CN1878463A - 不育性植物体的生产方法以及使用此方法得到的植物体及其利用 - Google Patents

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CN1878463A CN 200580001035 CN200580001035A CN1878463A CN 1878463 A CN1878463 A CN 1878463A CN 200580001035 CN200580001035 CN 200580001035 CN 200580001035 A CN200580001035 A CN 200580001035A CN 1878463 A CN1878463 A CN 1878463A
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高木优
平津圭一郎
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Abstract

本发明提供通过抑制与花器形成相关基因的转录，生产不育性植物体的技术。将嵌合体基因导入至植物细胞中、此嵌合体基因具有编码促进与花器形成相关基因表达的转录因子的基因和编码将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽的多核苷酸，在植物细胞内生产融合有上述转录因子和上述功能性肽的嵌合体蛋白质。该嵌合蛋白具有优势地抑制与花器形成相关基因的表达，其结果不能形成正常的花粉，生产植物的雄性不育体。该嵌合体蛋白质抑制与花药开裂相关基因的表达，生产花药开裂被抑制的植物体。该嵌合体蛋白质，抑制与雄蕊和雌蕊形成相关转录因子的目标基因的表达，生产重叠花瓣植物体。

Description

不育性植物体的生产方法以及使用此方法得到的植物体及其利用
技术领域
本发明涉及生产不育性植物体的技术，更详细地说，涉及植物雄性不育体的生产方法、花药开裂被抑制的植物体的生产方法、花瓣重叠植物体的生产方法以及使用这些生产方法得到的植物体及其利用。
背景技术
在不同品种间进行交配、制作杂种时，在子代中表现出比双亲优异的形质(性状)。将其称为杂种优势。现在，通过利用此杂种优势的交配、将农作物杂交制出优良品种变得很普通。如主要的蔬菜、谷物的优良品种几乎都是通过这样的交配进行品种改良。
为了获得杂种优势的利益，必须在相互不同的品种间进行交配。因此，在进行交配的品种中，一定要使其不能进行自体授粉。这里，在玉米等雄花和雌花分离的植物中，通过将雄花人为地割除，可以避免自体授粉。但是，此操作需要大量的人力非常费事。另外，在水稻为代表的自体受精性植物中，多数的花聚集在一起、雄蕊和雌蕊被花瓣包裹。因此，难以人为地将雄花割除，避免自体授粉是非常困难的。
因此，为了进行利用杂种优势的交配，希望利用不能形成正常花粉的所谓雄性不育体。事实上，到目前为止，在番茄、黄瓜等多数植物中，已经得到了雄性不育体，并利用于品种改良中。
但是，另一方面，没有确立雄性不育体的植物品种还很多也是事实。在这些植物中，由于突然变异而得到新的雄性不育体时，其成果不得不依赖于偶然性，从而需要长时期的进行交配。因此，需要大量的劳力和成本，在目前的农业中这种工作在现实上是困难的。
因此，迄今为止，进行了一些利用基因重组技术人为地确立雄性不育体的尝试。
非专利文献1中公开了由核内基因人为引起雄性不育的技术。此技术中，在ペニチユア(一种花名-译注)中导入查尔酮合成酶的反义基因，抑制查尔酮合成酶的活性。由此，抑制了为类黄酮生合成(Biogenesis)前驱体的查尔酮的生合成，使形质(性状)被改变的ペニチユア成为雄形不育体。
非专利文献2中公开了通过毒性物质使烟草的绒缎(日文：タペ一ト，英文：tapetal)组织消失，制作雄性不育体的技术。此技术中，将为N-乙酰基-L-鸟氨酸脱乙酰酶转录·翻译产物的argE基因，以融合于与绒缎组织中具有特异机能的TA29启动子类似的DNA序列中的形态，导入至烟草中。接着，在此烟草中，投予没有毒性的N-乙酰基-L-膦丝菌素。这样，通过在花药表达的N-乙酰基-L-鸟氨酸脱乙酰酶，N-乙酰基-L-膦丝菌素被脱乙酰化，成为具有毒性的L-膦丝菌素。通过此毒性物质，绒缎组织引起坏死而消失，因此形质(性状)被改变的烟草变为不能形成花粉的雄性不育体。
另外，在非专利文献3中公开了人为引起细胞质雄性不育的技术。此技术中，将来自于小麦的、未进行RNA编辑的线粒体atp9基因导入至烟草细胞中。由此，惰性的ATP9蛋白质表达，向线粒体移动。其结果阻碍了线粒体的功能，因此形质(性状)被改变的烟草成为雄性不育体。
在非专利文献4中公开了以下技术，即制得导入了未经RNA编辑的线粒体atp9基因的反义基因的另一种形质(性状)改变烟草，将其与导入了未经RNA编辑的线粒体atp9基因的形质(性状)改变烟草交配，由此制得在下代恢复生育性的形质(性状)改变烟草。
一直以来，在植物中作为植物特定的转录因子家族，众所周知的有NAC家族。在白犬荠(英文名Thale Cress，Mouse-ear cress)中，到目前为止已经报告了100个以上属于NAC家族的基因。据报告，目前分离出来的NAC家族是茎顶分裂组织的形成·维持、花器官形成、侧根形成等所必需的转录因子，具有各种功能。但是，对NAC家族特异性结合的顺式序列(シス序列)等还不清楚，还有待于对其功能的解析(如，参照非专利文献5)。
在不同品种间交配植物、杂交农产品制出优良品种，在目前是普遍的。其利用了杂种优势，即在不同品种间交配植物制作杂种时，在子代中表现出了比双亲优异的形质(性状)。为了获得杂种优势的利益，必须在相互不同的品种间进行交配。因此，在进行交配的品种中，一定不能进行自体授粉。作为此方法，有将雄性器官人为除去的方法、人工交配的方法、使用阻碍花粉成熟的化学物质的方法等，但是能够利用这些方法的植物有限、并且需要大量的人力，是非常费时的作业。因此，利用雄性不育体的方法被广泛使用，此雄性不育体由于雄性配偶子(花粉)的形成不完全，因此不能形成种子而丧失了生育性。到目前为止，在各种植物中，通过突然变异得到的雄性不育体被利用在品种改良中。并且，据报告雄性不育体还未确定的植物品种也很多，也进行了利用基因重组技术，人为地确立雄性不育体的尝试(如参照专利文献1、2)。在专利文献1中公开了通过控制花药开裂和花粉成熟的基因DAD1表达，制出雄性不育体的方法。
另一方面，据报告作为抑制花药开裂的尝试，将具有细胞毒性的バルナ一ゼ(一种球状蛋白质酶-译注)与使花药特异基因表达的TA56启动子结合，导入至烟草中，由此在将口边细胞人为杀死的烟草花药中，不会发生花药开裂(参照非专利文献6)。另外非专利文献6报告了，为了发生开裂，口边细胞在死亡之前必须充分的发挥功能，但是，几乎没有得到花药开裂中分子水平的发现。作为花药开裂异常的突然变异体，已知的有delayed-dehiscence 1-delayed-dehiscence 5、non-dehiscence 1、msH等比较多的突然变异体(如参照非专利文献7)。但是，作为控制花药开裂的原因基因，到目前明确的是只有屈指可数的上述DAD1等，还有很多原因基因不明确。
有报告，从在玉米跳跃因子En-1/Spm处诱发突然变异的白犬荠(英文名Thale Cress，Mouse-ear cress日文名：シロイヌナズナ-译注)集团中，分离在花药开裂中呈现异常的突然变异体，进行了原因基因的鉴定(如参照非专利文献8)。非专利文献8报告了所得突然变异体的表现型是由在AtMYB26中插入跳跃因子引起的。
一般来说，花由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊4个器官构成，将花芽分裂组织分为4个同心圆区域、即从外侧开始分为whorl 1-4时，whol 1中有4个花萼、whorl 2中有4个花瓣、whorl 3中有6个雄蕊、whorl 4中有由2个心皮融合而成的雌蕊。这些器官的形质是由花的同源异形基因所决定(如参照非专利文献9)。花的同源异形基因分为A、B、C3组，编码转录因子。因此，通过这些基因群的组合，决定在花芽分裂组织中形成的花器官种类。即，仅组A工作则形成花萼、组A和B协同工作则形成花瓣、组B和C协同工作则形成雄蕊、仅组C工作则形成雌蕊。因此，同源异形基因的功能突然变异等失去时，某些器官会转变为其他器官的形质。这种变化称为同源异形变换，在植物中已经明确了在白犬荠等中与花的器官形质决定相关的同源异形基因(如参照非专利文献9)。
无配子基因(以下，称为“AG基因”)为上述组C基因，在AG基因功能丧失的AG变异体中，组A的功能涉及花的全部区域，雄蕊变为花瓣、在野生型中成为雌蕊的区域长出新的花、花的形状变为重叠花瓣(如参照非专利文献9)。
到目前为止，以制得重叠花瓣植物体为目的改变花的形状时，一般需要与具有目标形质的植物品种进行杂交的交配育种。
另外，近年来，作为抑制特定基因工作的方法，广泛使用将双链RNA放入细胞中，将与其排列相同的细胞的mRNA进行分解的RNA干涉(RNAi)法。
另一方面，本发明人发现了各种将任意转录因子转变为转录抑制因子的肽(如参照专利文献3-9、非专利文献10、11)。此肽为从Class II ERF(Ethylene Responsive Element Binding Factor)蛋白质、植物的锌指蛋白质(Zinc Finger Protein、如白犬荠SUPERMAN蛋白质等)中剪切得到，具有极为单纯的结构。
本发明人还尝试了将编码融合有各种转录因子和上述肽的融合蛋白质(嵌合体蛋白质)的基因导入至植物体内。由此将转录因子转变为转录抑制因子，成功地生产抑制了促进该转录因子转录的目标基因的表达的植物体。
[专利文献1]
日本国公开专利公报“特开2000-300273公报”(公开日：平成12年(2000)10月31日)
[专利文献2]
日本国公开专利公报“特开2004-24108公报”(公开日：平成16年(2004)1月29日)
[专利文献3]
日本国公开专利公报“特开2001-269177公报”(公开日：平成13年(2001)10月2日)
[专利文献4]
日本国公开专利公报“特开2001-269178号公报”(公开日：平成13年(2001)10月2日)
[专利文献5]
日本国公开专利公报“特开2001-292776号公报”(公开日：平成13年(2001)10月2日)
[专利文献6]
日本国公开专利公报“特开2001-292777号公报”(公开日：平成13年(2001)10月23日)
[专利文献7]
日本国公开专利公报“特开2001-269176号公报”(公开日：平成13年(2001)10月2日)
[专利文献8]
日本国公开专利公报“特开2001-269179号公报”(公开日：平成13年(2001)10月2日)
[专利文献9]
国际公开第WO03/055903号小册子(公开日：平成15年(2003)7月10日)
[非专利文献1]
Ingrid M.van Meer，Maike E.Stam，Arjen J.van Tunen，JosephN.M.Mol，and Antoine R.Stuitje.The Plant Cell，Vol 4，pp 253-262，March，1992
[非专利文献2]
G.Kriete，K.Niehaus，A.M.Perlick，A.Puehler and I.Broer，The Plant Journal，Vol 9，pp809-818，1996
[非专利文献3]
Michel Hernould，Sony Suharsono，Simon Litvak，Alejandro Araya，and Armand Mouras.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 90，pp.2370-2374，March，1993
[非专利文献4]
Eduardo Zabaleta，Armand Mouras，Michel Hernould，Suharsono，andAlejandro Araya.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 93，pp.11259-11263，October，1996
[非专利文献5]
Xie，Q.，Frugis，G.，Colgan，D.，Chua，N-H.，Genes Dev.14，3024-3036，2000
[非专利文献6]
Beals，T.P.，Goldberg，R.B.，The Plant Cell，Vol.9，1527-1545，September，1997
[非专利文献7]
日向康吉编著，《花-性与生殖的分子生物学-》，学会出版中心，p116-117
[非专利文献8]
Steiner-Lange，S.，Unte，U.S.，Eckstein，L.，Yang，C.，Wilson，Z.A.，Schmelzer，E.，Dekker，K.，Saedler，H.，The Plant Journal(2003)34，519-528
[非专利文献9]
酒井一著、《决定植物形状的分子机构》、秀润社、150-155页
[非专利文献10]
Ohta，M.，Matsui，K.，Hiratsu，K.，Shinshi，H.and Ohme-Takagi，M.，The Plant Cell，Vol.13，1959-1968，August，2001
[非专利文献11]
Hiratsu，K.，Ohta，M.，Matsui，K.，Ohme-Takagi，M.，FEBS Letters514(2002)351-354
但是，以往并不知道通过抑制与花器形成相关基因的转录，生产不育性植物体的技术。
在上述专利文献1中，不发生花药的开裂与花粉不具生育性是同时发生的。但是不管花粉生育性的有无，只要不发生花药开裂，在利用杂种优势的交配中，就能够避免自体授粉。
以往使用的利用花粉不具生育性的雄性不育体的方法，由于结果实时自动地变为杂种，因此是制得杂种第1代有效的方法。但是，由于在次代中也是不育时则不结果实，因此必须在次代中恢复生育性。与此相对，花药的开裂被抑制、但花粉具有生育性时，能够制得花粉本身保留生殖功能、同时又不发生自体授粉的植物，在育种上是非常有用的。通过生产嵌合体蛋白质、此嵌合体蛋白质含有促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，以及将转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽，由此对花药开裂进行抑制的技术还没有见到过。另外，在以往的通过交配育种的方法中，为了生产具有目标形质的植物，需要长期的时间和熟练技术人员的经验。因此，在短期间简便、确实地得到重叠花瓣植物体是非常困难的。
也可以考虑通过上述RNAi法抑制AG基因的功能，得到重叠花瓣植物体，但在RNAi法中，在抑制基因的表达时，决定目标部位困难，具有以下各种问题：难免会有实验失败、难以建立结构、由于细胞不同而发生的转染效率低下、RNA干涉的效果有限等。因此通过RNAi法在短期间简便、确实地得到重叠花瓣植物体是非常困难的。
本发明针对上述问题点而完成，其目的在于，通过抑制与花器形成相关的基因的转录，提供使植物不育化、生产不育性植物体的生产方法。
另外，本发明的目的还在于，通过生产嵌合体蛋白质，提供生产花药开裂被抑制的不育性植物体的方法，上述嵌合体蛋白质包含促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，以及将转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
进而，本发明的目的还在于，通过将与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子转变为转录抑制因子、抑制上述转录因子的目标基因的转录，提供在短期间简便、确实地生产花的形态为重叠花瓣的不育性植物体的方法。
发明内容
本发明人为了解决上述课题进行了深入地研究，结果发现通过将APETALA3蛋白质转变为转录抑制因子，能够生产出不形成花瓣和雄蕊的雄性不育体，进而完成本发明，此APETALA3蛋白质为促进与花器形成相关基因转录的转录因子中的一个。
即，本发明涉及的不育性植物体的生产方法，其特征在于，在植物体内生产嵌合体蛋白质，使植物体不育化，上述嵌合体蛋白质融合有促进与花器形成相关基因表达的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
另外，本发明涉及的不育性植物体的生产方法，其特征在于，在植物体内生产嵌合体蛋白质，抑制与花器形成相关基因的表达，上述嵌合体蛋白质融合有促进与花器形成相关基因表达的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
本发明涉及的不育性植物体的生产方法中，上述促进与花器形成相关基因表达的转录因子优选为与雄蕊或雌蕊形成相关的转录因子。
通过上述构成，所得植物体成为不能形成种子的不育性植物体。因此，无需利用复杂的基因重组技术，可非常简便地将目标植物转变为不育性植物。
另外，本发明涉及的不育性植物体的生产方法中，不育性植物优选为至少雄蕊的形成被阻碍的植物体。
本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，在NAC家族蛋白质之一的、在At2g46770基因座处被编码的蛋白质中，融合将任意转录因子转变为转录抑制因子的肽，在植物体内使其表达，则花药的开裂完全不会发生或者只能不完全地发生。且由此，首次明确这个NAC家族蛋白质(在At2g46770基因座处被编码的蛋白质、以下简称为“NACAD1”(NACinvolving to Anther Development))，是促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，进而完成本发明。
即，本发明涉及的不育性植物体的生产方法中，优选与上述雄蕊或雌蕊形成相关的转录因子为促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，通过在植物体内生产融合有上述转录因子和将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽的嵌合体蛋白质，抑制花药开裂。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在促进与花药开裂相关基因转录的转录因子、且含有MYB域的转录因子之一的MYB26蛋白质中，融合将转录因子转变为转录抑制因子的肽，在植物体内使其表达，则花药的开裂完全不会发生、或者仅不完全发生，进而完成本发明。
即，本发明涉及的不育性植物体生产方法中，优选上述促进与花药开裂相关基因转录的转录因子为具有MYB域的转录因子，在植物体内生产融合有上述转录因子和将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽的嵌合体蛋白质，抑制与花药开裂相关基因的转录。上述植物体优选雌性器官具有生育性。并且上述植物体优选花粉本身具有生育性。
由此，上述嵌合体蛋白质能够有效地抑制上述转录因子的目标基因的转录。结果，产生了上述嵌合体蛋白质的植物体的花药开裂受到抑制。
另外，本发明人首次发现，通过将与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子转变为转录抑制因子，抑制上述转录因子的目标基因的转录，能够在短期内简便、确实地生产重叠花瓣植物体，进而完成本发明。
即，本发明涉及的不育性植物体的生产方法，其特征在于，通过在植物体内生产嵌合体蛋白质，将花的形态改变为重叠花瓣，上述嵌合体蛋白质融合有与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
通过上述构成，能够将上述转录因子转变为转录抑制因子，在植物体内抑制上述转录因子的目标基因的转录。另外，由于所谓抑制上述转录因子的目标基因的转录的形质为优势的，因此上述嵌合体蛋白质比上述转录因子更具有优势地工作，抑制目标基因的转录。所以，能够在短期内简便、确实地生产重叠花瓣植物体。
通过上述构成，所得重叠花瓣植物体成为不能形成种子的不育性植物。因此，无需利用复杂的基因重组技术，可非常简便地将目标植物转变为不育性植物体。
上述不育性植物体的生产方法中，可以包括形质(性状)转变工序，即将含有嵌合体基因的重组表达载体导入至植物细胞内，此嵌合体基因由编码上述转录因子的基因和编码上述功能性肽的多核苷酸构成。
另外，上述不育性植物体的生产方法，还可以包括构建上述重组表达载体的表达载体构建工序。
通过上述构成，仅在附加有上述功能性肽的表达盒载体中编入上述转录因子的基因，导入至植物细胞中，就能够在植物细胞内使上述嵌合体蛋白质表达，通过上述嵌合体蛋白质能够容易地抑制转录因子的目标基因的转录。因此，能够在短期内简便、确实地生产不育性植物体。
上述转录因子的特征在于，为下述(a)或(b)记载的蛋白质。(a)由序列号134所示的氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由在序列号134所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列而构成，具有促进与花器形成相关基因表达功能的蛋白质。
作为编码上述转录因子的基因，优选使用以下(c)或(d)所记载的基因。(c)将序列号135所示的碱基序列作为开放读码框区域含有的基因。(d)在严格条件下将由序列号135所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因杂交，并且编码促进与花器形成相关基因表达的转录因子的基因。
上述转录因子优选为以下(a)或(b)记载的蛋白质。(a)由序列号136所示氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由在序列号136所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列而构成，是具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质。
上述转录因子也可以是，相对于序列号136所示氨基酸序列具有50％以上的相同性、并且具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质。
作为编码上述转录因子的基因，优选使用以下(c)或(d)记载的基因。(c)将序列号137所示的碱基序列作为开放读码框区域含有的基因。(d)在严格条件下将由序列号137所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因杂交，并且编码促进与花药开裂相关基因转录的转录因子的基因。
上述转录因子优选为以下(a)或(b)记载的蛋白质。(a)由序列号138所示氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由在序列号138所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成，是具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质。
作为编码上述转录因子的基因，优选使用下述(c)或(d)记载的基因。(c)将序列号139所示的碱基序列作为开放读码框区域含有的基因。(d)在严格条件下将由序列号139所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因杂交，并且编码促进与花药开裂相关基因转录的转录因子的基因。
上述转录因子优选为以下(a)或(b)记载的蛋白质。(a)由序列号140所示氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由在序列号140所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成的蛋白质。
作为编码上述转录因子的基因，优选使用以下(c)或(d)记载的基因。
(c)将序列号141所示的碱基序列作为开放读码框区域含有的基因。
(d)在严格条件下将由序列号141所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因杂交，并且编码与雄蕊和雌蕊形成相关的蛋白质的基因。
通过上述构成，上述转录因子被上述功能性肽转变为转录抑制因子，抑制了上述转录因子的目标基因的转录。因此，能够在短期内简便、确实地生产重叠花瓣植物体。
另外，本发明涉及的花药开裂被控制了的植物体的生产方法，以使用下述基因为特征：
编码以下(a)或(b)记载的蛋白质的基因、
(a)由序列号136所示氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号136所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成，是具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质、
或者以下(c)或(d)记载的基因、
(c)将序列号137所示的碱基序列作为开放读码框区域含有的基因、
(d)在严格条件下将由序列号137所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因杂交，并且编码促进与花药开裂相关基因转录的转录因子的基因。
上述功能性肽，优选为具有由下述式(1)-(4)任一个所示氨基酸序列的肽。
(1)X1-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3
(式中，X1表示0-10个氨基酸残基、X2表示Asn或Glu、X3表示至少6个的氨基酸残基。)
(2)Y1-Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3
(式中，Y1表示0-10个氨基酸残基、Y2表示Phe或Ile、Y3表示至少6个的氨基酸残基。)
(3)Z1-Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3
(式中，Z1表示Leu、Asp-Leu或Leu-Asp-Leu，Z2表示Glu、Gln或Asp，Z3表示0-10个氨基酸残基。)
(4)Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu
(式中，Z4表示Glu、Gln或Asp。)
上述功能性肽优选为具有序列号1-17任一个所示氨基酸序列的肽。
上述功能性肽还可以是以下(e)或(f)记载的肽。(e)具有序列号18或19所示氨基酸序列的肽。(f)具有在序列号18或19所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列的肽。
上述功能性肽可以是具有以下式(5)所示的氨基酸序列的肽。
(5)α1-Leu-β1-Leu-γ1-Leu
(式中，α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His，γ1表示Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp。)
上述功能性肽，还可以是具有以下式(6)-(8)任一个所示氨基酸序列的肽。
(6)α1-Leu-β1-Leu-γ2-Leu
(7)α1-Leu-β2-Leu-Arg-Leu
(8)α2-Leu-β1-Leu-Arg-Leu
(各式中的α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，α2表示Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或Hi s，β2表示Asn、Arg、Thr、Ser或His，γ2表示Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp。)
上述功能性肽还可以是具有序列号20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、38、39、40或152所示氨基酸序列的肽。
