgtcaat ggatcattgg 900
aaactcctac ttcttctgac ttgcctggtc actcaattat ggacttttgg gatcgacttt 960
gcattggact tcgtgctagg tttgtcatca tcaacttaat ttactatttt cgttttattt 1020
tatctgacgg ggtttgattc aacttgaaat ttgactaaca aagaaaatat atataattta 1080
tgattttaaa cttattagaa catatttgta atcgggtgcg gagttaaaat gccacaattg 1140
atgaaagctg catacattat atatacaaga tcaataaaat ttcatgtaac ataacgataa 1200
ttgcttgttt tcttcctgcg tttacttttt tatatatatt tcgtctctac tatctttgta 1260
gctgaaaaaa tagtagaata gaaagtttaa aagttacatt attttgaaat acataaatat 1320
gcctttcgtt atagaacatt ataaacaaat atcacataaa acgaaacaaa aatacactag 1380
tgtatgttca aactgttttg ttaggagtag tgtcatgtta aactctgtgt tcaatcaagc 1440
acacattgca taaaacgata cacaaggagt atcttttatg cttttatgca ccccttagcc 1500
ttaatcatcg tatttatcta aattatatat ccttcatttt cctttaaact tgcacttaaa 1560
gtcataaata actttctact ttttcaaaaa gtcaacaact ttagattatc aaaatgatta 1620
atatttgaga tcgaaaacaa taataatttc tctatgtttt tgaaggaaag taagcttaag 1680
agatatctca acaaagaaag ggatggatct aaggctactc aacacattag cctatggtga 1740
gccatggttt ggtcgatggg gttacaaatt tgggcgtggg agctttggtg ttacacaaga 1800
aacatatcaa agtgcaatta atgccttaca aaacatgcca ttagctttat tagcacatca 1860
tcatcaccat atagggatta taaatattaa tgagatatta atagtgttat caaggtacca 1920
aatgttatct ggtcactcat tagtcacact ttgtgatgcc tttcatttca tgttggagct 1980
caaatcaagg atcccaaagg aaaacaataa tcttacctca tgttatccag ggctattagt 2040
tgacacaact tgtagatggt cacctaaacg cgttgaaatg gctattaggg ttgttgtgga 2100
agccctaaaa ggggctaaat cgcgatgggt gtctaggcaa gaggttcgtg atgctgctcg 2160
tgcttatatt ggtgatacag ggttgcttga tttcgttctc aagtcattag ggaatcatat 2220
tgttggtaag tatctggttc gtcgatgctt aaatccagtg actaaagttt tggaatattg 2280
tttagaggat atatctaaag catttcctaa acaagatcaa ggttttaggg tcaatgactc 2340
aaaagggaaa caacaataca aaatcacatt ggcgcaactt atgaaggaca tacatttctt 2400
gtacaacaat attctaaaag agcataaggg attaatgtca aattatacgg gcgtctttgc 2460
tacaatccca acagcttcta gaataatcct agacacgaag tacttcctca aggaatacag 2520
agaggtatca gagccagata caagaattga accagataaa tccaagattt attgcgcgat 2580
tatgttggca atcaaggatg gatttggtgt tgaagaaaaa gtaatgaccc catttgagtg 2640
tttcttaatg agaaaagatg tgacatttga tgagctaaaa attgaagttg aaaaggcttt 2700
tggggatatt tatttgggat taaggaactt taccacaaga tcaattaaca acttgataag 2760
cccaattagt ggaatagaat tggtgtttaa tgtggtgaaa ccaggaagca agattgtttt 2820
aggaggggta ataatgtcaa ataatgatga tattaatatt attaataatg gagggatatt 2880
tgaaggaatt aagaataata atattattat ggattgtatt tgtgggacta aagatgaaga 2940
tggtgaaagg atgatttgtt gtgatatttg tgaagtttgg caacacacta ggtgtgttaa 3000
tataccaaat catgaagcaa ttccagatat atttctttgt aataagtgtg agcaagatat 3060
cttacaattt ccttcattac cttag 3085
<210> 2
<211> 2037
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtcgactt tagatctgag cggatcgaag aaaaggaaga ggaataataa tgagagggta 60
tcatttaagt tcaagaattt tggtgaacaa gggtttccta tagagttcat tgggtgcaat 120
tttgaccaaa atgttaaact tcttttggaa tttgcacaac aagaaaatgg gagtatttgg 180
tcatttcaat tggaagttca tagacatcca ccaatgcatg tgttcctatt tgttgttgaa 240
gaacaagttg aattgtcact caatcctcat tgcaaacatt gtcaatacat aggatggggc 300
aacaatttga tgtgcaacaa gaagtaccat tttctattgg cttcaaagga cacaattgga 360
gcttgtgtag aaggaggaaa tggacaaaaa tacaaatata aaacagatgt taataatatt 420
attggtggag aaataattaa aagtaagtta aatttgatag aaatagaagg tcatatgatg 480
catggtgtgt ttcattctaa tggttttggg catttgattt gtgtcaatgg atcattggaa 540
actcctactt cttctgactt gcctggtcac tcaattatgg acttttggga tcgactttgc 600
attggacttc gtgctaggaa agtaagctta agagatatct caacaaagaa agggatggat 660