上述功能性肽还可以是具有序列号36或37所示氨基酸序列的肽。
上述功能性肽为是具有上式任一个所示氨基酸序列的肽或者上述序列号所示的任何肽，由于大多数为极短的肽，因此合成容易，能够有效率地抑制上述转录因子的目标基因的转录。上述功能性肽具有下述功能，即优先于功能上重复(冗余)的其他转录因子的活性而抑制目标基因的表达。因此，能够有效地达到抑制目标基因表达的效果。
本发明所涉及植物体的特征为其是通过上述生产方法生产的不育性植物体。在上述不育性植物体中，优选包括发育的植物个体、植物细胞、植物组织、愈合组织、种子中的至少一个。
本发明涉及的不育性植物体的生产试剂盒，为用于进行上述生产方法的试剂盒，其特征在于至少含有下述物质：编码转录因子的基因，该转录基因促进与花器形成、雄蕊或雌蕊的形成、花药开裂、或者雄蕊和雌蕊的形成相关基因的表达、编码功能性肽的多核苷酸，该功能性肽的多核苷酸将任意转录因子转变为转录抑制因子、以及含有启动子的重组表达载体。上述不育性植物体的生产试剂盒还可以含有用于将上述重组表达载体导入至植物细胞的试剂群。
本发明的其他目的、特征和优点，可以通过下述说明充分了解。本发明的利益可以通过参照附图的下述说明而了解。
附图说明
[图1(a)]所示为在实施例中通过重组表达载体p35S::APETALA35SRDX被形质(性状)转变了的白犬荠的全部成长了的植物体。
[图1(b)]所示为在实施例中通过重组表达载体p35S::APETALA35SRDX被形质转变了的白犬荠的成长了的植物体的前端放大图。
[图1(c)]所示为将在实施例中通过重组表达载体p35S::APETALA35SRDX被形质转变了的白犬荠的成长了的植物体的花器放大图。
[图2]所示为在实施例中所用的、用于构建重组表达载体的构建用载体的构建方法的工序图。
[图3]所示为在实施例中所使用的构建用载体p35SG中，编入编码转录抑制转变肽SRDX的基因和NACAD1基因的工序图。
[图4]所示为在实施例中所使用的构建用载体p35SG中，编入编码转录抑制转变肽SRDX的基因和MYB26基因的工序图。
[图5]所示为在实施例中所使用的构建用载体p35SG中，编入编码转录抑制转变肽SRDX的基因和AG基因的工序图。
[图6]所示为形质转变用载体pBIGCKH的构建方法的工序图。
[图7(a)]所示为在实施例中由重组表达载体pBIG-NACAD1SRDX加以形质转变的白犬荠的花药形状。
[图7(b)]所示为野生型白犬荠的花药形状。
[图8]所示为在实施例中由重组表达载体pBIG-NACAD1SRDX加以形质转变的白犬荠(右侧)和野生型白犬荠(左侧)。
[图9(a)]所示为相对于在实施例中由重组表达载体pBIG-NACAD1SRDX加以形质转变的白犬荠的“收获的种子的质量×100/种子以外地上部分的干燥重量”的等级值，绘制的个体数的图表。
[图9(b)]所示为相对于野生型白犬荠的“收获的种子的质量×100/种子以外地上部分的干燥重量”的等级值，绘制的个体数的图表。
[图10]所示为研究在实施例中，在由pBIG-NACAD1SRDX加以形质转变的、花药开裂被抑制的植物体中将花药内花粉取出、使其授粉时，是否结果实的图。
[图11(a)]所示为野生型白犬荠的花药形状。
[图11(b)]所示为在实施例中由重组表达载体pBIG-MYB26SRDX加以形质转变的白犬荠的花药形状。
[图12(a)]所示为相对于野生型白犬荠“结果实的荚的数/开花了的花数×100”的等级值，绘制的个体数的图表。
[图12(b)]所示为绘制在实施例中由重组表达载体pBIG-MYB26SRDX加以形质转变的白犬荠的“结果实的荚的数/开花了的花数×100”的图表。
[图13(a)]所示为通过pBIG-AGSRDX形质转变、成为完全的重叠花瓣的白犬荠的花。
[图13(b)]所示为花的形态变为重叠花瓣的白犬荠的全体。
[图14(a)]所示为野生型白犬荠的花。
[图14(b)]所示为AG变异体的白犬荠的花。
[图15]所示为由重组表达载体pBIG-AGSRDX加以形质转变、成为不完全重叠花瓣的白犬荠花。
[图16]所示为由重组表达载体pBIG-AGSRDX加以形质转变、成为接近于野生型形态的白犬荠的花。
具体实施方式
以下以图1(a)-图16为基础对本发明一实施方式进行说明。本发明并不限定于此。
本发明为生产不育性植物体的技术，是在植物体内生产嵌合体蛋白质的技术，此嵌合体蛋白质融合有促进与花器形成相关基因转录的转录因子、以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。由此得到的植物体中，由于不能形成正常的花粉，因此通过本发明能够生产雄性不育植物体。
这里，不能形成正常花粉起因如下。即，在上述嵌合体蛋白质中的来自于上述转录因子的DNA结合域与被推测为与花器形成相关的目标基因相结合。上述转录因子被转变为转录抑制因子，目标基因的转录被抑制。由此，雄蕊的形成被阻碍等，从而能够得到不能形成正常花粉的雄性不育植物体。
在本发明的生产方法中生产的雄性不育体(本雄性不育体)不能形成正常花粉。即，在本雄性不育体的例子中有，雄蕊的形成被阻碍、完全没有形成花粉的本雄性不育体，虽然形成了雄蕊、但由于没有形成花药所以没有形成花粉的本雄性不育体，虽然雄蕊和花药都形成、但形成的花粉的量少、花药不能开裂的本雄性不育体，以及形成的花粉肥大互相粘结、完全不飞散的本雄性不育体等。
在本雄性不育体中，雌蕊具有生育性。因此，可以向本雄性不育体进行其他种花粉的授粉。因此，通过利用了杂种优势的交配，可以得到一代杂种。
在本雄性不育体中，除了不能形成正常花粉，其他组织的形成不能正常进行也是可以的。例如，本雄性不育体可以是花瓣、花萼等形成为与通常不同的形态，或者也可以是花瓣、花萼完全没有形成。例如，如果花瓣、花萼完全没有形成的话，则由于雌蕊露出，因此可将授粉其他种花粉时的工序(除去花萼、花瓣等)简单化。
本发明为抑制植物体花药开裂的技术，在植物体中生产嵌合体蛋白质，此嵌合体蛋白质融合有促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。由此得到的植物体中，与花药开裂相关基因的转录被抑制，能够生产花药开裂被抑制的植物体。
这里，花药开裂被抑制如下。即，上述嵌合体蛋白质中来源于上述转录因子的DNA结合域与被推测为和花药开裂相关的目标基因相结合。上述转录因子被转变为转录抑制因子，目标基因的转录被抑制。由此，被推测为与花药开裂相关的蛋白质的生成减少，其结果，能够抑制所得植物体的花药的开裂。
本发明为抑制植物体花药开裂的技术，在植物体内生产嵌合体蛋白质，此嵌合体蛋白质融合有可促进与花药开裂相关基因转录、并具有MYB域的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。由此得到的植物体中，与花药开裂相关的基因的转录被抑制，从而能够生产花药开裂被抑制的植物体。
目前，抑制基因工作的方法为普通的RNAi法时，有时由于细胞不同，转染的效率低、效果有限。因此，使用RNAi法时，难以决定目标部位，一定会有试行错误。并且，结构难以建立。本发明涉及的方法中，通过将嵌合体基因导入至植物体中，此嵌合体基因在编码上述转录因子的基因上结合有编码上述功能性肽的基因，能够非常简便地抑制目标植物的花药的开裂。
在通过本发明涉及的生产方法生产的、花药开裂被抑制的植物体中，含有花药完全不开裂的植物体和花药不完全开裂的植物体。这里，所谓的花药为雄蕊的一部分，是制造花粉的袋状部分。在进行闭花受精的植物(豆科)中，虽然花粉在花药内发芽，通过看不到纤维状细胞层发展的柔软花药壁将花粉管伸长，但一般来说，花药开裂将花粉释放到花药外面。口边细胞的细胞死亡，因此花药壁被切断，由此引起花药开裂。如果仅是口边细胞被切断，则花药不开口，为了将花粉释放，花药壁必须反折弯曲。本发明中所谓的花药开裂被抑制的植物体，可以是仅口边细胞被切断的植物体，也可以是口边细胞被切断且花药壁反折、花药开口的植物体。所谓的口边细胞是指位于花药开口部分，一层由小细胞构成的组织。
在本发明的花药开裂被抑制的植物体中，雌性器官(雌蕊)具有生育性。由此，在本发明的花药开裂被抑制的植物体中可以进行其他种花粉的授粉。因此，可以不进行人为地将雄性器官除去、人为使其交配的工序，就可以通过利用了杂种优势的交配得到杂种第1代(F1)品种。
另外，在本发明的花药开裂被抑制的植物体中，只要花药的开裂被抑制即可，花粉本身可以具有生育性也可以没有生育性，但优选花粉本身具有生育性。这样，可以生产花粉本身留有生殖功能、但不自体授粉的植物体，在育种等中有用。即，在花粉本身不具生育性的雄性不育体中，由于不能利用自身的花粉，因此不能够制出、维持通过自我繁殖的同质接合性的个体。通过将异质接合性的个体进行自体授粉，虽然能够制出同质接合性的个体，但此情况下也只能得到1/4的同质接合性个体。与此相对，在花粉本身留有生殖功能，则能够制出、维持同质接合性的个体，可考虑应用于育种上。
另外，本发明为生产重叠花瓣植物体的技术，其通过在植物体内生产嵌合体蛋白质，生产重叠花瓣植物体，上述嵌合体蛋白质融合有与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
在生产上述嵌合体蛋白质的方法中，上述转录因子被上述功能性肽转变为转录抑制因子。因此，在上述嵌合体蛋白质中来自于转录因子的DNA结合域与转录因子的目标基因结合，由此抑制转录因子的目标基因的转录。其结果，与雄蕊和雌蕊形成相关的基因失去功能，上述组A的功能遍及花的整个领域，因此雄蕊变为花瓣、在野生型中作为雌蕊的区域产生了新的花，形成重叠花瓣植物体。即，如图13(A)所示，从外侧开始以花萼、花瓣、花瓣的顺序反复形成花。
上述嵌合体蛋白质抑制上述转录因子的目标基因转录的形质(性状)为优势的。即，即便存在与雄蕊和雌蕊形成相关的正常基因，转录因子的目标基因的转录被抑制了的变异型基因也优先表达。也就是说，上述嵌合体蛋白质比上述转录因子更具有优势地起作用，从而抑制目标基因的转录。
因此，能够在短时间简便地、确实地生产重叠花瓣植物体。并且，所得重叠花瓣植物体成为不形成种子的不育性植物体。在上述不育性植物体中，除了雄蕊和雌蕊都完全没有形成的完全不育性植物体之外，还包含形成不完全的雄蕊样器官和/或雌蕊样器官、但种子形成被抑制的不育性植物体。
在上述不育性植物体中，不形成种子。在上述完全不育性植物体中，不发生花粉的离散。因此，能够防止基因重组植物向环境中的扩散。
以下的说明中，分别对本发明涉及的不育性植物体的生产方法中所用蛋白质、本发明涉及的植物体的生产方法一例、由此方法得到的植物体及其有用性、以及其利用进行说明。
(1)本发明中使用的嵌合体蛋白质
如上所述，本发明中使用的嵌合体蛋白质，融合有促进基因转录的转录因子以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽，上述“促进基因转录”中的基因包括与花器形成相关的基因、与雄蕊或雌蕊形成相关的基因、与花药开裂相关的基因、或者雄蕊和雌蕊形成相关的基因。促进与花药开裂相关基因转录的转录因子可以是具有MYB域的转录因子。
另外，本发明中使用的嵌合体蛋白质，相对于内源性基因，是优势地发挥作用的蛋白质。即，本发明涉及的嵌合体蛋白质，即便植物为二倍体、复二倍体，或者植物中存在有功能重复的基因，，能够同样地抑制该转录因子所控制的与花器形成相关的基因、与雄蕊或雌蕊形成相关的基因、与花药开裂相关的基因、或者与雄蕊和雌蕊形成相关的基因的表达。因此，能够容易地将可进行基因导入的所有植物性状(形质)改变为不育性植物体、雄性不育体、花药开裂被抑制的植物体或者重叠花瓣植物体。
以下，分别对上述转录因子和功能性肽进行说明。
(I-1-a)促进与花器形成相关的基因转录的转录因子
本发明中使用的转录因子，只要是能够促进与花器形成相关基因转录的转录因子即可，没有特别限定。此转录因子被保存在多数植物中。因此，本发明中使用的转录因子中含有被保存在各种植物中具有同样功能的蛋白质。
作为这种转录因子有含有MADS Box转录因子的APETALA3蛋白质、PISTILLATA蛋白质，但并不限定于这些。
作为本发明所用转录因子的代表例，如可举出APETALA3蛋白质。APETALA3蛋白质为具有序列号134所示氨基酸序列的蛋白质，如上所述，已知是促进与花器形成相关基因转录的转录因子。另外，在白犬荠中，在编码此APETALA3蛋白质的基因(为了说明方便，称为APETALA3基因)的变异株中，已知花瓣和雄蕊的形成被阻碍(参照Thomas Jack，Laura L.Brockman，and Elliot M.Meyerrowitz.，Cell，Vol 68，pp 683-697，February，1992)。本发明中，通过在此APETALA3蛋白质中融合后述的功能性肽，将转录因子APETALA3蛋白质转变为转录抑制因子。
作为本发明中使用的转录因子，并不限定于具有序列号134所示氨基酸序列的APETALA3蛋白质，只要是具有促进与花器形成相关基因表达的功能的转录因子即可。具体地说，即便是由在序列号134所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列而构成的蛋白质，如果具有上述功能，就可用在本发明中。上述“在序列号134中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列”中的“1个或多个”的范围没有特别限定，如可是1-20个，优选为1-10个，更优选为1-7个，进一步优选为1-5个，最优选为1-3个。
本发明中使用的、促进与花器形成相关基因转录的转录因子的氨基酸序列，在不同种的数量众多的植物之间，是保守性(保存性)高的序列。因此，在希望生产雄性不育体的各个植物体中，没有必要将促进与花器形成相关基因表达的固有转录因子及其基因分离。即，如后述实施例中所示，通过将在白犬荠中构建的嵌合体蛋白质导入至其他植物中，在各种植物中能够简便地生产雄性不育体。
生产本发明中所用的嵌合体蛋白质时，如后所述，适合使用公知的基因重组技术。因此，在本发明涉及的植物体生产方法中，也适合使用编码上述转录因子的基因。
作为编码上述转录因子的基因没有特别限定，但作为具体例，作为转录因子，当使用APETALA3蛋白质时，可以举出此APETALA3基因。作为APETALA3基因的具体例，如可举出将序列号135所示碱基序列作为开放读码框区域(ORF)含有的多核苷酸。
当然，作为本发明中使用的APETALA3基因或者编码转录因子的基因，并不限定于上述例，只要是与序列号135所示碱基序列具有相同性的基因即可。具体地说，可以举出在严格条件下杂交由序列号135所示碱基序列构成的基因和由互补碱基序列构成的基因、且编码上述转录因子的基因等。这里所谓的在严格条件下杂交是指在60℃、2×SSC洗脱条件下结合的意思。
上述杂交可以通过J.Sambrook et al.Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中所述方法等以往公知的方法进行。通常，温度越高、盐浓度越低，严格性变得越高(杂交变得困难)
获得编码上述转录因子的基因的方法没有特别限定，可以通过公知的方法从众多植物中分离。例如，可以使用以已知转录因子碱基序列为基础制作的引物对。使用此引物对，将植物的cDNA或者基因组DNA作为模板进行PCR等可以得到上述基因。编码上述转录因子的基因也可以通过以往公知的方法化学合成得到。
(I-1-b)促进与花药开裂相关基因转录的转录因子
本发明中使用的转录因子，只要是能够促进与花药开裂相关基因转录的转录因子即可，没有特别限定。通常，花药裂开，将花粉释放到花药外面。因此，促进与花药开裂相关基因转录的转录因子被保存在多数植物中。因此，在本发明中使用的转录因子中包括保存在各种植物中的、具有同样功能的转录因子。
本发明中使用的转录因子的代表例如可举出NACAD1蛋白质。NACAD1蛋白质为具有序列号136所示氨基酸序列的蛋白质，如上所述，为白犬荠的NAC家族蛋白质的1个。本发明中，通过在此NACAD1蛋白质中融合后述的功能性肽，将为转录因子的NACAD1蛋白质转变为转录抑制因子。
作为本发明中使用的转录因子，并不限定于具有序列号136所示氨基酸序列的NACAD1蛋白质，只要是促进与花药开裂相关基因转录的转录因子即可。具体地说，即便是由在序列号136中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成的蛋白质，只要是具有上述功能，就可用在本发明中。上述“在序列号136中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列”中的“1个或多个”的范围没有特别限定，如可是1-20个，优选为1-10个，更优选为1-7个，进一步优选为1-5个，最优选为1-3个。
作为上述转录因子，为相对于序列号136中所示氨基酸序列具有20％以上、优选为50％以上、更优选为60％或70％以上相同性的蛋白质，而且还包括具有促进与花药开裂相关基因转录的功能的蛋白质。这里所谓的“相同性”是指在氨基酸序列中占有相同序列的比例，其值越高则说明两者亲缘性越近。作为上述转录因子，如可举出上述相同性为52％、与NACAD1蛋白质相同功能的NAC因子，此NACAD1蛋白质具有序列号136所示的氨基酸序列。
生产本发明中所用的嵌合体蛋白质时，如后所述，适于使用公知的基因重组技术。因此，在本发明涉及的植物体生产方法中也适于使用编码上述转录因子的基因。
作为编码上述转录因子的基因没有特别限定，只要是以遗传密码为基础，与上述转录因子的氨基酸序列相对应的基因即可。作为具体例，如作为转录因子使用NACAD1蛋白质时，可以举出编码此NACAD1蛋白质的基因(为了说明上的方便，称为NACAD1基因)。作为此NACAD1基因的具体一例，如将序列号137所示碱基序列作为开放读码框区域(ORF)含有的多核苷酸。
当然，作为本发明中使用的NACAD1基因或者编码转录因子的基因，并不限定于上述例，只要是与序列号137所示碱基序列具有相同性的基因即可。具体地说，可以举出在严格条件下杂交由序列号137所示碱基序列构成的基因和由互补碱基序列构成的基因、且编码上述转录因子的基因等。这里“在严格条件杂交”的意思同上。
上述杂交，如上可述，可以通过以往公知方法进行。获得编码上述转录因子的基因的方法也没有特别限定，如上所述，可以通过以往公知的方法从众多植物中分离出来。编码上述转录因子的基因，如上所述，可以通过以往公知的方法化学合成获得。
(I-1-c)具有MYB域的转录因子，其为促进与花蕊开裂相关基因转录的转录因子
本发明中使用的转录因子，只要是能够促进与花蕊开裂相关基因转录的转录因子、且具有MYB域的转录因子即可，没有特别限定。这里，所谓的MYB域是指与为癌基因之一的myb基因产物具有相同性的、将约50氨基酸残基作为1个单位的区域。具有此MYB域的转录因子称为MYB转录因子家族，MYB域被保存在动物和植物的许多物种中。本发明中使用的转录因子为属于上述MYB转录因子家族的转录因子，只要是促进与花药开裂相关基因转录的转录因子即可。通常，花药裂开，将花粉释放到花药外面。因此，在本发明中使用的转录因子中包括保存在各种植物中的、具有同样功能和同样区域的转录因子。
作为这种转录因子可以举出通过白犬荠MYB26蛋白质、水稻NP_916576.1(GenBank登录号)编码的蛋白质等，但上述转录因子并不限定于这些。
作为本发明中使用的转录因子的代表例，可以举出白犬荠MYB26蛋白质。MYB26蛋白质可以举出由序列号138所示氨基酸序列构成的蛋白质，如上所述，为白犬荠的MYB转录因子家族的一个。已知，特别在高等生物中，存在多个由可变剪接产生的剪接变异体，在MYB26蛋白质中，也存在多个剪接变异体。因此，在上述MYB26蛋白质中，不限于由序列号138所示氨基酸序列构成的蛋白质，只要是具有促进与花药开裂相关基因转录功能的转录因子，也包括上述剪接变异体。本发明中，通过将功能性肽融合在此MYB26蛋白质中，将作为转录因子的MYB26蛋白质转变为转录抑制因子。
对于MYB26蛋白质的目标、即与花药开裂有关的基因还不是很明确，但此转录因子MYB26基因的目标基因被推测为是在花药中负责木质素合成的酶等的基因。即，推测MYB26转录因子正相调控在花药中负责木质素合成的酶等的基因表达。对于木质素合成与花药开裂的关系，被认为是花药壁的内皮细胞由于木质化和脱水而收缩，于是花药以裂口(日文：ストミウム，英文：Stomium)为中心左右分开。因此，本发明中使用的转录因子的目标基因是在花药中负责木质素合成的酶等的基因时，本发明中使用的转录因子可以说是促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，并且是正相调控负责木质素合成的酶等的基因表达的转录因子。
作为本发明中使用的转录因子，并不限定于由序列号138所示氨基酸序列构成的MYB26蛋白质，可以是促进与花药开裂相关基因转录的MYB家族转录因子。具体地说，即便是由在序列号138所示氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列而构成的蛋白质，只要具有上述功能和MYB域就可用在本发明中。上述的“在序列号138所示氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“1个或多个”的范围没有特别限定，如可是1-20个，优选为1-10个，更优选为1-7个，进一步优选为1-5个，特别优选为1-3个。
作为上述转录因子，为相对于序列号138中所示氨基酸具有20％以上、优选为50％以上、更优选为60％或70％以上相同性的蛋白质，而且还包括具有促进与花药开裂相关基因转录的功能及MYB域的蛋白质。这里所谓的相同性是指在氨基酸序列中占有相同序列的比例，其值越高则说明两者亲缘性越近。
本发明中使用的促进与花药开裂相关基因转录且具有MYB域的转录因子的氨基酸序列，在不同种的数量众多植物间保守性(保存性)高。因此，在希望抑制花药开裂的各个植物体中，不一定要分离此转录因子和编码此转录因子的基因。即，如后述实施例中所示，通过将编码在白犬荠中构建的嵌合体蛋白质的基因导入至其他植物中，就可以在多种植物中简便地生产花药开裂被抑制的植物体。
生产本发明中使用的嵌合体蛋白质时，如后所述，适于使用公知的基因重组技术。因此，在本发明涉及的植物体的生产方法中，也适于使用编码上述转录因子的基因。
作为编码上述转录因子的基因没有特别限定，只要是以遗传密码为基础、与上述转录因子的氨基酸序列相对应的基因即可。作为具体的一例，如作为转录因子，使用MYB26蛋白质时，可以举出编码此MYB26蛋白质的基因(为了说明上的方便，称为MYB26基因)。作为MYB26基因的具体例，可以举出将序列号139所示碱基序列作为开放读码框区域(ORF)含有的多核苷酸。
当然，本发明中使用的MYB26基因或者编码转录因子的基因并不限定于上述例，只要是与序列号139所示碱基序列具有相同性的基因即可。具体地说，可以举出在严格条件下杂交由序列号139所示碱基序列形成的基因与由互补碱基序列构成的基因，且编码上述转录因子的基因等。其中“在严格条件下杂交”的意思同上。
上述杂交，如上可述，可以通过以往公知方法进行。获得编码上述转录因子的基因的方法也没有特别限定，如上所述，可以通过以往公知的方法从众多植物中分离出来。编码上述转录因子的基因，如上所述，可以通过以往公知的方法化学合成获得。
(I-1-d)与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子
本发明中使用的转录因子只要是与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子即可，没有特别限定。在一实施方式中，本发明中所用的转录因子为由序列号140所示氨基酸序列构成的蛋白质、或者由序列号140所示氨基酸序列构成的蛋白质的变异体。由序列号140所示氨基酸序列构成的蛋白质为编码上述AG基因的转录因子，与雄蕊和雌蕊的形成有关。
作为变异体，可以举出含有缺失、插入、逆转、反复和型置换(如亲水性残基向其他残基的置换，但通常不将强亲水性残基向强疏水性残基置换)的变异体。特别是，蛋白质中的“中性”氨基酸置换几乎不影响其蛋白质的活性。
蛋白质的氨基酸序列中的某些氨基酸可以容易地改变，而对此蛋白质结构或功能并无有意义的影响，这在该领域中是众所周知的。并且，不仅仅是人为地进行改变，在天然蛋白质中，也存在并不使该蛋白质结构或功能产生有意义的变化的变异体。
本行业人员使用公知的技术可以容易地使蛋白质的氨基酸序列中1或数个氨基酸变异。如，根据公知的点变异导入法，可以将编码蛋白质的多核苷酸的任意碱基变异。另外，设计与编码蛋白质的多核苷酸任意部位相对应的引物，能够制作缺失变异体或附加变异体。进而，使用本说明书中记载的方法，则可以容易地决定所得变异体是否具有所需的活性。
优选的变异体具有置换、缺失或添加保守性(保存性)或非保守性(非保存性)氨基酸。更优选为沉默置换、添加和缺失，特别优选为保守性(保存性)置换。这些都不会改变本发明所涉蛋白质的活性。
被认为是保守性(保存性)置换的代表例有，脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的1个氨基酸向其他氨基酸的置换；羟基残基Ser和Thr的交换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换、以及芳香族残基Phe、Tyr之间的置换。
如上所述，与哪个氨基酸的变化在表现型上为沉默的(即，是否对功能具有有意义的有害效果)相关的指导可见Bowie，J.U.等人的“Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to AminoAcid Substitutions”，Science 247：1306-1310(1990)(在本说明书中作为参考被引用)。
本实施方式涉及的转录因子，优选为以下(a)或(b)记载的蛋白质：
(a)由序列号140所示氨基酸序列构成的蛋白质。
(b)由在序列号140所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列而构成的蛋白质。
上述“在(i)所述氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列”和“在序列号140所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或附加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“1个或多个”的范围没有特别限定，如可是1-20个，优选为1-10个，更优选为1-7个，进一步优选为1-5个，特别优选为1-3个。这种变异蛋白质，如上所述，并不限定于具有通过公知变异蛋白质制作方法人为导入的变异的蛋白质，也可以是将天然存在的蛋白质分离精制的产物。
本发明所涉蛋白质只要是氨基酸与肽结合的蛋白质即可，但并不限定于此，还可以是含有蛋白质以外结构的复合蛋白质。在本说明书中使用时，“蛋白质以外的结构”可以举出糖链、类异戊二烯基等，但没有特别限定。
另外，本发明所涉蛋白质还可以含有附加蛋白质。作为附加蛋白质，如可举出His、Myc、Flag等表位标记的蛋白质。
然而，花的同源异形基因分离自白犬荠、金鱼草等，不仅在双子叶植物中、在单子叶植物中也发挥同样的功能。因此，编码AG基因的转录因子等，与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子的氨基酸序列，在不同种的数量众多的植物间，保守性(保存性)高。因此，在各个植物体形成重叠花瓣植物体时，不一定非要将与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子及其基因分离出来。即，如后述实施例所示，将在白犬荠中构建的嵌合体蛋白质导入至其他植物中，能够在不同种植物中生产重叠花瓣植物体。
生产本发明中所用嵌合体蛋白质时，如后述，适于使用公知的基因重组技术。因此，在本发明涉及的植物体的生产方法中，也适于使用编码上述转录因子的基因(多核苷酸)。
编码上述转录因子的基因以RNA(如mRNA)的形态或DNA的形态(如cDNA或基因组DNA)存在。DNA可为双链也可为单链。单链DNA或RNA可以是编码链(作为有意义链而周知)、也可以是非编码链(作为反意义链而周知)。
编码上述转录因子的基因还可以是编码与雄蕊和雌蕊形成相关转录因子的基因的变异体。变异体，如天然的对立基因变异体，可自然产生。“对立基因变异体”是指占据生物染色体上规定基因座的基因的数个可交换形态中的一个。天然中不存在的变异体，可以使用该领域中周知的变异诱发技术来产生。
作为这种变异体可以举出在编码上述转录因子的多核苷酸的碱基序列中，缺失、置换或者附加有1或数个碱基的变异体。变异体可在编码或非编码区域、或者双方区域中被变异。在编码区域的变异可以生成保守(保存)或非保守(保存)性的氨基酸缺失、置换或附加。
编码上述转录因子的基因，包括在严格的杂交条件下，与编码上述转录因子的基因或者该基因杂交的多核苷酸。
在一实施方式中，编码上述转录因子的基因优选为以下(c)或(d)记载的多核苷酸。
(c)将序列号141所示碱基序列作为开放读码框区域含有的基因。
(d)在严格条件下杂交由序列号141所示碱基序列构成的基因和由互补碱基序列构成的基因，且编码与雄蕊和雌蕊形成相关蛋白质的基因。
上述“严格的条件”是指仅在序列间存在至少90％以上同一性、优选至少95％以上同一性、最优选97％以上同一性时发生杂交。
上述杂交如上所述可以利用以往公知的方法进行。通常，温度越高、盐浓度越低，严格性变得越高(杂交变得困难)，能够获得更相同的多核苷酸。作为杂交条件，可优选使用以往公知的条件，没有特别限定，如可举出42℃、6×SSPE、50％甲酰胺、1％SDS、100μg/ml鲑鱼精子DNA、5×デンハルト(Denhardt一种试剂-译注)液(1×SSPE；0.18M氯化钠、10mM磷酸钠、PH7.7、1mM EDTA。5×デンハルト液；0.1％牛血清蛋白、0.1％フイコ一ル(Ficoll试剂名-译注)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮)。
获得编码上述转录因子的基因的方法没有特别限定，可以通过公知的技术，使用将含有编码上述转录因子的多核苷酸的DNA片断分离、进行克隆的方法。如，调制与编码上述转录因子的基因的碱基序列的一部分特异性杂交的探针，筛选基因组DNA文库、cDNA文库。作为此探针，只要是特异性杂交于编码上述转录因子的基因的碱基序列或其互补序列的至少一部分的探针，可以使用任意序列和/或长度的探针。
或者，作为获得编码上述转录因子的基因的方法，可以举出PCR等扩增手段。例如，在编码上述转录因子的多核苷酸的cDNA中，从5’端和3’端的序列(或者其互补序列)中分别调制引物，使用这些引物将基因组DNA(或者cDNA)等作为模板进行PCR等，扩增夹在两引物间的DNA区域，由此可大量获得含有编码上述转录因子的多核苷酸的DNA片断。
(I-2)将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽
作为本发明中使用的将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽(为了说明的方便称为转录抑制转变肽)，没有特别限定，只要是通过形成与转录因子相融合的嵌合体蛋白质，能够抑制由该转录因子调控的目标基因之转录的肽即可。具体地说，可以举出由本发明人发现的转录抑制转变肽(参照专利文献3-9、非专利文献10、11等)。
本发明人发现，在转录因子上结合有为Class II ERF基因群一个的来源于白犬荠的AtERF3蛋白质、AtERF4蛋白质、AtERF7蛋白质、AtERF8蛋白质的蛋白质，显著地抑制了基因的转录。因此，构建效应质粒，其含有分别编码上述蛋白质的基因和从其中剪切出来的DNA，将其导入至植物细胞，由此在实质上成功地抑制了基因的转录(如参照专利文献3-6)。另外，对编码为Class II ERF基因群一个的烟草ERF3蛋白(如参照专利文献7)、水稻OsERF3蛋白质(如参照专利文献8)的基因，以及编码为锌指蛋白基因群一个的白犬荠ZAT10、白犬荠ZAT11的基因进行与上述相同的试验，发现抑制了基因的转录。本发明人发现这些蛋白质在羰基末端区域中具有含天冬氨酸-亮氨酸-天门冬酰胺(DLN)的共同基序。对此具有共同基序的蛋白质进行研究，结果发现抑制基因转录的蛋白质也可以是极单纯结构的肽，具有这些单纯结构的肽，具有把任意转录因子变换为转录抑制因子的功能。
本发明人还发现，白犬荠SUPPERMAN蛋白质虽然具有与上述共同基序不一致的基序，但具有将任意转录因子变换为转录抑制因子的功能；在转录因子的DNA结合域或者编码转录因子的基因上结合编码该SUPPERMAN蛋白质的基因的嵌合体基因，产生具有强大转录抑制功能的蛋白质。
因此，作为本发明中使用的转录抑制转变肽的一例，在本实施方式中可以举出为Class II ERF蛋白质的白犬荠来源的AtERF3蛋白质、同来源的AtERF4蛋白质、同来源的AtERF7蛋白质、同来源的AtERF8蛋白质、烟草ERF3蛋白质、水稻OsERF3蛋白质，为锌指蛋白之一的白犬荠ZAT10蛋白质、白犬荠同类的ZAT11蛋白质等蛋白质、同类的SUPPERMAN蛋白质、以及从这些蛋白剪切出来的肽等，具有上述功能的合成肽等。
上述转录抑制转变肽的一例的具体结构为下述式(1)-(4)任一个所示的氨基酸序列。
(1)X1-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3
(式中，X1表示0-10个氨基酸残基、X2表示Asn或Glu、X3表示至少6个的氨基酸残基。)
(2)Y1-Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3
(式中，Y1表示0-10个氨基酸残基、Y2表示Phe或Ile、Y3表示至少6个的氨基酸残基。)
(3)Z1-Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3
(式中，Z1表示Leu、Asp-Leu或Leu-Asp-Leu，Z2表示Glu、Gln或Asp，Z3表示0-10个氨基酸残基。)
(4)Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu
(式中，Z4表示Glu、Gln或Asp。)
(I-2-1)式(1)的转录抑制转变肽
在上述式(1)的转录抑制转变肽中，只要上述X1所示氨基酸残基的数量在0-10的范围内即可。构成X1所示氨基酸残基的具体氨基酸种类没有特别限定，可以是任何种类。换言之，在上述式(1)的转录抑制转变肽中，在N末端侧上可付加上由1个任意氨基酸或2-10个任意氨基酸残基构成的寡聚物、也可以不附加任何氨基酸。
从合成式(1)的转录抑制转变肽时的简单性看，此X1所示氨基酸残基要尽可能短。具体地说，优选为10个以下，更优选为5个以下。
同样，在上述式(1)的转录抑制转变肽中，上述X3所示氨基酸残基的数目至少为6个即可。构成X3所示氨基酸残基的具体氨基酸种类没有特别限定，可以是任何种类。换言之，在上述式(1)的转录抑制转变肽中，只要在C末端侧附加有由6个以上任意氨基酸残基构成的寡聚物即可。上述X3所示氨基酸残基最低有6个，即可显示上述功能。
在上述式(1)的转录抑制转变肽中，由除X1和X3以外的5个氨基酸残基构成的五聚体(5mer)的具体序列如序列号41、42所示。上述X2为Asn时，氨基酸序列为序列号41所示的氨基酸序列，上述X2为Glu时，氨基酸序列为序列号42所示的氨基酸序列。
(I-2-2)式(2)的转录抑制转变肽
在上述式(2)的转录抑制转变肽中，与上述式(1)转录抑制转变肽的X1同样、只要上述Y1所示氨基酸残基的数量在0-10个的范围内即可。构成Y1所示氨基酸残基的具体氨基酸种类没有特别限定，可以是任何一种。换言之，在上述式(2)的转录抑制转变肽中，与上述式(1)的转录抑制转变肽同样，在N末端侧上可付加上由1个任意氨基酸或2-10个任意氨基酸残基构成的寡聚物、也可以不附加任何氨基酸。
从合成式(2)的转录抑制转变肽时的简单性看，此Y1所示氨基酸残基要尽可能短。具体地说，优选为10个以下，更优选为5个以下。
同样，在上述式(2)的转录抑制转变肽中，与上述式(1)转录抑制转变肽的X3同样，只要上述Y3所示氨基酸残基的数目至少为6个即可。构成Y3所示氨基酸残基的具体氨基酸种类没有特别限定，可以是任何种类。换言之，在上述式(2)的转录抑制转变肽中，与上述式(1)的转录抑制转变肽同样，只要在C末端侧附加有由6个以上任意氨基酸残基构成的寡聚物即可。上述Y3所示氨基酸残基最低有6个，即可显示上述功能。
在上述式(2)的转录抑制转变肽中，由除Y1和Y3以外的5个氨基酸残基构成的五聚体(5mer)的具体序列如序列号43、44所示。上述Y2为Phe时，氨基酸序列为序列号43所示的氨基酸序列，上述Y2为Ile时，氨基酸序列为序列号44所示的氨基酸序列。由除了Y2以外的4个氨基酸残基构成的四聚体(4mei)的具体序列如序列号45所示。
(I-2-3)式(3)的转录抑制转变肽
在上述式(3)的转录抑制转变肽中，上述Z1所示氨基酸残基为在1-3个范围内含有Leu的物质。1个氨基酸时为Leu、2个氨基酸时为Asp-Leu、3个氨基酸时为Leu-Asp-Leu。
另一方面，上述式(3)的转录抑制转变肽中，与上述式(1)的转录抑制转变肽的X1相同、只要上述Z3所示氨基酸残基的数量为0-10个的范围内即可。构成Z3所示氨基酸残基的具体氨基酸种类没有特别限定，可以是任何种类。换言之，在上述式(3)的转录抑制转变肽中，在C末端侧上可付加上由1个任意氨基酸或2-10个任意氨基酸构成的寡聚物、也可以不附加任何氨基酸。
从合成式(3)的转录抑制转变肽时的简单性看，此Z3所示氨基酸残基要尽可能短。具体地说，优选为10个以下，更优选为5个以下。Z3所示氨基酸残基的具体例为Gly、Gly-Phe-Phe、Gly-Phe-Ala、Gly-Tyr-Tyr、Ala-Ala-Ala等，但不限定于这些。
此式(3)所示转录抑制转变肽全体的氨基酸残基数量没有特别限定，但从合成时的简单性看，优选为20个氨基酸以下。
在上述式(3)的转录抑制转变肽中，由Z3以外的7-10个氨基酸残基构成的寡聚物的具体序列如序列号46-54所示。上述Z1为Leu且Z2为Glu、Gln或Asp时的氨基酸序列分别为序列号46、47或48所示的氨基酸序列；上述Z1为Asp-Leu且Z2为Glu、Gln或Asp时的氨基酸序列分别为序列号49、50或51所示的氨基酸序列；上述Z1为Leu-Asp-Leu且Z2为Glu、Gln或Asp时的氨基酸序列分别为序列号52、53或54所示的氨基酸序列。
(I-2-4)式(4)的转录抑制转变肽
上述式(4)的转录抑制转变肽，为由6个氨基酸残基构成的六聚物(6mer)，其具体序列示于序列号5、14、55。上述Z4为Glu时的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；上述Z4为Asp时的氨基酸序列为序列号14所示的氨基酸序列；上述Z4为Gln时的氨基酸序列为序列号55所示的氨基酸序列。
特别是，本发明使用的转录抑制转变肽还可以是具有如上述式(4)所示六聚物的最小序列的肽。如，序列号7所示的氨基酸序列与白犬荠SUPPERMAN蛋白质(SUP蛋白质)的第196-201号的氨基酸序列相当，如上所述，是本发明人首先将其作为上述转录抑制转变肽而发现。
(I-2-5)转录抑制转变肽的更具体的例子
作为上述各式所示转录抑制转变肽的更具体例子，如可举出具有如序列号1-17任一个所示氨基酸序列的肽。本发明人发现这些寡肽为上述转录抑制转变肽(如参照专利文献9)。
进而，作为上述转录抑制转变肽的其他具体例，可以举出如下(e)或(f)所示的寡肽。
(e)由序列号18或19所示任一个氨基酸序列构成的肽。
(f)在由序列号18或19所示任一个氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的肽。
由上述序列号18所示氨基酸序列构成的肽为SUP蛋白质。上述“在由序列号18或19所示任一个氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“1个或多个”的范围没有特别限定，如可是1-20个，优选为1-10个，更优选为1-7个，进一步优选为1-5个，特别优选为1-3个。
上述氨基酸的缺失、置换或者附加，可以利用在该技术领域中公知的方法将编码上述肽的碱基序列改变而实施。为了将变异导入至碱基序列中，可以通过Kunkel法或者Gapped duplex等公知方法或者以这些为基础的方法进行实施，如使用利用了部位特异性突然变异诱发法的变异导入用试剂盒(如Mutant-K、Mutant-G(均为商品名，TAKARA公司生产))等，或者LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名、TAKARA公司生产)将变异导入。
上述功能性肽，并不限定于具有序列号18所示氨基酸序列全长序列的肽，可以是具有其部分序列的肽。
作为具有其部分序列的肽，如可举出具有如序列号19所示氨基酸序列(SUP蛋白质的第175-204的氨基酸序列)的肽，作为具有其部分序列的肽，可举出上述(3)所示的肽。
(I-3)转录抑制转变肽的其他例
本发明人对上述基序的结构进行了研究，结果发现新的由6个氨基酸构成的基序。此基序，具体地说，为具有如下通式(5)所示氨基酸序列的肽。这些肽也包含在上述转录抑制转变肽中。
(5)α1-Leu-β1-Leu-γ1-Leu
式(5)中的α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His，γ1表示Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp。
为了方便，将上述通式(5)所示的肽分类为具有如下通式(6)、(7)、(8)或(9)所示氨基酸的肽。
(6)α1-Leu-β1-Leu-γ2-Leu
(7)α1-Leu-β2-Leu-Arg-Leu
(8)α2-Leu-β1-Leu-Arg-Leu
(9)Asp-Leu-β3-Leu-Arg-Leu
上述各式中的α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，α2表示Asn、Glu、Gln、Thr或Ser。β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His，β2表示Asn、Arg、Thr、Ser或His，β3表示Glu、Asp或Gln。γ2表示Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp。
作为具有上述式(5)-(9)所示氨基酸序列的转录抑制转变肽的具体例，如可举出具有由序列号20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、38、39、40或152所示氨基酸序列的肽。其中，序列号27、28、30、32、38、39、40或152的肽与通式(6)所示的肽相当；序列号20、23、33、34或35的肽与通式(7)所示的肽相当；序列号24、25、26、29或31的肽与通式(8)所示的肽相当；序列号21或22的肽与通式(9)所示的肽相当。
除了上述通式(5)-(9)所示的肽以外，还可以使用具有序列号36或37所示氨基酸序列的转录抑制转变肽。
(I-4)嵌合体蛋白质的生产方法
在上述(I-2)和(I-3)中说明的各种转录抑制转变肽，可以通过与在上述(I-1)中说明的转录因子融合、形成嵌合体蛋白质，将该转录因子变为转录抑制因子。因此，本发明中，只要使用编码上述转录抑制转变肽的多核苷酸，得到与编码转录因子的多核苷酸的嵌合体基因，就能够生产嵌合体蛋白质。
具体地说，通过连接编码上述转录抑制转变肽的多核苷酸(为了说明的方便，称为转录抑制转变多核苷酸)与编码上述转录因子的多核苷酸，构建嵌合体基因，导入至植物细胞中。由此能够生产嵌合体蛋白质。关于将嵌合体基因导入至植物细胞的具体方法，在后述(II)项中详细说明。
上述转录抑制转变多核苷酸的具体碱基序列没有特别限定，也可以是含有以遗传密码为基础，与上述转录抑制转变肽的氨基酸序列相对应的碱基序列。另外，根据需要，上述转录抑制转变多核苷酸，还可以含有用于与编码转录因子的多核苷酸相连接的连接部位用碱基序列。当上述转录抑制转变多核苷酸的氨基酸读取框与编码转录因子的多核苷酸的读取框不一致时，还可含有用于使它们变得一致的附加碱基序列。
作为上述转录抑制转变多核苷酸的具体例如可举出具有如56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132或153所示碱基序列的多核苷酸。序列号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133或154所示的多核苷酸是分别与上述例示的多核苷酸互补的多核苷酸。作为上述转录抑制转变多核苷酸的其他具体例，如可举出如序列号90、91所示的多核苷酸。这些多核苷酸，如下述表1所示，与序列号1-40、152所示的氨基酸序列相对应。
[表1]
  氨基酸序列   碱基序列   氨基酸序列   碱基序列
  序列号1   序列号56·57   序列号22   序列号96·97
  序列号2   序列号58·59   序列号23   序列号98·99
  序列号3   序列号60·61   序列号24   序列号100·101
  序列号4   序列号62·63   序列号25   序列号102·103
  序列号5   序列号64·65   序列号26   序列号104·105
  序列号6   序列号66·67   序列号27   序列号106·107
  序列号7   序列号68·69   序列号28   序列号108·109
  序列号8   序列号70·71   序列号29   序列号110·111
  序列号9   序列号72·73   序列号30   序列号112·113
  序列号10   序列号74·75   序列号31   序列号114·115
  序列号11   序列号76·77   序列号32   序列号116·117
  序列号12   序列号78·79   序列号33   序列号118·119
  序列号13   序列号80·81   序列号34   序列号120·121
  序列号14   序列号82·83   序列号35   序列号122·123
  序列号15   序列号84·85   序列号36   序列号124·125
  序列号16   序列号86·87   序列号37   序列号126·127
  序列号17   序列号88·89   序列号38   序列号128·129
  序列号18   序列号90   序列号39   序列号130·131
  序列号19   序列号91   序列号40   序列号132·133
  序列号20   序列号92·93   序列号152   序列号134·135
  序列号21   序列号94·95
本发明中使用的嵌合体蛋白质，可以从嵌合体基因得到，此嵌合体基因连接有编码转录因子的基因和转录抑制转变多核苷酸。因此，在上述嵌合体蛋白质中，只要含有上述转录因子的部位和上述转录抑制转变肽的部位即可，其构成没有特别限定。如，还可以含有用于连接转录因子和转录抑制转变肽之间的、具有连接功能的多肽，用于表位标记His、Myc、Flag等嵌合体蛋白质的多肽等各种附加多肽。并且，在上述嵌合体蛋白质，根据需要，还可以含有多肽以外的结构，如糖链、类异戊二烯基等。
(II)本发明所涉植物体的生产方法的一例
本发明所涉植物体的生产方法，只要含有下述过程，即在植物体内生产上述(I)中说明过的嵌合体蛋白质，抑制与花器形成相关基因表达的过程，抑制花药开裂的过程，生产重叠花瓣植物体的过程，则没有特别限定，但如果将本发明所涉植物体的生产方法以具体的工序进行表示的话，则可举出包括表达载体构建工序、形质转变工序、选拔工序等工序的生产方法。其中，本发明中至少含有形质转变工序即可。以下，对各工序进行具体的说明。
(II-1)表达载体构建工序
本发明中进行的表达载体构建工序，只要是构建重组表达载体的工序，则没有特别限定。此重组表达载体含有在上述(I-1)中说明过的编码转录因子的基因、在上述(I-4)中说明过的转录抑制转变多核苷酸以及启动子。
作为成为上述重组表达载体母体的载体，可以使用以往公知的各种载体。如可以使用质粒、噬菌体或粘端质粒等，可以根据所导入的植物细胞、导入方法进行适当选择。具体地说，如可举出pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescript SK、pBI系的载体等。特别是，向植物体内导入载体的方法为使用土壤杆菌的方法时，优选使用pBI系的双载体。作为pBI系双载体，具体可举出pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。
上述启动子只要是能够在植物体内将基因表达的启动子即可，没有特别限定，可优选使用公知的启动子。作为此启动子，如可举出菜花花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、肌动蛋白启动子、胆脂碱合成酶的启动子、烟草的PR1a基因启动子、番茄的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶·氧化酶小亚基启动子等。其中，可优选使用菜花花叶病毒35S启动子或肌动蛋白启动子。如果使用这些启动子，所得的重组表达载体在被导入至植物细胞内时，能够使任意基因强列地表达。上述启动子优选使用能够使花药特异基因表达的启动子。作为此启动子，如可举出TA56启动子、AtMYB26启动子、DAD1启动子等。通过使用这种启动子，可以仅在花药中将编码上述嵌合体蛋白质的基因表达，而对其他组织没有影响、便可抑制花药的开裂。上述启动子，特别优选使用NACAD1等、在各种植物中保存的编码同样转录因子的基因启动子。通过使用此启动子，能够在该基因的表达时期和组织中特异性地将基因表达，能够更有效地抑制花药的开裂。
上述启动子，只要按照能够将嵌合体基因表达而被连接，导入至载体内即可，作为重组表达载体的具体结构没有特别限定，上述嵌合体基因连接有编码转录因子的基因和转录抑制转变多核苷酸。
上述重组表达载体，在上述启动子和上述嵌合体基因的基础上，还可以含有其他DNA区段。此其他的DNA区段没有特别的限定，可以举出终止子、选择标记、增强子、用于提高翻译效果的碱基序列等。上述重组表达载体，还可以具有T-DNA区域。在特别使用土壤杆菌将上述重组表达载体导入至植物体中时，T-DNA区域能够提高基因导入的效率。
终止子只要具有作为转录终止部位的功能即可，没有特别限定，可以使用公知的物质。如具体地说，可优选使用胆脂碱合成酶基因的转录终止区域(Nos终止子)、菜花花叶病毒35S的转录终止区域(CaMV35S终止子)等。其中可更优选使用Nos终止子。
在上述形质转变载体中，通过将终止子配置在适当位置，导入至植物细胞后，可以防止以下现象，如合成了不必要的长转录物，强大的启动子将质粒的拷贝数减少。
作为上述选择标记，例如可使用耐药性基因。此耐药性基因的具体例如可举出对潮霉素、腐草霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等药剂的耐药基因。由此，通过在含有上述抗生物质的培养基中选择培育的植物体，能够容易地选择形质转变了的植物体。
作为上述用于提高翻译效率的碱基序列，如可举出烟草花叶病毒来源的omega序列。通过将此omega序列配置在启动子的非翻译区域(5’UTR)，能够提高上述嵌合体基因的翻译效率。如此，在上述形质转变载体中，根据其目的，可以含有各种DNA区段。
对于上述重组表达载体的构建方法也没有特别限定，在适当选择的成为母体的载体上，按照规定顺序导入上述启动子、编码转录因子的基因和转录抑制转变多核苷酸，以及根据需要的上述其他DNA片段。如，连接编码转录因子的基因和转录抑制转变多核苷酸、构建嵌合体基因，接着将此嵌合体基因和启动子(根据需要和终止子等)连接，构建表达框，将其导入至载体中即可。
在嵌合体基因的构建和表达框的构建中，例如先将各DNA区段的剪切部位做成相互互补的突出末端，通过连接酶使其反应，能够规定该DNA区段的顺序。在表达框中含有终止子时，从上流开始按照启动子、上述嵌合体基因、终止子的顺序即可。另外，用于构建重组表达载体的试剂类、即对于限制酶、连接酶等的种类没有特别限定，可以适当选用市售物质。
上述重组表达载体的增殖方法(生产方法)也没有特别限定，可以使用以往公知的方法。一般来说，可以将大肠杆菌作为宿主在该大肠杆菌内增殖。此时，根据载体的种类，选择所需的大肠杆菌种类即可。
(II-2)形质改变工序
本发明中进行的形质改变工序可如下，将在上述(II-1)中说明过的重组表达载体导入至植物细胞中，生产上述(I)中说明过的嵌合体蛋白质。
将上述重组表达载体导入至植物细胞中的方法(形质改变方法)没有特别限定，可以使用与植物细胞相应的、适当的以往公知方法。具体地说，例如可使用利用土壤杆菌的方法、直接导入至植物细胞的方法。作为使用土壤杆菌的方法，如可使用Transformation of Arabidopsis thaliana byvacuum
infiltration( http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)。
作为将重组表达载体直接导入至植物细胞的方法，例如可使用微注射法、电导入法(电穿孔法)、聚乙烯二醇法、粒子枪法、原生质融合法、磷酸钙法等。
作为导入上述重组表达载体的植物细胞，如可举出花、叶、根等植物器官中的各组织的细胞、愈伤组织、混悬培养细胞等。
这里，本发明涉及的植物体生产方法中，上述重组表达载体可以与欲生产的种类的植物体相对应，适当地构建适宜的物质，也可以预先构建通用的重组表达载体，将其导入至植物细胞中。即，在本发明涉及的植物体生产方法中，可以含有上述(I-1)中说明过的重组表达载体构建工序，也可以不含有。
(II-3)其他工序、其他方法
在本发明涉及的植物体的生产方法中，可以含有上述形质改变工序，还可含有上述重组表达载体构建工序，还可进一步含有其他工序。具体地说，可以举出从形质改变后的植物体中选择适当形质改变体的选择工序等。
选择的方法没有特别限定，如可将耐潮霉素性等的耐药性作为标准进行选择，也可在培育形质改变体之后，在成长了的植物体中，以不能形成正常花粉为基准进行选择。也可以在培育形质改变体后，从花药开裂的状况进行选择。如，作为从花药开裂的状况进行选择的例子，如可举出使用电子显微镜、实体显微镜等观察花药形状的方法(参照后述实施例)。
另外，可在培育形质改变体后，从植物体本身的花的形态进行选择。例如，作为从花的形态进行选择的例子，可以举出将形质改变体的花的形态与未形质改变的植物体的花的形态相比较的方法(参照后述实施例)。特别是花的形态仅通过比较就能进行选择，由此可以确认本发明生产重叠花瓣植物的效果。
在本发明中涉及的植物体的生产方法中，由于将上述嵌合体基因导入至植物体内，因此从该植物体可以得到如下子孙，即通过有性生殖或无性生殖、与花器形成相关基因的表达被抑制的子孙。并且，能够得到花药的开裂被抑制了的子孙。进而，能够得到花的形态变为重叠花瓣的子孙。从该植物体或其子孙中得到植物细胞、种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、切穗、块根等繁殖材料，以这些材料为基础能够批量生产此植物体。因此，在本发明涉及的植物体的生产方法中，还可以含有将选择后的植物体繁殖的繁殖工序(批量生产工序)。
本发明中的植物体，含有发育了的植物个体、植物细胞、植物组织、愈伤组织、种子中的至少任一个。即，在本发明中，只要是最终能够发育为植物个体的状态的物质都可看作植物体。在上述植物细胞中含有各种形态的植物细胞，作为此植物细胞，如包括混悬培养细胞、原生质体、叶的切片等。通过增殖、分化这些植物细胞，能够得到植物体。从植物细胞的植物体的再生，可以根据植物细胞的种类使用以往公知的方法进行。因此，本发明涉及的植物体的生产方法，可以含有从植物细胞使植物体再生的再生工序。