ctaaggctac tcaacacatt agcctatggt gagccatggt ttggtcgatg gggttacaaa 720
tttgggcgtg ggagctttgg tgttacacaa gaaacatatc aaagtgcaat taatgcctta 780
caaaacatgc cattagcttt attagcacat catcatcacc atatagggat tataaatatt 840
aatgagatat taatagtgtt atcaaggtac caaatgttat ctggtcactc attagtcaca 900
ctttgtgatg cctttcattt catgttggag ctcaaatcaa ggatcccaaa ggaaaacaat 960
aatcttacct catgttatcc agggctatta gttgacacaa cttgtagatg gtcacctaaa 1020
cgcgttgaaa tggctattag ggttgttgtg gaagccctaa aaggggctaa atcgcgatgg 1080
gtgtctaggc aagaggttcg tgatgctgct cgtgcttata ttggtgatac agggttgctt 1140
gatttcgttc tcaagtcatt agggaatcat attgttggta agtatctggt tcgtcgatgc 1200
ttaaatccag tgactaaagt tttggaatat tgtttagagg atatatctaa agcatttcct 1260
aaacaagatc aaggttttag ggtcaatgac tcaaaaggga aacaacaata caaaatcaca 1320
ttggcgcaac ttatgaagga catacatttc ttgtacaaca atattctaaa agagcataag 1380
ggattaatgt caaattatac gggcgtcttt gctacaatcc caacagcttc tagaataatc 1440
ctagacacga agtacttcct caaggaatac agagaggtat cagagccaga tacaagaatt 1500
gaaccagata aatccaagat ttattgcgcg attatgttgg caatcaagga tggatttggt 1560
gttgaagaaa aagtaatgac cccatttgag tgtttcttaa tgagaaaaga tgtgacattt 1620
gatgagctaa aaattgaagt tgaaaaggct tttggggata tttatttggg attaaggaac 1680
tttaccacaa gatcaattaa caacttgata agcccaatta gtggaataga attggtgttt 1740
aatgtggtga aaccaggaag caagattgtt ttaggagggg taataatgtc aaataatgat 1800
gatattaata ttattaataa tggagggata tttgaaggaa ttaagaataa taatattatt 1860
atggattgta tttgtgggac taaagatgaa gatggtgaaa ggatgatttg ttgtgatatt 1920
tgtgaagttt ggcaacacac taggtgtgtt aatataccaa atcatgaagc aattccagat 1980
atatttcttt gtaataagtg tgagcaagat atcttacaat ttccttcatt accttag 2037
<210> 3
<211> 678
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Thr Leu Asp Leu Ser Gly Ser Lys Lys Arg Lys Arg Asn Asn
1 5 10 15
Asn Glu Arg Val Ser Phe Lys Phe Lys Asn Phe Gly Glu Gln Gly Phe
20 25 30
Pro Ile Glu Phe Ile Gly Cys Asn Phe Asp Gln Asn Val Lys Leu Leu
35 40 45
Leu Glu Phe Ala Gln Gln Glu Asn Gly Ser Ile Trp Ser Phe Gln Leu
50 55 60
Glu Val His Arg His Pro Pro Met His Val Phe Leu Phe Val Val Glu
65 70 75 80
Glu Gln Val Glu Leu Ser Leu Asn Pro His Cys Lys His Cys Gln Tyr
85 90 95
Ile Gly Trp Gly Asn Asn Leu Met Cys Asn Lys Lys Tyr His Phe Leu
100 105 110
Leu Ala Ser Lys Asp Thr Ile Gly Ala Cys Val Glu Gly Gly Asn Gly
115 120 125
Gln Lys Tyr Lys Tyr Lys Thr Asp Val Asn Asn Ile Ile Gly Gly Glu
130 135 140
Ile Ile Lys Ser Lys Leu Asn Leu Ile Glu Ile Glu Gly His Met Met
145 150 155 160
His Gly Val Phe His Ser Asn Gly Phe Gly His Leu Ile Cys Val Asn
165 170 175
Gly Ser Leu Glu Thr Pro Thr Ser Ser Asp Leu Pro Gly His Ser Ile
180 185 190
Met Asp Phe Trp Asp Arg Leu Cys Ile Gly Leu Arg Ala Arg Lys Val
195 200 205
Ser Leu Arg Asp Ile Ser Thr Lys Lys Gly Met Asp Leu Arg Leu Leu
210 215 220
Asn Thr Leu Ala Tyr Gly Glu Pro Trp Phe Gly Arg Trp Gly Tyr Lys
225 230 235 240
Phe Gly Arg Gly Ser Phe Gly Val Thr Gln Glu Thr Tyr Gln Ser Ala
245 250 255
Ile Asn Ala Leu Gln Asn Met Pro Leu Ala Leu Leu Ala His His His
260 265 270
His His Ile Gly Ile Ile Asn Ile Asn Glu Ile Leu Ile Val Leu Ser
275 280 285
Arg Tyr Gln Met Leu Ser Gly His Ser Leu Val Thr Leu Cys Asp Ala
290 295 300
Phe His Phe Met Leu Glu Leu Lys Ser Arg Ile Pro Lys Glu Asn Asn
305 310 315 320
Asn Leu Thr Ser Cys Tyr Pro Gly Leu Leu Val Asp Thr Thr Cys Arg
325 330 335
Trp Ser Pro Lys Arg Val Glu Met Ala Ile Arg Val Val Val Glu Ala
340 345 350
Leu Lys Gly Ala Lys Ser Arg Trp Val Ser Arg Gln Glu Val Arg Asp
355 360 365
Ala Ala Arg Ala Tyr Ile Gly Asp Thr Gly Leu Leu Asp Phe Val Leu