另外，本发明涉及的植物体的生产方法，并不限定于以重组表达载体进行形质改变的方法，还可使用其它方法。具体地说，如可将上述嵌合体蛋白质本身投予给植物体。此时，可以在幼年期的植物体中投予嵌合体蛋白质，使得在最终利用的植物体部位抑制与花器形成相关基因的表达、抑制花药的开裂或者将花的形态变为重叠花瓣。嵌合体蛋白质的投予方法也没有特别限定，可以使用公知的各种方法。
(III)通过本发明得到的植物体及其有用性、以及其利用
本发明涉及的植物体的生产方法，在植物体内将编码上述嵌合体蛋白质的基因表达。在该嵌合体蛋白质中来自于转录因子的DNA结合域结合于被推定与花器形成相关的目标基因。这里，上述被推定是与花器形成相关的目标基因，可以是推定为与雄蕊或雌蕊形成相关的目标基因。并且如上所述，上述被推定是与雄蕊或雌蕊形成相关的目标基因，可以是被推定与花药开裂相关的基因。进而，还可以是被推定与雄蕊和雌蕊的形成相关的基因。
上述转录因子被转变为转录抑制因子，目标基因的转录被抑制。由此，在花器形成中产生变异，能够得到不育性植物体。另外，由此还能抑制花药的开裂。并且，由此能够将花的形态变为重叠花瓣。因此，本发明还包括通过上述植物体的生产方法得到的植物体。
本发明的“不育性植物体”中，除了包括未形成雄蕊和雌蕊的完全不育性植物体之外，还包括具有不亲合性的植物体，即形成了雄蕊和雌蕊、但不能形成种子的植物体。另外，还包括具有不完全的雄蕊样器官和/或雌蕊样器官、但不能形成种子的植物体。并且，还包括雄蕊的形成被阻碍、完全不形成花粉的不育性植物体，形成了雄蕊但不形成花药、因此不形成花粉的不育性植物体，雄蕊和花药都形成但形成的花粉的量少、花药达不到开裂的不育性植物体，形成的花粉肥大互相粘结在一起、完全不飞散的不育性植物体等等的所谓雄性不育植物体。
通过编码上述嵌合体蛋白质的嵌合体基因将目标植物形质改变的话，可以不利用复杂的基因重组技术就能非常简便地得到不育性植物体。上述不育性植物体不能形成种子。另外，在完全不育性植物体、雄性不育植物体中，不产生花粉的离散。因此，能够防止基因重组植物向环境的扩散。
上述雄性不育植物体，不能自体授粉，但能够在不同品种间交配。因此，很适合用于利用杂种优势的交配中，能够有效率地进行具有优异形质的杂种第一代的育种。
由于雄性不育确实是杂交种，因此不需要为了交配而除去雄蕊，减轻了大量劳力。因此，适于高效率的交配实验。
(III-1)本发明涉及的植物体的具体例
这里，本发明涉及的不育性植物体的具体种类没有特别限定，可以举出通过获得不育性、其有用性提高的植物，通过抑制花药的开裂、其有用性提高的植物，通过将花的形态变为重叠花瓣、其有用性提高的植物。该植物可以是被子植物也可以是裸子植物。作为裸子植物，可以举出杉目的杉科、松科、桧科植物，罗汉松科植物等。作为被子植物，可以是单子叶植物，也可是双子叶植物。作为双子叶植物，如可举出白犬荠等十字花科、山茶科等植物。
作为双子叶植物，可以是离瓣花亚纲，也可以是合瓣花亚纲。作为合瓣花亚纲，如可举出龙胆目、茄目、唇形目、水马齿目、车前草目、桔梗目、玄参目、茜草目、山萝卜目、菊目。作为离瓣花亚纲，可以举出如五亚果目、山茶目、延龄草目、玉蕊目、猪龙草目、堇菜目、杨柳目、白花菜目、杜鹃花目、岩梅目、柿树目、报春花目等。作为单子叶植物可以举出水稻、玉米、麦子等水稻科，谷精草科等植物。
本发明涉及的不育性植物体，可以是其果实、种子为商品的植物，也可以是花、植物体本身为商品的观赏植物(花卉植物)。因此，本发明涉及的不育性植物体的具体例，可以举出菜籽、马铃薯、菠菜、大豆、甘蓝、生菜、番茄、菜花、食荚菜豆、芜菁、萝卜、西兰花、甜瓜、橙子、西瓜、葱、牛蒡等各种食用植物，或者蔷薇、菊、绣球花、康乃馨等观赏植物。
(III-2)本发明的有用性
本发明在通过生产不育性植物体获得一定效果的领域中具有有用性。以下举出几个具体例，但本发明的有用性并不限定于这些。
首先，通过本发明的技术，能够制出不能形成正常花粉的雄性不育体，能够利用于通过杂种优势的交配进行的品种改良。在本发明的雄性不育植物体中，由于不能形成正常的花粉，因此即便是水稻等自殖性植物，也不进行自体授粉。因此，通过授粉其他种的花粉，可简便地进行种间交配。由此，能够简便且有效率地进行利用了杂种优势的优良品种的一代杂种的研究。
通过本发明的技术，能够制出花药开裂被抑制的植物体，能够利用于通过杂种优势的交配进行的品种改良。本发明的花药开裂被抑制的植物体中，由于花粉不被释放到花药外面，因此即便是水稻等自体受精性植物，也不进行自体授粉。因此，通过授粉其他种的花粉，简便地进行种间交配。由此，能够简便且有效率地进行利用了杂种优势的优良品种的一代杂种的研究。
本发明的技术也可适用于玉米等异体受精性植物。现在，在异体受精性植物中，通过利用人力将雄蕊割除的作业(除雄作业)来回避自体授粉，授粉其他种的花粉来进行品种改良。与此相对，如果通过本发明的技术生产雄性不育植物体或者花药开裂被抑制了的植物体，则不需要这种劳作，因此与现状相比，能够大大降低品种改良所必需的时间、成本或者优良品种的栽培中必要的劳力。
特别是，通过本发明的技术，能够制出花粉具有生育性、但花药开裂被抑制了的植物体，因此能够生产出在花粉本身中残留有生殖性能、不进行自体授粉的植物体，在育种等中有用。即，通过在花粉本身中残留生殖性能，能够制出、维持同质接合性的个体。通过自体交配这种纯系植物，能够得到均一的种子繁殖集团，能够减轻进行选择作业的劳力、时间。
本发明的技术，也能应用于洋葱、马铃薯等以地下茎为商品的植物中。众所周知，在此种植物中，当发生受粉时，地下茎的成长被显著阻碍，商品价值下降。因此，现在为了避免受粉，除雄作业是必需的，用于此的劳力和成本也非常大。通过本发明的技术，由于能够得到以地下茎为商品的植物的雄性不育体或者花药开裂被抑制了的植物体，因此能够不需除雄作业，便可避免受粉。因此，与现状相比，能够大幅度降低培养植物体生产商品时的成本、时间。
本发明的技术也适用于不将果实、花作为商品的植物体中。举其一例为花粉症的预防。即，在大量散播为花粉症原因的花粉的植物，如杉树、桧树、花柏等树木，一丛草(日语名：カモガャ学名：dactylis g1omerata别名：オ一チャ一ド·グラス)、梯目草、草地早熟禾等水稻科植物，豚草、艾蒿、律草等杂草类中，通过本发明的技术生产雄性不育体，则由于不能形成正常花粉，没有花粉从这些植物体中飞散的危险。如果利用本发明的技术生产花药开裂被抑制了的植物体，则没有花粉从这些植物体飞散的危险。因此，将这些雄性不育体或花药开裂被抑制了的植物体与自然界的野生型植物体置换，则由于能够抑制为花粉症原因的花粉的飞散，因此能够预防花粉症。
另外，通过本发明的技术，能够预防植物的疾病，此疾病的原因是经由花粉的病毒感染。已知，某种植物病毒存在于生病植物的花粉内，通过雄蕊传染给健全植物，引起疾病。通过本发明的技术，生产不能形成正常花粉的植物体，则没有介由花粉的病毒感染，因此能够预防植物疾病。
通过本发明的技术，能够防止基因改变植物体向自然界的不良扩散。举其一例，在为纸浆原料的桉树中，通过基因操作，创造出导入有耐盐性和耐寒性优异、树木变得巨大等更优异形质的基因改变植物体，现正在野外环境下进行导入形质的验证实验。但是，在野外环境下培育这种基因改变植物体的话，通过风、昆虫等作为介质的花粉的扩散，基因改变植物体向自然界广泛扩散，有改变自然环境的危险。因此，为了对应此问题，有必要在与外界完全隔离的特殊环境下进行基因改变植物的验证实验。
但是，如果利用本发明的技术，将基因改变植物体形质改变为不能形成正常花粉的雄性不育体或花药开裂被抑制了的植物体，则不会发生由于花粉的散布而导致的基因改变植物体向自然界的扩散。因此，与现状相比，在与实际野外环境相接近的条件下，能够进行基因改变植物体的验证试验。由此，可在更自然的环境下验证导入至基因改变植物体的形质。
另外，如果使用本发明的技术，则能够生产花萼、雄蕊等花器的一部分欠损或者变形的植物体。这样，由于能够生产具有从来没有的特异形状的花器的植物体，因此能够得到以往没有的新型观赏植物。
通过本发明能够生产重叠花瓣植物体，但本发明的有用性并没有特别限定，只要是通过生产花瓣重叠植物体具有效果的领域即可。作为此领域，如可举出在新型园艺品种创造中的应用等。
首先，对新型园艺品种创造的应用例进行说明，通过使用本发明所涉植物体的生产方法，仅在附加有上述功能性肽的表达盒载体中编入转录因子的基因，导入至植物细胞中，则能够在植物细胞内表达上述嵌合体蛋白质，能够容易地抑制转录因子的目标基因的转录。如上所述，由于上述抑制转录因子的目标基因转录的形质为优势的，因此上述嵌合体蛋白质比上述转录因子更有优势地起作用，抑制目标基因的转录。因此，能够在短期间简便、确实地制出重叠花瓣植物体，在园艺上非常有用。
另外，通过本发明生产的重叠花瓣植物体或不育性植物体中，不形成种子，而且在完全不育性植物体、雄性不育植物体中没有花粉的离散，因此能够防止基因重组植物向环境的扩散，非常安全。
通过本发明生产的重叠花瓣植物体或不育性植物体，可适合于利用杂种优势的交配中，能够有效率地进行具有优异形质的杂种第一代的育种，因此在农业上非常有用。
(III-3)本发明的利用的一例
本发明的利用领域、利用方法没有特别限定，作为一例，可以举出用于进行本发明所涉植物体的生产方法的试剂盒，即不育性植物体生产试剂盒。
作为这种不育性植物体生产试剂盒的具体例，只要至少含有包含嵌合体基因的重组表达载体即可，上述嵌合体基因由编码上述转录因子的基因和上述转录抑制转变多核苷酸构成，更优选含有用于将上述重组表达载体导入至植物细胞中的试剂群。作为上述试剂群，可以举出与形质改变种类相应的酶、缓冲液等。除此之外，根据需要还可以添附微离心管等试验用材料。
(IV)花药开裂被控制的不育性植物体的生产方法
本发明人首次发现，NACAD1及保存在各种植物中的同样的转录因子是促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，进而完成本发明。因此，利用编码此转录因子的基因，生产花药开裂被控制的不育性植物体的方法也包括在本发明中。
即，本发明涉及的花药开裂被控制的不育性植物体的生产方法，使用编码以下(a)或(b)记载的蛋白质的基因：
(a)由序列号136所示氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号136所示氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成，具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质、
或者，以下(c)或(d)记载的基因：
(c)将序列号137所示碱基序列作为开放读码框区域含有的基因、
(d)在严格的条件下杂交由序列号137所示碱基序列构成的基因和由互补碱基序列构成的基因，且编码促进与花药开裂相关基因转录的转录因子的基因。
上述蛋白质为相对于序列号136所示氨基酸序列，具有20％以上、优选50％以上、更优选60％或70％以上相同性的蛋白质、且具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质。这种蛋白质，例如可举出NAC因子，其为上述相同性为52％的蛋白质、具有与NACAD1蛋白质相同功能，此NACAD1蛋白质具有序列号136所示的氨基酸序列。
此植物体的生产方法，可通过下述成为可能，即抑制编码与花药开裂相关的上述转录因子的基因的表达，或者使其过度表达。作为抑制上述基因表达的方法，如可举出反意抑制法、基因打靶法、RNAi法、相互抑制法(日文：コサプレ一シヨン英文：co-suppression-译注)、基因破坏型标记法等。作为使上述基因过度表达的方法，如可举出构建含有适当的启动子和配置在其下流的上述基因的载体，将其导入至植物中的方法。
本发明并不限定于上述各实施方式，在权利要求的范围内可进行各种变化，适当组合不同实施方式中分别公开的技术手段而得到的实施方式，也包含在本发明的技术范围内。
[实施例]
以下，以实施例和图1(a)-图(16)为基础更详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1]
在以下的实施例中，通过将编码转录抑制转变肽之一的12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)(序列号17)的多核苷酸，与APETALA3基因结合，连接于在植物细胞中发挥作用的菜花花叶病毒35S启动子之下，构建重组表达载体，将其使用土壤杆菌法导入至白犬荠中，由此使白犬荠形质改变。
(1)植物形质改变用载体pBIG2的构建
使用限制酶Hind III和BamHI切断クロ一ンテツク公司(Clontech公司、USA)生产的质粒p35S-GFP，利用琼脂糖凝胶电泳分离、回收含有菜花花叶病毒35S启动子的DNA片断。
使用限制酶Hind III和SstI，剪切从美国密歇根州立大学获得的植物形质改变用载体p-BIG-HYG(Becker，D.1900 Nucleic acid Research，18：203)，利用琼脂糖凝胶电泳得到除去GUS基因的DNA片断。
合成具有以下序列的DNA，在70℃加热10分钟后，通过自然冷却进行退火，得到双链DNA。此DNA片断，从5’末端开始的顺序为BamHI限制酶部位、提高翻译效率的来自于烟草花叶病毒的omega序列、限制酶部位SmaI以及限制酶部位SalI和SstI。
5’-GATCCACAATTACCAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACAGATCCCGGGGGTACCGTCGACGAGCT-3’
                                                                 (序列号159)
5’-CGTCGACGGTACCCCCGGGATCTGTAATTGTAATGTTGTTTGTTGTTTGTTGTTGTTGGTAATTGTG-
                                                                 (序列号160)
接着，将含有菜花花叶病毒35S启动子区域的DNA片断和合成的双链DNA插入在除去GUS基因的pBIG-HYG的HindIII、SstI部位，得到植物形质改变用载体pBIG2。
(2)重组表达载体pAPETALA3SRDX的构建
<APETALA3cDNA的分离>
由白犬荠cDNA文库，使用以下引物，利用PCR将仅含有除去终止密码的APETALA3编码区域的DNA片断扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行分离回收。PCR条件为，将变性反应94℃1分钟、退火反应47℃2分钟、延长反应74℃1分钟作为1个循环，进行25个循环。以下所有的PCR反应在相同条件下进行。
5’引物
5’-GATGGCGAGAGGGAAGATCCAGATCAAG-3’(序列号161)
3’引物
5’-TTCAAGAAGATGGAAGGTAATGATG-3’(序列号162)
APETALA3基因的cDNA和编码的氨基酸序列分别示于序列号135和134。
<编码转录抑制转变肽LDLDLELRLGFA(SRDX)的多核苷酸的合成>
分别合成编码12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)、在3’末端具有终止密码TAA、具有以下序列的DNA，在70℃加温10分钟后，通过自然冷却进行退火，得到双链DNA。
5’-CTGGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAAG-3’(序列号163)
5’-CTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAG-3’(序列号164)
<重组表达载体的构建>
将仅含有上述所得APETALA3基因的蛋白质编码区域的DNA片断和含有转录抑制转变肽SRDX的编码区域的DNA片断，插入在用限制酶SmaI切断的上述pBIG2中，将沿着顺方向克隆的产物分离，得到重组表达载体的质粒p35S::APETALA3SRDX。
(3)由重组表达载体p35S::APETALA3SRDX形质改变的植物体的制造
由p35S::APETALA3SRDX进行的白犬荠的形质改变根据Transformationof Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.mus.edu/pamgreen/protocol.htm)进行。但是，为使其感染不使用真空，仅进行浸渍。通过电穿孔法将p35S::APETALA3SRDX导入至土壤细菌Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(Koncz and schell 1986)株。将导入的菌在1升YEP培养基中培养，直至OD 600变为1，上述培养基中含有抗生物质(卡那霉素(Km)50μg/ml、庆大霉素(Gm)25μg/ml、利福平(Rif)50μg/ml)。接着，从培养基中将菌体回收，混悬于1升的感染用培养基(Infiltrationmedium、下述表2)。
[表2]
  感染用培养基(11)
  MS盐   2.29g
  蔗糖   50g
  用KOH将MES调至pH 5.7   0.5g
  苯甲酸嘌呤   0.044μM
  Silwet L-77   0.2ml
将培育了14天的白犬荠在此溶液中浸渍1分钟，使其感染后，再次培育、结种。将回收的种子在50％次氯酸钙、0.02％Trion X-100溶液中灭菌7分钟后，用灭菌水洗涤3次，接种于灭过菌的潮霉素选择培养基中(下表3)。
[表3]
  潮霉素选择培养基
  MS盐   4.3g/l
  蔗糖   1％
  用KOH将MES调至pH 5.7   0.5g/l
  植物琼脂   0.8％
  潮霉素   30g/ml
  万古霉素   500ml
选择在上述潮霉素培养基中培育的形质改变植物体，使其成长。如此，得到15列由p35S::APETALA3SRDX进行形质改变的、成长了的植物体。植物体的一例如图1(a)-图1(c)所示。
如图1(a)所示，在由p35S::APETALA3SRDX进行形质改变的植物体中，在所有的花器中，没有形成花瓣和雄蕊。而另一方面，正常地形成了雌蕊。
由如图1(b)所示植物体扩大图可知，在花器中，雌蕊的柱头露出，花瓣和雄蕊缺损。并且由如图1(c)所示花器扩大图可知，花瓣和雄蕊明显缺损。这种花器不正常的形状，与APETALA3基因的变异株中花器的形状相同。以上的结果，在所有得到的15列形质改变植物体中相同。
这样，由p35S::APETALA3SRDX进行形质改变的植物体，为花萼和雄蕊缺损、未形成正常花粉的变异体。向此植物体的雌蕊中，授粉野生型植物体的花粉，形成种子。由此能够确认由p35S::APETALA3SRDX进行形质改变的植物体为雌蕊具有生育性的雄性不育体。
[实施例2]
在本实施例中，通过构建编入有如下多核苷酸的重组表达载体，使用土壤杆菌法将此重组表达载体导入至白犬荠中，由此将白犬荠形质改变，上述多核苷酸在NACAD1基因下方结合有编码12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)(序列号17)的多核苷酸，此12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)(序列号17)为在菜花花叶病毒35S启动子和胆脂碱合成酶基因的转录终止区域之间的、转录抑制转变肽中的一个。
<形质改变用载体构建用载体的构建>
如图2所示，按照下述工序(1)-(4)构建为形质改变用载体构建用载体的p35SG。
(1)使用引物attL1-F(序列号142)、attL1-R(序列号143)、attL2-F(序列号144)attL2-R(序列号145)，利用PCR分别扩增インビトロジエン公司(Invitrogen Corporation)生产的pENTR载体上的attL1、attL2区域。对所得attL1片断用限制酶Hind III、attL2片断用EcoR I进行消化、精制。PCR反应的条件如上所述。
(2)使用限制酶XbaI和SacI切断クロ一ンテツク公司生产(Clotech公司、USA)的质粒pBI221后，利用琼脂糖凝胶电泳得到除去GUS基因、含有菜花花叶病毒35S启动子(以下说明中，为了方便称为CaMV35S)和胆脂碱合成酶基因的转录终止区域(以下说明中，为了方便，称为Nos-ter)的35S-Nos质粒片断DNA。
(3)合成具有以下的序列号146、147序列的DNA片断，在90℃加热2分钟后，在60℃加热1小时，其后在室温(25℃)下静置2小时进行退火，形成双链。将其连接于上述35S-Nos质粒片断DNA的XbaI-SacI区域，完成p35S-Nos质粒。在具有序列号146、147序列的DNA片断中按如下顺序含有：在5’末端的BamHI限制酶部位、提高翻译效率的来源于烟草花叶病毒的omega序列、以及限制酶部位SmaI、SalI、SstI。
5’-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3’
                                                                             (序列号146)
5’-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3’
                                                                      序列号147)
(4)使用限制酶HindIII消化此p35S-Nos质粒，插入上述attL1片断。进而，将其用EcoRI消化，插入attL2片断，完成载体p35SG。
<编入有编码转录抑制转变肽的多核苷酸的构建用载体的构建>
如图3所示，按以下工序(1)-(2)构建p35SSRDXG，其为编入有编码转录抑制转变肽的多核苷酸的构建用载体。
(1)分别合成编码12氨基酸转录抑制转变肽LDLDLELRLGFA(SRDX)、在3’末端具有终止密码TAA、具有以下序列的DNA，在70℃加温10分钟后，通过自然冷却使其退火，成为双链DNA。
5’-gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag-3’(序列号148)
5’-tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc-3’(序列号149)
(2)使用限制酶SmaI、SalI消化p35SG，在此区域上插入编码上述SRDX的双链DNA，构建p35SSRDXG。
<形质改变用载体的构建>
如图6所示，按以下工序(1)-(3)构建pBIGCKH，其为用于重组夹在构建用载体att部位的DNA片断、具有两个att部位的植物形质改变用载体。
(1)使用限制酶Hind III、EcoRI消化从美国密歇根州立大学获得的pBIG(Becker，D.Nucleic Acids Research，18：203，1900)，利用电泳除去GUS、Nos区域。
(2)将从インビトロジエン公司(Invitrogen Corporation)购买的Gateway(注册商标)载体转化体系的片断A插入在pBluscript的EcoRV侧。用Hind III-EcoRI将其消化，回收片断A。
(3)将回收的片断A与上述pBIG质粒片断进行连接，构建pBIGCKH。它们仅在大肠杆菌DB3.1(インビトロジエン公司「InvitrogenCorporation」)中能够增殖，为耐氯霉素性、耐卡那霉素性。
<向构建用载体编入NACAD1基因>
按照以下工序(1)-(3)，将编码白犬荠来源的转录因子NACAD1蛋白质的基因编入至上述构建用载体p35SSRDXG中。
(1)使用从白犬荠叶调整的mRNA制成的cDNA文库，利用以下引物，使用PCR扩增仅含有除去终止密码的白犬荠NACAD1基因的编码区域的DNA片断。
引物1(NACAD1-F)
5’-GATGATGTCAAAATCTATGAGCATATC-3’(序列号155)
引物2(NACAD1-R)
5’-TCCACTACCATTCGACACGTGAC-3’(序列号156)
NACAD1基因的cDNA和编码的氨基酸序列分别示于序列号137和136中。
(2)如图3所示，将所得NACAD1编码区域的DNA片断连接于事先用限制酶SmaI消化的构建用载体p35SSRDXG的SmaI部位。
(3)利用此质粒将大肠杆菌形质转变，调整质粒，确定碱基序列，分离在顺方向上插入的克隆，得到成为SRDX嵌合体基因的物质。
<重组表达载体的构建>
通过将在上述构建用载体上具有的，含有CaMV35S启动子、嵌合体基因、Nos-ter等DNA片断重组为植物形质转变用载体pBIGCKH，构建将植物作为宿主的表达载体。重组反应使用インビトロジエン公司(Invitrogen Corporation)的Gateway(注册商标)L R克隆酶(注册商标)，按照以下工序(1)-(3)进行。
(1)首先，在1.5μl p35SSRDXG(约300ng)和4.0μl pBIGCKH(约600ng)中加入4.0μl 5倍稀释的L R缓冲液和5.5μl TE缓冲液(10mM TrisClpH 7.0、1mM EDTA)。
(2)在此溶液中加入4.0μl L R克隆酶，在25℃下培养60分钟。接着，加入2μl蛋白酶K，在37℃下培养10分钟。
(3)之后，将1-2μl此溶液形质改变为大肠杆菌(DH5a)，用卡那霉素进行选择。
<通过重组表达载体生产形质改变植物体>
接着，如以下工序(1)-(3)所示，使用pBIG-NACAN1SRDX，进行白犬荠的形质改变，生产形质改变植物体，上述pBIG-NACAN1sRDX为在pBIGCKH中编入有含有上述嵌合体基因的DNA片断的质粒。白犬荠植物的形质改变根据Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuuminfiltration( http://www.bch.mus.edu/pamgreen/protocol.htm)进行。为使其感染不使用真空，仅进行浸渍。
(1)首先，使用电穿孔法将所得质粒、pBIG-NACAN1SRDX导入至土壤细菌(Agrobaterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)DM90(Gmr)(konez and Sahell 1986))株中。将导入的菌在1升含有抗生物质(卡那霉素(Km)50μg/ml、庆大霉素(Gm)25μg/ml、利福平(Rif)50μg/ml)的YEP培养基中进行培养，直至OD 600变为1为止。接着，从培养基中将菌体回收，混悬于1升的感染用培养基(Infiltration medium、上述表2)。
(2)将培育了14天的白犬荠在此溶液中浸渍1分钟，使其感染后，再次培育、结种。在感染了土壤杆菌的世代中，除了妨碍胚珠生存的情况，一般不出现形质改变基因的影响。因此，不发生对花药开裂的抑制而结出种子。将回收的种子在25％次氯酸钙、0.02％Trion X-100溶液中灭菌7分钟后，用灭菌水洗涤3次，接种于灭过菌的潮霉素选择培养基中(上表3)。
(3)从接种后的约2000个种子中平均得到50个为耐潮霉素性植物的形质改变植物体。从这些植物中调整总RNA，使用RT-PCR确认导入了NACAD1SRDX基因。
对于通过pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的植物体个数，利用扫描型电子显微镜(JSM-6330F、日本电子公司生产)观察花药的形状。其结果示于图7(a)中。图7(b)为同样使用扫描型电子显微镜对野生型白犬荠的花药形状的观察结果。如图7(a)所示，由pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的白犬荠中，不发生花药的开裂。这样，确认了在由pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的白犬荠中，花药开裂完全不发生、或者如图所示仅是不完全地发生。作为其结果，如图8右侧所示，在由pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的白犬荠植物体中，几乎不形成果实、种子。图8左侧所示为白犬荠的野生株。
另外，对由pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的37个植物体，调查了在各个个体中收获的种子的质量占种子以外的地上部分干燥重量的比例，与正常结果实的的其他白犬荠植物群进行比较。图9(a)、图9(b)显示了其结果。在图9(a)、图9(b)的图表中，纵轴为个体数、横轴为(收获的种子的质量/种子以外的地上部分干燥重量)×100的等级值。如横轴的20表示，(收获的种子的质量/种子以外的地上部分干燥重量)×100的计算值为大于10小于20的等级。如图9(a)所示，可观察到在由pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的植物体群中，与正常结果实的植物体群(图9(b))相比，在各个个体中收获的种子的质量占种子以外的地上部分干燥重量的比例低的个体数量多。这里的种子质量是指在1个个体全体中所获种子的质量的合计。这说明，由于通过pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的植物体群在自然状态下因为花药开裂被抑制，因此几乎不能形成种子。另外，在通过pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的植物体群中得到的种子，是通过从不完全开裂的花药中释放出来的花粉自体授粉而得到的。
并且，研究了在通过pBIG-NACAN1SRDX形质改变的、花药开裂被抑制了的植物体中，将花药内的花粉取出进行授粉时是否结果实。图10中，使用小镊子从未开裂的花药中强行取出花粉、授粉的情况由箭头表示，未进行任何操作的用三角形箭头部表示。如图10箭头部分所示，即便在花药开裂被完全抑制的情况下，取出花粉、授粉时也能结果实，因此确认花粉本身具有生育性。由此结果可知，通过pBIG-NACAN1SRDX形质改变了的植物体，花粉本身具有生育性，但由于花药不开裂因此不能授粉，不能结果实。另外，使花药不开裂的花授粉时也结果实，因此确认雌性器官(雌蕊)具有生育性。
[实施例3]
在本实施例中，通过构建编入有如下多核苷酸的重组表达载体，使用土壤杆菌法将此重组表达载体导入至白犬荠中，由此将白犬荠形质改变，上述多核苷酸在白犬荠MYB26基因下方结合有编码12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)(序列号17)的多核苷酸，此12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)(序列号17)为在菜花花叶病毒35S启动子和胆脂碱合成酶基因的转录终止区域之间的、转录抑制转变肽中的一个。
<形质改变用载体构建用载体的构建>
如图2所示那样，以与实施例2同样的方法构建为形质改变用载体构建用载体的p35SG。
<编入有编码转录抑制转变肽的多核苷酸的构建用载体的构建>
如图3所示那样，以与实施例2同样的方法构建p35SSRDXG，，其为编入有编码转录抑制转变肽的多核苷酸的构建用载体。
<形质改变用载体的构建>
如图6所示那样，以与实施例2同样的方法构建pBIGCKH，其为用于重组夹在构建用载体att部位的DNA片断、具有2个att部位的植物形质改变用载体。
<向构建用载体编入MYB26基因>
按照以下工序(1)-(3)，在上述构建用载体p35SSRDXG中编入编码白犬荠来源的转录因子MYB26蛋白质的基因。
(1)从使用由白犬荠调整的mRNA制成的cDNA文库，利用以下的引物，使用PCR扩增除去终止密码、仅含有MYB26基因编码区域的DNA片段。
引物1(MYB26-F)
5’-GATGGGTCATCACTCATGCTGCAACAAGCA-3’(序列号157)
引物2(MYB26-R)
5’-AGTTATGACGTACTGTCCACAAGAGATTGG-3’(序列号158)
MYB26基因的cDNA和编码的氨基酸序列分别示于序列号139和138。
(2)如图4所示，将所得MYB26编码区域的DNA片段，连接于事先用限制酶SmaI消化了的构建用载体p35SSRDXG的SmaI部位。
(3)使用此质粒，将大肠杆菌形质改变，调整质粒，决定碱基序列，分离在顺方向插入的克隆，得到SRDX嵌合体基因的物质。
<重组表达载体的构建>
将在上述构建用载体上具有的，含有CaMV35S启动子、嵌合体基因、Nos-ter等的DNA片断，重组为植物形质改变用载体pBIGCKH，由此构建以植物为宿主的表达载体。重组反应除了用インビトロジエン公司(Invitrogen Corporation)的Gateway(注册商标)LR克隆酶(注册商标)代替p35SSRDXG使用于顺方向插入有MYB26编码区域的p35SMYB26SRDXG之外，通过与实施例2<重组表达载体的构建>中所述方法相同的方法进行。
<利用重组表达载体生产形质改变的植物体>
接着，利用pBIG-MYB26SRDX、其为在pBIGCKH中编入有含有上述嵌合体基因的DNA片断的质粒，进行白犬荠的形质改变，生产形质改变植物体。形质改变植物体的生产，除了代替pBIG-NACAD1SRDX使用pBIG-MYB26SRDX之外，通过与实施例2<利用重组表达载体生产形质改变植物体>中所述方法相同的方法进行。
从接种于上述灭过菌的潮霉素选择培养基(上表3)中的约5000粒种子中，平均得到60个为耐潮霉素性植物的形质改变植物体。从这些植物调整总RNA，使用RT-PCR确认导入了MYB26SRDX基因。
对于通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的植物体的个数，利用扫描型电子显微镜(JSM-6330F、日本电子公司生产)观察了花药的形状。其结果示于图11(b)。图11(a)为同样使用扫描型电子显微镜观察野生型白犬荠花药形状的结果。如图11(b)所示，通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的白犬荠中，没有发生花药的开裂。这样，通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的白犬荠中，大多数情况下完全没有花药的开裂。或者，图中没有显示，即便发生了花药开裂，也不完全。
另外，对通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的22个植物体，调查了在各个个体中结果实的荚的数占开花了的花的数的比例，与正常结果实的另外的白犬荠植物群进行比较。图12显示了其结果。在图12(a)、图12(b)的图表中，纵轴为个体数、横轴为(结果实的荚的数/开花了的花的数)×100的等级值。如横轴的20表示，(结果实的荚的数/开花了的花的数)×100的计算值为大于10小于20的等级。
如图12(b)所示，可观察到在通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的植物体群中，与正常结果实的植物体群(图12(a))相比，在各个个体中结果实的荚的数占开花了的花的数的比例低的个体数量多。在22个个体中，结果实了的荚的数占开花了的花的数的比例大于0小于10的植物体为11个，表示几乎没有形成种子的个体的比例高。这说明，由于通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的植物体群在自然状态下因为花药开裂被抑制，因此几乎不能形成种子。
另外，在通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的植物体群中得到的种子，是通过自体授粉从不完全开裂的花药中释放出来的花粉而得到的。“结果实的荚的数”是指在1个个体中，形成了种子的荚(长角果)的总数。
在由pBIG-MYB26SRDX形质改变了的、花药开裂被抑制的植物体中，研究了取出花药内的花粉使其授粉时是否结果实。其结果，即便在花药开裂完全被抑制的情况下，由于取出花粉使其授粉时也结果实，因此确认花粉本身具有生育性。由此结果可知，在通过pBIG-MYB26SRDX形质改变了的植物体中，花粉本身具有生育性，但由于花药不开裂不能授粉，因此不结果实。另外，由于使花药不开裂的花授粉时也结果实，因此可确认雌性器官(雌蕊)具有生育性。
[实施例4]
在以下的实施例4中，通过构建编入有如下多核苷酸的重组表达载体，使用土壤杆菌法将此重组表达载体导入至白犬荠中，由此将白犬荠形质改变，上述多核苷酸在AG基因下方结合有编码12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)(序列号17)的多核苷酸，此12氨基酸肽LDLDLELRLGFA(SRDX)(序列号17)为在菜花花叶病毒35S启动子和胆脂碱合成酶基因的转录终止区域之间的、转录抑制转变肽中的一个。
<形质改变用载体构建用载体的构建>
如图2所示那样，以与实施例2同样的方法构建为形质改变用载体构建用载体的p35SG。
<编入有编码转录抑制转变肽的多核苷酸的构建用载体的构建>
如图3所示那样，以与实施例2同样的方法构建p35SSRDXG，，其为编入有编码转录抑制转变肽的多核苷酸的构建用载体。
<形质改变用载体的构建>
如图6所示那样，以与实施例2同样的方法构建pBIGCKH，其为用于重组夹在构建用载体att部位的DNA片断、具有2个att部位的植物形质改变用载体。
<向构建用载体编入AG编码区域>
按照以下工序(1)-(3)，在上述构建用载体p35SSRDXG中编入编码白犬荠来源的转录因子AG蛋白质的DNA序列或基因。
(1)以白犬荠完全长cDNA pda01673为模板，利用以下的引物，使用PCR扩增除去终止密码、仅含有AG多核苷酸(At4g18960)编码区域的DNA片段。
引物15’-atgaccgcgtaccaatcggagctaggagg-3’(序列号150)
引物25’-cactaactggagagcggtttggtcttggcg-3’(序列号151)
AG多核苷酸的编码氨基酸序列和AG多核苷酸的cDNA分别示于序列号140和141。
(2)如图5所示，将所得AG编码区域的DNA片段，连接于事先用限制酶SmaI消化了的构建用载体p35SSRDXG的SmaI部位。
(3)使用此质粒，将大肠杆菌形质改变，调整质粒，决定碱基序列，分离在顺方向插入的克隆，得到SRDX嵌合体蛋白质的物质。
<重组表达载体的构建>
将在上述构建用载体上具有的，含有CaMV35S启动子、嵌合体基因、Nos-ter等的DNA片断，重组为植物形质改变用载体pBIGCKH，由此构建以植物为宿主的表达载体。重组反应除了用インビトロジエン公司(Invitrogen Corporation)的Gateway(注册商标)LR克隆酶(注册商标)、代替p35SSRDXG用于顺方向插入有AG编码区域的p35SAGSRDXG之外，通过与实施例2<重组表达载体的构建>中所述方法相同的方法进行。
<利用重组表达载体生产形质改变植物体>
接着，利用pBIG-AG26SRDX、其为在pBIGCKH中编入有含有上述嵌合体基因的DNA片断的质粒，进行白犬荠的形质改变，生产形质改变植物体。形质改变植物体的生产，除了用pBIGAGSRDX代替pBIG-NACAD1SRDX之外，通过与实施例2<利用重组表达载体形质改变了的植物体的生产>中所述方法相同的方法进行。
从接种的约5000粒种子中，平均得到50个为耐潮霉素性植物的形质改变植物体。从这些植物中调整总RNA，使用RT-PCR确认导入了AGSRDX基因。
接着，对由pBIG-AGSRDX形质改变了的植物体，以图13-图16为基础进行说明。图13(a)所示为通过pBIG-AGSRDX形质改变、成为完全重叠花瓣的白犬荠花；图13(b)所示为花的形态变为重叠花瓣的白犬荠整体。在供试的28个个体中的16个个体中，通过pBIG-AGSRDX形质改变了的白犬荠花，如图13(a)所示，形成了完全的重叠花瓣植物体。
图14(a)所示为野生型白犬荠的花，图14(b)所示为AG变异体的白犬荠的花。野生型的白犬荠具有4个花萼、4个花瓣、6个雄蕊、1个雌蕊，与此相对，用本发明所涉方法形质改变了的白犬荠，雄蕊变为花瓣、在成为雌蕊的whorl4上形成了新的花。AG变异体也是同样的构成，但用本发明所涉方法形质改变了的白犬荠，与AG变异体比较，花瓣之间的间隔小，形成了均匀整齐、美丽的重叠花瓣植物体。
图15显示了通过pBIG-AGSRDX形质改变的28个个体中的10个个体的白犬荠花。上述10个个体中，形成了不完全的重叠花瓣植物体。图16显示了通过pBIG-AGSRDX形质改变了的28个个体中的2个个体的白犬荠花。在上述2个个体中，形成了接近野生型形态的花。
另外，上述16个个体为雄蕊和雌蕊都不形成的完全不育性植物体。在上述10个个体中，形成了不完全的雄蕊样、雌蕊样器官，但没有形成种子。即，形成了不育性植物体。而在上述2个个体中，虽然形成了雄蕊和雌蕊，但种子形成数却非常少。这样，通过pBIG-AGSRDX形质改变了的植物体全部为不育性植物体。
在实施发明的最佳方式中所述的具体实施方式或实施例，只是为了说明本发明的技术内容、不应狭义地解释为仅限于这种具体例子。在本发明的精神和以下所述权利要求的范围内，可以进行各种变更进行实施。
产业化应用的可能性
本发明所涉不育性植物体的生产方法中，如上所述，通过在植物体内生产嵌合体蛋白质，抑制与花器形成相关基因的表达，生产植物的雄性不育体。上述嵌合体蛋白质融合有促进与花器形成相关基因表达的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
因此，如果利用编码上述嵌合体蛋白质的嵌合体基因将目标植物形质改变的话，能够生产雄性不育植物，无须利用复杂的基因重组技术，便可得到非常简便地将目标植物雄性不育化的效果。
本发明中使用的嵌合体蛋白质，相对于内源性的基因，具有优势地发挥作用。因此，即便植物为二倍体、复二倍体，或者在植物中存在功能复杂的基因，本发明所涉嵌合体蛋白质能够调控此转录因子，同样抑制与花器形成相关基因的表达。因此，得以容易地将能够导入基因的所有植物形质改变为雄性不育体。
本发明所使用的、促进与花器形成相关基因转录的转录因子的氨基酸序列，由于在不同种的数量众多的植物间保守性(保存性)高，因此将用特定模型植物构建的嵌合体蛋白质，导入至其他植物中，可以获得在各种植物中简便地生产雄性不育体的效果。
如上，通过本发明，虽然不形成正常的花粉，但能够在广范围的植物中生产雌蕊具有生育性的所谓雄性不育植物体。因此，本发明能够利用在各种农业、林业、农业综合企业、甚至加工农产品的产业和食品产业等中，并且非常有用。
本发明所涉花药开裂被抑制的植物体的生产方法，如上所述，由于具有在植物体内生产嵌合体蛋白质的构成，因此与花药开裂相关基因的表达被抑制，能够生产花药开裂被抑制的植物体。上述嵌合体蛋白质融合有促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
因此，如果利用编码上述嵌合体蛋白质的嵌合体基因将目标植物形质改变的话，则能够生产花药开裂被抑制的植物，无须利用复杂的基因重组技术，便可非常简便地抑制目标植物的花药开裂。
本发明中使用的嵌合体蛋白质，相对于内源性的基因，优势地发挥作用，因此即便植物为二倍体、复二倍体，或者在植物中存在功能复杂的基因，本发明所涉嵌合体蛋白质发挥能够同样地抑制与花药开裂相关基因的表达，得以容易地将能够导入基因的所有植物形质改变为花药开裂被抑制了的植物体。
本发明所使用的、促进与花药开裂相关基因转录的转录因子的氨基酸序列，在不同种的数量众多的植物间保守性(保存性)高，因此通过将用特定模型植物构建的嵌合体蛋白质导入至其他植物中，便可获得在不同种植物中简便地生产花药开裂被抑制了的植物体的效果。
如上，通过抑制与花药开裂相关基因的转录，能够得到花药开裂被抑制了的植物体。因此，本发明能够利用在各种农业、林业、农业综合企业、甚至加工农产品的产业和食品产业等中，并且非常有用。
本发明所涉不育性植物体的生产方法，如上所述，通过在植物体内生产嵌合体蛋白质，抑制上述转录因子的目标基因的转录，由于具备生产重叠花瓣植物体的构成，因此能够获得在短期内简便地、确实地生产重叠花瓣植物体的效果。上述嵌合体蛋白质融合有与雄蕊和雌蕊形成有关的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
如上所述，通过抑制AG转录因子的目标基因的转录，能够得到重叠花瓣植物体或者不育性植物体。因此，本发明能够利用于各种农业、园艺业、园林建筑业、农业综合企业等，且非常有用。
                            序列表
<110>独立行政法人科学技术振兴机构
     独立行政法人产业技术综合研究所
<120>不育性植物体的生产方法以及使用此方法得到的植物体及其利用
<130>A181-08PCT
<150>JP 2004-2192
<151>2004-01-07
<150>JP 2004-93796
<151>2004-03-26
<150>JP 2004-221592
<151>2004-07-29
<150>JP 2004-231544
<151>2004-08-06
<160>164
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Desription of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>1
Asp LeuAsp Leu Asn Leu Ala Pro Pro Met Glu Phe
  1                5                     10
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>2
Leu Asp Leu Asn Leu Ala Pro Pro Met Glu Phe
  1                 5                     10
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>3
Leu Asp Leu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala
  1                 5                      10
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descrition of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>4
Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala
  1                 5                   10
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>5
Asp Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>6
Leu Asp Leu Gln Leu Arg Leu Gly Tyr Tyr
  1                 5                   10
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>7
Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>8
Leu Asp Leu Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala
  1                 5                      10
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>9
Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Ala Ala Ala
  1                 5                     10
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>10
Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly
  1                 5
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>11
Phe Asp Leu Asn Phe Ala Pro Leu Asp Cys Val
  1                 5                     10
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>12
Phe Asp Leu Asn Ile Pro Pro Ile Pro Glu Phe
  1                 5                       10
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>13
Phe Gln Phe Asp Leu Asn Phe Pro Pro Leu Asp Cys Val
  1                 5                     10
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>14
Asp Leu Asp Leu Arg Leu
  1                 5
<210>15
<211>35
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>15
Val Gly Pro Thr Val Ser Asp Ser Ser Ser Ala Val Glu Glu Asn Gln
  1                   5                      10                   15
Tyr Asp Gly Lys Arg Gly Ile Asp Leu Asp Leu Asn Leu Ala Pro Pro
               20                     25                      30
Met Glu Phe
         35
<210>16
<211>11
<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>16
Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala
  1                 5                    10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>17
Leu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala
  1                 5                    10
<210>18
<211>204
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>18
Met Glu Arg Ser Asn Ser Ile Glu Leu Arg Asn Ser Phe Tyr Gly Arg
 1                   5                     10                     15
Ala Arg Thr Ser Pro Trp Ser Tyr Gly Asp Tyr Asp Asn Cys Gln Gln
                20                     25                     30
Asp His Asp Tyr Leu Leu Gly Phe Ser Trp Pro Pro Arg Ser Tyr Thr
          35                     40                      45
Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala Gln Ala Leu Gly Gly
     50                      55                     60
His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Arg Leu Arg Leu Gln Gln
 65                     70                      75                    80
Ser Pro Ser Ser Ser Ser Thr Pro Ser Pro Pro Tyr Pro Asn Pro Asn
                     85                      90                    95
Tyr Ser Tyr Ser Thr Met Ala Asn Ser Pro Pro Pro His His Ser Pro
               100                    105                      110
Leu Thr Leu Phe Pro Thr Leu Ser Pro Pro Ser Ser Pro Arg Tyr Arg
         115                     120                     125
Ala Gly Leu Ile Arg Ser Leu Ser Pro Lys Ser Lys His Thr Pro Glu
     130                     135                     140
Asn Ala Cys Lys Thr Lys Lys Ser Ser Leu Leu Val Glu Ala Gly Glu
145                    150                     155                   160
Ala Thr Arg Phe Thr Ser Lys Asp Ala Cys Lys Ile Leu Arg Asn Asp
                    165                     170                     175
Glu Ile Ile Ser Leu Glu Leu Glu Ile Gly Leu Ile Asn Glu Ser Glu
                180                     185                     190
Gln Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala
         195                   200
<210>19
<211>30
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>19
Asn Asp Glu Ile Ile Ser Leu Glu Leu Glu Ile Gly Leu Ile Asn Glu
  1                   5                      10                     15
Ser Glu Gln Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala
              20                     25                     30
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>20
Asp Leu Asn Leu Arg Leu
  1                 5
<210>21
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>21
Asp Leu Asp Leu Arg Leu
  1                 5
<210>22
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>22
Asp Leu Gln Leu Arg Leu
  1                 5
<210>23
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>23
Asp Leu Arg Leu Arg Leu
  1                 5
<210>24
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>24
Glu Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>25
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>25
Asn Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>26
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>26
Gln Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>27
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>27
Asp Leu Glu Leu Asn Leu
  1                 5
<210>28
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>28
Asp Leu Glu Leu Gln Leu
  1                 5
<210>29
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>29
Thr Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>30
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>30
Asp Leu Glu Leu Thr Leu
  1                 5
<210>31
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>31
Ser Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>32
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>32
Asp Leu Glu Leu Ser Leu
  1                 5
<210>33
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>33
Asp Leu Thr Leu Arg Leu
  1                 5
<210>34
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>34
Asp Leu Ser Leu Arg Leu
  1                 5
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>35
Asp Leu His Leu Arg Leu
  1                 5
<210>36
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>36
Asp Leu Glu Phe Arg Leu
  1                 5
<210>37
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>37
Asp Phe Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>38
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>38
Ser Leu Asp Leu His Leu
  1                 5
<210>39
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
    Synthesized Amino Acid Sequence
<400>39
Asp Leu Thr Leu Lys Leu
  1                 5
<210>40
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>40
Asp Leu Ser Leu Lys Leu
  1                 5
<210>41
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>41
Leu Asp Leu Asn Leu
  1                 5
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>42
Leu Asp Leu Glu Leu
  1                 5
<210>43
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>43
Phe Asp Leu Asn Phe
  1                 5
<210>44
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>44
Phe Asp Leu Asn Ile
  1                 5
<210>45
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>45
Phe Asp Leu Asn
  1
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descfiption of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>46
Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>47
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>47
Leu Asp Leu Gln Leu Arg Leu
  1                 5
<210>48
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>48
Leu Asp Leu Asp Leu Arg Leu
  1                 5
<210>49
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>49
Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>50
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>50
Asp Leu Asp Leu Gln Leu Arg Leu
  1                 5
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>51
Asp Leu Asp Leu Asp Leu Arg Leu
  1                 5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descripton of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>52
Leu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu
  1                 5
<210>53
<211>9
<212>PRT
 <213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>53
Leu Asp Leu Asp Leu Gln Leu Arg Leu
  1                 5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Amino Acid Sequence
<400>54
Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu Arg Leu
  1                 5
<210>55
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>55
Asp Leu Gln Leu Arg Leu
  1                 5
<210>56
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>56
gatcttgatc ttaaccttgc tccacctatg gaattt                          36
<210>57
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>57
aaattccata ggtggagcaa ggttaagatc aagatc                          36
<210>58
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>58
cttgatctta accttgctcc acctatggaa ttt                             33
<210>59
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>59
aaattccata ggtggagcaa ggttaagatc aag                             33
<210>60
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>60
cttgatctta accttgctgc tgctgctgct gct                             33
<210>61
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>61
agcagcagca gcagcagcaa ggttaagatc aag                             33
<210>62
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>62
ctggatctag aactccgttt gggtttcgct                                 30
<210>63
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>63
agcgaaaccc aaacggagtt ctagatccag                                 30
<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>64
gatctagaac tccgtttg                                              18
<210>65
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>65
caaacggagt tctagatc                                              18
<210>66
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>66
ctggatctac aactccgttt gggttattac                                 30
<210>67
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>67
gtaataaccc aaacggagtt gtagatccag                                 30
<210>68
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>68
ctggatctag aactccgttt g                                          21
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>69
caaacggagt tctagatcca g                                          21
<210>70
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descrition of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>70
ctggatctag aactcgctgc cgcagcggct gca                             33
<210>71
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artficially
     Synthesized DNA Sequence
<400>71
tgcagccgct gcggcagcga gttctagatc cag                             33
<210>72
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>72
ctggatctag aactccgttt ggctgccgca                                 30
<210>73
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>73
tgcggcagcc aaacggagtt ctagatccag                                 30
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>74
ctggatctag aactccgttt gggt                                       24
<210>75
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>75
acccaaacgg agttctagat ccag                                       24
<210>76
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>76
ttcgatctta attttgcacc gttggattgt gtt                             33
<210>77
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>77
aacacaatcc aacggtgcaa aattaagatc gaa                             33
<210>78
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>78
tttgacctca acatccctcc gatccctgaa ttc                             33
<210>79
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>79
gaattcaggg atcggaggga tgttgaggtc aaa                             33
<210>80
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>80
tttcaattcg atcttaattt tccaccgttg gattgtgtt                       39
<210>81
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>81
aacacaatcc aacggtggaa aattaagatc gaattgaaa                       39
<210>82
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>82
gatctagatc tccgtttg                                              18
<210>83
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>83
caaacggaga tctagatc                                                   18
<210>84
<211>105
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descrition of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>84
gtgggtccta ctgtgtcgga ctcgtcctct gcagtggaag agaaccaata tgatgggaaa     60
agaggaattg atcttgatct taaccttgct ccacctatgg aattt                     105
<210>85
<211>105
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artficial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>85
aaattccata g gtggagcaa ggttaagatc aagatcaatt cctcttttcc catcatattg    60
gttctcttcc actgcagagg acgagtccga cacagtagga cccac                     105
<210>86
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>86
gatctggatc tagaactccg tttgggtttc gct                                  33
<210>87
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>87
agcgaaaccc aaacggagtt ctagatccag atc                                  33
<210>88
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>88
cttgatctgg atctagaact ccgtttgggt ttcgct                               36
<210>89
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descrition of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>89
agcgaaaccc aaacggagtt ctagatccag atcaag                               36
<210>90
<211>615
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>90
atggagagat caaacagcat agagttgagg aacagcttct atggccgtgc aagaacttca 60
ccatggagct atggagatta tgataattgc caacaggatc atgattatct tctagggttt 120
tcatggccac caagatccta cacttgcagc ttctgcaaaa gggaattcag atcggctcaa 180
gcacttggtg gccacatgaa tgttcacaga agagacagag caagactcag attacaacag 240
tctccatcat catcttcaac accttctcct ccttacccta accctaatta ctcttactca 300
accatggcaa actctcctcc tcctcatcat tctcctctaa ccctatttcc aaccctttct 360
cctccatcct caccaagata tagggcaggt ttgatccgtt ccttgagccc caagtcaaaa 420
catacaccag aaaacgcttg taagactaag aaatcatctc ttttagtgga ggctggagag 480
gctacaaggt tcaccagtaa agatgcttgc aagatcctga ggaatgatga aatcatcagc 540
ttggagcttg agattggttt gattaacgaa tcagagcaag atctggatct agaactccgt 600
ttgggtttcg cttaa                                                  615
<210>91
<211>93
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>91
aatgatgaaa tcatcagctt ggagcttgag attggtttga ttaacgaatc agagcaagat 60
ctggatctag aactccgttt gggtttcgct taa                              93
<210>92
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>92
gatctaaacc tccgtctg                                               18
<210>93
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>93
cagacggagg tttagatc                                                   18
<210>94
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>94
gatctagacc tccgtctg                                                   18
<210>95
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>95
cagacggagg tctagatc                                                   18
<210>96
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>96
gatctacagc tccgtctg                                                   18
<210>97
<211>18
<212>DNA
 <213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>97
cagacggagc tgtagatc                                                   18
<210>98
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>98
gatctacgac tccgtttg                                                   18
<210>99
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>99
caaacggagt cgtagatc                                                   18
<210>100
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>100
gagctagaac tccgtttg                                                   18
<210>101
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>101
caaacggagt tctagctc                                                   18
<210>102
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>102
aacctagaac tccgtttg                                                   18
<210>103
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>103
caaacggagt tctaggtt                                                   18
<210>104
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>104
cagctagaac tccgtttg                                                   18