370 375 380
Lys Ser Leu Gly Asn His Ile Val Gly Lys Tyr Leu Val Arg Arg Cys
385 390 395 400
Leu Asn Pro Val Thr Lys Val Leu Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Ile Ser
405 410 415
Lys Ala Phe Pro Lys Gln Asp Gln Gly Phe Arg Val Asn Asp Ser Lys
420 425 430
Gly Lys Gln Gln Tyr Lys Ile Thr Leu Ala Gln Leu Met Lys Asp Ile
435 440 445
His Phe Leu Tyr Asn Asn Ile Leu Lys Glu His Lys Gly Leu Met Ser
450 455 460
Asn Tyr Thr Gly Val Phe Ala Thr Ile Pro Thr Ala Ser Arg Ile Ile
465 470 475 480
Leu Asp Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Glu Tyr Arg Glu Val Ser Glu Pro
485 490 495
Asp Thr Arg Ile Glu Pro Asp Lys Ser Lys Ile Tyr Cys Ala Ile Met
500 505 510
Leu Ala Ile Lys Asp Gly Phe Gly Val Glu Glu Lys Val Met Thr Pro
515 520 525
Phe Glu Cys Phe Leu Met Arg Lys Asp Val Thr Phe Asp Glu Leu Lys
530 535 540
Ile Glu Val Glu Lys Ala Phe Gly Asp Ile Tyr Leu Gly Leu Arg Asn
545 550 555 560
Phe Thr Thr Arg Ser Ile Asn Asn Leu Ile Ser Pro Ile Ser Gly Ile
565 570 575
Glu Leu Val Phe Asn Val Val Lys Pro Gly Ser Lys Ile Val Leu Gly
580 585 590
Gly Val Ile Met Ser Asn Asn Asp Asp Ile Asn Ile Ile Asn Asn Gly
595 600 605
Gly Ile Phe Glu Gly Ile Lys Asn Asn Asn Ile Ile Met Asp Cys Ile
610 615 620
Cys Gly Thr Lys Asp Glu Asp Gly Glu Arg Met Ile Cys Cys Asp Ile
625 630 635 640
Cys Glu Val Trp Gln His Thr Arg Cys Val Asn Ile Pro Asn His Glu
645 650 655
Ala Ile Pro Asp Ile Phe Leu Cys Asn Lys Cys Glu Gln Asp Ile Leu
660 665 670
Gln Phe Pro Ser Leu Pro
675
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggatcgaag aaaaggaag 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atttgttgtt gaagaacaa 19
<210> 6
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atatatggtc tcgtttgcgg atcgaagaaa aggaaggttt tagagctaga aatagc 56
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attattggtc tcgaaacatt tgttgttgaa gaacaaccaa actacactgt tagattc 57
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttcaaggtc ctgggcaaca c 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatctcgacc gaatcgaagc ac 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttgctttct gcgatagatt tgc 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaagttacta atcactatat gttcc 25

Claims (10)

1.SlMS基因在调控番茄育性中的应用，所述SlMS基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SlMS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SlMS基因编码的蛋白：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的同源结构域指蛋白；
(2)序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失、添加一个或若干氨基酸残基所得到的衍生蛋白。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述调控番茄育性的方法是采用敲除或者沉默CDS序列如SEQ ID NO.2所示的SlMS基因或者核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的SlMS基因。
5.一种创建雄性不育番茄的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统编辑番茄SlMS基因使所述SlMS基因丧失或改变功能，所述SlMS基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的创建雄性不育番茄的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包含2个gRNA，序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求6所述的创建雄性不育番茄的方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建CRISPR/Cas9载体pCP098M-SlMS；
利用农杆菌介导番茄遗传转化，获得SlMS基因功能丧失或改变的编辑植株。
8.根据权利要求7所述的创建雄性不育番茄的方法，其特征在于，构建CRISPR/Cas9载体pCP098M-SlMS所采用的引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
9.根据权利要求7所述的创建雄性不育番茄的方法，其特征在于，鉴定所述编辑植株所采用的引物序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
10.根据权利要求7所述的创建雄性不育番茄的方法，其特征在于，编辑位点检测引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
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