<210>105
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>105
caaacggagt tctagctg                                                   18
<210>106
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>106
gatctagaac tcaacttg                                                   18
<210>107
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>107
caagttgagt tctagatc                                                   18
<210>108
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>108
gatctagaac tccagttg                                                   18
<210>109
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>109
caactggagt tctagatc                                                   18
<210>110
<211>18
<212>DNA
<213>Artficial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>110
acgcttgaat taagactc                                                   18
<210>111
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>111
gagtcttaat tcaagcgt                                                   18
<210>112
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>112
gatcttgaat taacgctc                                                   18
<210>113
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>113
gagcgttaat tcaagatc                                                   18
<210>114
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>114
agccttgaat taagactc                                                   18
<210>115
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>115
gagtcttaat tcaaggct                                                   18
<210>116
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>116
gatcttgaat taagcctc                                                   18
<210>117
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>117
gaggcttaat tcaagatc                                                   18
<210>118
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>118
gatcttacct taagactc                                                   18
<210>119
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>119
gagtcttaag gtaagatc                                                   18
<210>120
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>120
gatcttagct taagactc                                                   18
<210>121
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>121
gagtcttaag ctaagatc                                                   18
<210>122
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>122
gatcttcact taagactc                                                   18
<210>123
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>123
gagtcttaag tgaagatc                                                   18
<210>124
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>124
gatctcgaat ttcgtctc                                                   18
<210>125
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>125
gagacgaaat tcgagatc                                                   18
<210>126
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>126
gatttcgaac tacgtctc                                                   18
<210>127
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>127
gagacgtagt tcgaaatc                                                   18
<210>128
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>128
tcgcttgatc tacacctg                                                   18
<210>129
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>129
caggtgtaga tcaagcga                                                   18
<210>130
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>130
gatcttacgc taaagctg                                                   18
<210>131
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>131
cagctttagc gtaagatc                                                   18
<210>132
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>132
gatcttagcc taaagctg                                                   18
<210>133
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>133
cagctttagg ctaagatc                                                   18
<210>134
<211>232
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>134
Met Ala Arg Gly Lys Ile Gln Ile Lys Arg Ile Glu Asn Gln Thr Asn
  1                  5                       10                      15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Phe Lys Lys Ala
                20                     25                     30
His Glu Leu Thr Val Leu Cys Asp Ala Arg Val Ser Ile Ile Met Phe
          35                     40                        45
Ser Ser Ser Asn Lys Leu His Glu Tys Ile Ser Pro Asn Thr Thr Thr
       50                    55                       60
Lys Glu Ile Val Asp Leu Tyr Gln Thr Ile Ser Asp Val Asp Val Trp
 65                      70                      75                      80
Ala Thr Gln Tyr Glu Arg Met Gln Glu Thr Lys Arg Lys Leu Leu Glu
                    85                      90                     95
Thr Asn Arg Asn Leu Arg Thr Gln Ile Lys Gln Arg Leu Gly Glu Cys
             100                     105                    110
Leu Asp Glu Leu Asp Ile Gln Glu Leu Arg Arg Leu Glu Asp Glu Met
        115                     120                    125
Glu Asn Thr Phe Lys Leu Val Arg Glu Arg Lys Phe Lys Ser Leu Gly
     130                    135                    140
Asn Gln Ile Glu Thr Thr Lys Lys Lys Asn Lys Ser Gln Gln Asp Ile
145                     150                     155                     160
Gln Lys Asn Leu Ile His Glu Leu Glu Leu Arg Ala Glu Asp Pro His
                   165                    170                      175
Tyr Gly Leu Val Asp Asn Gly Gly Asp Tyr Asp Ser Val Leu Gly Tyr
              180                    185                     190
Gln Ile Glu Gly Ser Arg Ala Tyr Ala Leu Arg Phe His Gln Asn His
          195                     200                    205
His His Tyr Tyr Pro Asn His Gly Leu His Ala Pro Ser Ala Ser Asp
     210                     215                     220
Ile Ile Thr Phe His Leu Leu Glu
225                      230
<210>135
<211>699
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>135
atggcgagag ggaagatcca gatcaagagg atagagaacc agacaaacag acaagtgacg 60
tattcaaaga gaagaaatgg tttattcaag aaagcacatg agctcacggt tttgtgtgat 120
gctagggttt cgattatcat gttctctagc tccaacaagc ttcatgagta tatcagccct 180
aacaccacaa cgaaggagat cgtagatctg taccaaacta tttctgatgt cgatgtttgg 240
gccactcaat atgagcgaat gcaagaaacc aagaggaaac tgttggagac aaatagaaat 300
ctccggactc agatcaagca gaggctaggt gagtgtttgg acgagcttga cattcaggag 360
ctgcgtcgtc ttgaggatga aatggaaaac actttcaaac tcgttcgcga gcgcaagttc 420
aaatctcttg ggaatcagat cgagaccacc aagaaaaaga acaaaagtca acaagacata 480
caaaagaatc tcatacatga gctggaacta agagctgaag atcctcacta tggactagta 540
gacaatggag gagattacga ctcagttctt ggataccaaa tcgaagggtc acgtgcttac 600
gctcttcgtt tccaccagaa ccatcaccac tattacccca accatggcct tcatgcaccc 660
tctgcctctg acatcattac cttccatctt cttgaataa                        699
<210>136
<211>365
<212>PRT
<213>Araabidopsis thaliana
<400>136
Met Met Ser Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Asn Gly Gln Ser Gln Val
  1                  5                      10                     15
Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Glu Glu Glu Leu Leu Gln Tyr
               20                     25                     30
Tyr Leu Arg Lys Lys Val Asn Ser Ile Glu Ile Asp Leu Asp Val Ile
          35                       40                     45
Arg Asp Val Asp Leu Asn Lys Leu Glu Pro Trp Asp Ile Gln Glu Met
     50                     55                      60
Cys Lys Ile Gly Thr Thr Pro Gln Asn Asp Trp Tyr Phe Phe Ser His
 65                      70                     75                      80
Lys Asp Lys Lys Tys Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Ala
                    85                      90                     95
Ala Gly Phe Trp Lys Ala Thr Gly Arg Asp Lys Ile Ile Tyr Ser Asn
              100                    105                     110
Gly Arg Arg Ile Gly Met Arg Lys Thr Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg
         115                     120                     125
Ala Pro His Gly Gln Lys Ser Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu
     130                     135                     140
Asp Asp Asn Ile Ile Ser Pro Glu Asp Val Thr Val His Glu Val Val
145                      150                     155                  160
Ser Ile Ile Gly Glu Ala Ser Gln Asp Glu Gly Trp Val Val Cys Arg
                     165                    170                   175
Ile Phe Lys Lys Lys Asn Leu His Lys Thr Leu Asn Ser Pro Val Gly
               180                    185                     190
Gly Ala Ser Leu Ser Gly Gly Gly Asp Thr Pro Lys Thr Thr Ser Ser
         195                     200                    205
Gln Ile Phe Asn Glu Asp Thr Leu Asp Gln Phe Leu Glu Leu Met Gly
     210                    215                   220
Arg Ser Cys Lys Glu Glu Leu Asn Leu Asp Pro Phe Met Lys Leu Pro
225                    230                   235                    240
Asn Leu Glu Ser Pro Asn Ser Gln Ala Ile Asn Asn Cys His Val Ser
                  245                     250                    255
Ser Pro Asp Thr Asn His Asn Ile His Val Ser Asn Val Val Asp Thr
              260                     265                     270
Ser Phe Val Thr Ser Trp Ala Ala Leu Asp Arg Leu Val Ala Ser Gln
         275                      280                    285
Leu Asn Gly Pro Thr Ser Tyr Ser Ile Thr Ala Val Asn Glu Ser His
    290                     295                      300
Val Gly His Asp His Leu Ala Leu Pro Ser Val Arg Ser Pro Tyr Pro
305                    310                     315                    320
Ser Leu Asn Arg Ser Ala Ser Tyr His Ala Gly Leu Thr Gln Glu Tyr
                   325                     330                    335
Thr Pro Glu Met Glu Leu Trp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ser
             340                     345                     350
Ser Pro Gly Pro Phe Cys His Val Ser Asn Gly Ser Gly
         355                     360                     365
<210>137
<211>1098
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>137
atgatgtcaa aatctatgag catatcagtg aacggacaat ctcaagtgcc tcctgggttt 60
aggtttcatc cgaccgagga agagctgttg cagtattatc tccggaagaa agttaatagc 120
atcgagatcg atcttgatgt cattcgcgac gttgatctca acaagctcga gccttgggac 180
attcaagaga tgtgtaaaat aggaacaacg ccacaaaacg actggtattt ctttagccac 240
aaggacaaaa aatatccgac gggaacgaga actaacagag ccactgcggc tggattttgg 300
aaagcaactg gccgcgacaa gatcatatat agcaatggcc gtagaattgg gatgagaaag 360
actcttgttt tctacaaagg ccgagctcct cacggccaaa aatctgattg gatcatgcat 420
gaatatagac tcgatgacaa cattatttcc cccgaggatg tcaccgttca tgaggtcgtg 480
agtattatag gggaagcatc acaagacgaa ggatgggtgg tgtgtcgtat tttcaagaag 540
aagaatcttc acaaaaccct aaacagtccc gtcggaggag cttccctgag cggcggcgga 600
gatacgccga agacgacatc atctcagatc ttcaacgagg atactctcga ccaatttctt 660
gaacttatgg ggagatcttg taaagaagag ctaaatcttg accctttcat gaaactccca 720
aacctcgaaa gccctaacag tcaggcaatc aacaactgcc acgtaagctc tcccgacact 780
aatcataata tccacgtcag caacgtggtc gacactagct ttgttactag ctgggcggct 840
ttagaccgcc tcgtggcctc gcagcttaac ggacccacat catattcaat tacagccgtc 900
aatgagagcc acgtgggcca tgatcatctc gctttgcctt ccgtccgatc tccgtacccc 960
agcctaaacc ggtccgcttc gtaccacgcc ggtttaacac aggaatatac accggagatg 1020
gagctatgga atacgacgac gtcgtctcta tcgtcatcgc ctggcccatt ttgtcacgtg 1080
tcgaatggta gtggataa                                               1098
<210>138
<211>367
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>138
Met Gly His His Ser Cys Cys Asn Lys Gln Lys Val Lys Arg Gly Leu
 1                   5                    10                     15
Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Lys Leu Ile Asn Tyr Ile Asn Ser Tyr
              20                        25                      30
Gly His Gly Cys Trp Ser Ser Val Pro Lys His Ala Gly Thr Tyr Thr
          35                       40                     45
His Ile His Gly Phe Cys Leu Gln Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu
      50                      55                     60
Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Leu Lys Arg Gly Ser Phe Ser
 65                      70                     75                     80
Pro Gln Glu Ala Ala Leu Ile Ile Glu Leu His Ser Ile Leu Gly Asn
                    85                       90                    95
Arg Trp Ala Gln Ile Ala Lys His Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu
              100                     105                    110
Val Lys Asn Phe Trp Asn Ser Ser Ile Lys Lys Lys Leu Met Ser His
         115                      120                    125
His His His Gly His His His His His Leu Ser Ser Met Ala Ser Leu
     130                     135                     140
Leu Thr Asn Leu Pro Tyr His Asn Gly Phe Asn Pro Thr Thr Val Asp
145                    150                    155                     160
Asp Glu Ser Ser Arg Phe Met Ser Asn Ile Ile Thr Asn Thr Asn Pro
                  165                       170                    175
Asn Phe Ile Thr Pro Ser His Leu Ser Leu Pro Ser Pro His Val Met
              180                     185                      190
Thr Pro Leu Met Phe Pro Thr Ser Arg Glu Gly Asp Phe Lys Phe Leu
         195                     200                    205
Thr Thr Asn Asn ProAsn Gln Ser His His His Asp Asn Asn His Tyr
    210                   215                     220
Asn Asn Leu Asp Ile Leu Ser Pro Thr Pro Thr Ile Asn Asn His His
225                    230                      235                   240
Gln Pro Ser Leu Ser Ser Cys Pro His Asp Asn Asn Leu Gln Ttp Pro
                   245                    250                     255
Ala Leu Pro Asp Phe Pro Ala Ser Thr Ile Ser Gly Phe Gln Glu Thr
              260                     265                     270
Leu Gln Asp Tyr Asp Asp Ala Asn Lys Leu Asn Val Phe Val Thr Pro
         275                    280                     285
Phe Asn Asp Asn Ala Lys Lys Leu Leu Cys Gly Glu Val Leu Glu Gly
    290                        295                300
Lys Val Leu Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser Gln Asp His Gly Leu Phe
305                     310                      315                   320
Leu Pro Thr Thr Tyr Asn Phe Gln Met Thr Ser Thr Ser Asp His Gln
                   325                    330                      335
His His His Arg Val Asp Ser Tyr Ile Asn His Met Ile Ile Pro Ser
              340                      345                      350
Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser Cys Gly Gln Tyr Val Ile Thr
          355                      360                      365
<210>139
<211>1104
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>139
atgggtcatc actcatgctg caacaagcaa aaggtgaaga gagggctttg gtcacctgaa 60
gaagacgaaa agctcatcaa ctacatcaat tcatatggcc atggatgttg gagctctgtt 120
cctaaacatg caggcactta tacacatata catgggtttt gtttgcagag atgtggaaag 180
agttgtagat taagatggat aaattatcta agacctgatc ttaaacgtgg aagcttctct 240
cctcaagaag ctgctcttat cattgagctt cacagcattc ttggtaacag atgggctcaa 300
attgctaaac atctacctgg aagaacagat aacgaggtca agaatttctg gaactcgagc 360
attaaaaaga agctcatgtc tcaccatcat cacggtcatc atcatcatca tctctcttcc 420
atggcgagtt tgctcacaaa ccttccttat cacaatggat tcaaccctac tacagtcgac 480
gatgaaagtt caagattcat gtccaatatc atcacaaaca ctaaccctaa tttcatcact 540
ccaagccatc tctctcttcc ttctcctcat gttatgaccc cattgatgtt cccaacctct 600
agagaaggag atttcaagtt tctaaccaca aacaacccaa accaatctca tcaccatgat 660
aataaccatt acaacaacct cgacattttg tcacccacac caactataaa caatcatcat 720
caaccttcac tttcttcttg tcctcatgat aataatctcc aatggccagc gttaccagat 780
ttcccagcga gtaccatttc tggtttccaa gaaacccttc aagattatga tgatgctaat 840
aaactcaacg tgtttgtgac accattcaac gataatgcca aaaagttatt atgtggagaa 900
gttctcgaag gcaaagtact atcttcctcc tcaccaattt cacaagatca cggccttttt 960
cttcccacca cgtacaactt tcaaatgact tctacgagtg atcatcaaca tcatcatcga 1020
gtggactcat acatcaatca catgatcata ccatcatcat cctcatcgtc gccaatctct 1080
tgtggacagt acgtcataac ttaa                                        1104
<210>140
<211>253
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>140
Met Thr Ala Tyr Gln Ser Glu Leu Gly Gly Asp Ser Ser Pro Leu Arg
 1                   5                     10                      15
Lys Ser Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr
               20                        25                      30
Asn Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys
          35                     40                     45
Ala Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val
      50                     55                      60
Phe Ser Ser Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ser Asn Asn Ser Val Lys
 65                      70                      75                     80
Gly Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Ile Ser Asp Asn Ser Asn Thr
                    85                        90                    95
Gly Ser Val Ala Glu Ile Asn Ala Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ser Ala
              100                     105                      110
Lys Leu Arg Gln Gln Ile Ile Ser Ile Gln Asn Ser Asn Arg Gln Leu
         115                       120                     125
Met Gly Glu Thr Ile Gly Ser Met Ser Pro Lys Glu Leu Arg Asn Leu
    130                     135                     140
Glu Gly Arg Leu Glu Arg Ser Ile Thr Arg Ile Arg Ser Lys Lys Asn
145                   150                       155                     160
Glu Leu Leu Phe Ser Glu Ile Asp Tyr Met Gln Lys Arg Glu Val Asp
                  165                     170                      175
Leu His Asn Asp Asn Gln Ile Leu Arg Ala Lys Ile Ala Glu Asn Glu
              180                    185                     190
Arg Asn Asn Pro Ser Ile Ser Leu Met Pro Gly Gly Ser Asn Tyr Glu
         195                     200                     205
Gln Leu Met Pro Pro Pro Gln Thr Gln Ser Gln Pro Phe Asp Ser Arg
    210                     215                     220
Asn Tyr Phe Gln Val Ala Ala Leu Gln Pro Asn Asn His His Tyr Ser
225                     230                   235                   240
Ser Ala Gly Arg Gln Asp Gln Thr Ala Leu Gln Leu Val
                  245                      250
<210>141
<211>762
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>141
atgacggcgt accaatcgga gctaggagga gattcctctc ccttgaggaa atctgggaga 60
ggaaagatcg aaatcaaacg gatcgagaac acaacgaatc gtcaagtcac tttttgcaaa 120
cgtagaaatg gtttgctcaa gaaagcttac gagctctctg ttctttgtga tgctgaagtc 180
gcactcatcg tcttctctag ccgtggtcgt ctctatgagt actctaacaa cagtgtaaaa 240
gggactattg agaggtacaa gaaggcaata tcggacaatt ctaacaccgg atcggtggca 300
gaaattaatg cacagtatta tcaacaagaa tcagccaaat tgcgtcaaca aataatcagc 360
atacaaaact ccaacaggca attgatgggt gagacgatag ggtcaatgtc tcccaaagag 420
ctcaggaact tggaaggcag attagagaga agtattaccc gaatccgatc caagaagaat 480
gagctcttat tttctgaaat cgactacatg cagaaaagag aagttgattt gcataacgat 540
aaccagattc ttcgtgcaaa gatagctgaa aatgagagga acaatccgag tataagtcta 600
atgccaggag gatctaacta cgagcagctt atgccaccac ctcaaacgca atctcaaccg 660
tttgattcac ggaattattt ccaagtcgcg gcattgcaac ctaacaatca ccattactca 720
tccgcgggtc gccaagacca aaccgctctc cagttagtgtaa                     762
<210>142
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artficial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>142
agttagttac ttaagcttgg gcccc                                           25
<210>143
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>143
gatccagtaa gcttaattgg ttccggcgcc                                      30
<210>144
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>144
tagaattcgc ggccgcactc gag                                             23
<210>145
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>145
gagaattcgg gccagagctg cagctggatg g                                    31
<210>146
<211>82
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>146
ctagaggatc cacaattacc aacaacaaca aacaacaaac aacattacaa ttacagatcc 60
cgggggtacc gtcgacgagc tc                                          82
<210>147
<211>73
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>147
cgtcgacggt acccccggga tctgtaattg taatgttgtt tgttgtttgt tgttgttggt 60
aattgtggat cct                                                    73
<210>148
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>148
gggcttgatc tggatctaga actccgtttg ggtttcgctt aag               43
<210>149
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>149
tcgacttaag cgaaacccaa acggagttct agatccagat caagccc                   47
<210>150
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descrition of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>150
atgaccgcgt accaatcgga gctaggagg                                       29
<210>151
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>151
cactaactgg agagcggttt ggtcttggcg                                      30
<210>152
<211>6
<212>PRT
<400>152
Asp Leu Ser Leu Asp Leu
  1                 5
<210>153
<211>18
<212>DNA
<400>153
gatcttagcc taagcctg                                                   18
<210>154
<211>18
<212>DNA
<400>154
caggcttagg ctaagatc                                                   18
<210>155
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>155
gatgatgtca aaatctatga gcatatc                                         27
<210>156
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Desctiption of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>156
tccactacca ttcgacacgt gac                                             23
<210>157
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>157
gatgggtcat cactcatgct gcaacaagca                                30
<210>158
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized Primer Sequence
<400>158
agttatgacg tactgtccac aagagattgg                                30
<210>159
<211>75
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>159
gatccacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt acaattacag atcccggggg 60
taccgtcgac gagct                                                  75
<210>160
<211>67
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequerce
<400>160
cgtcgacggt acccccggga tctgtaattg taatgttgtt tgttgtttgt tgttgttggt 60
aattgtg                                                           67
<210>161
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>161
gatggcgaga gggaagatcc agatcaag                                        28
<210>162
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>162
ttcaagaaga tggaaggtaa tgatg                                           25
<210>163
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>163
ctggatctgg atctagaact ccgtttgggt ttcgcttaag                           40
<210>164
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descrition of Artificial Sequence：Artificially
     Synthesized DNA Sequence
<400>164
cttaagcgaa acccaaacgg agttctagat ccagatccag                           40

Claims (36)

1、一种不育性植物体的生产方法，其特征在于：
在植物体生产嵌合体蛋白质，使植物体不育化，上述嵌合体蛋白质融合有促进与花器形成相关基因表达的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
2、一种不育性植物体的生产方法，其特征在于：
在植物体生产嵌合体蛋白质，抑制与花器形成相关基因的表达，上述嵌合体蛋白质融合有促进与花器形成相关基因表达的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
3、根据权利要求1所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述促进与花器形成相关基因表达的转录因子为与雄蕊或雌蕊形成相关的转录因子。
4、根据权利要求1-3任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述不育性植物体，至少雄蕊的形成被阻碍。
5、根据权利要求3所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述与雄蕊或雌蕊形成相关的转录因子为促进与花药开裂相关基因转录的转录因子，通过在植物体内生产嵌合体蛋白质，抑制花药的开裂，上述嵌合体蛋白质融合有上述转录因子和将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能肽。
6、根据权利要求5所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：促进与上述花药开裂相关基因转录的转录因子为具有MYB域的转录因子，通过在植物体内生产嵌合体蛋白质，抑制与花药开裂相关基因的转录，上述嵌合体蛋白质融合有上述转录因子和将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
7、根据权利要求5或6所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述植物体的雌性器官具有生育性。
8、根据权利要求5-7任一项所述不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述植物体的花粉本身具有生育性。
9、一种不育性植物体的生产方法，其特征在于：
通过在植物体内生产嵌合体蛋白质，将花的形态变为重叠花瓣，上述嵌合体蛋白质融合有与雄蕊和雌蕊形成相关的转录因子，以及将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽。
10、根据权利要求1-4任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：包含将含有嵌合体基因的重组表达载体导入至植物细胞的形质改变工序，上述嵌合体基因由编码上述转录因子的基因和编码上述功能性肽的多核苷酸构成。
11、根据权利要求10所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：含有构建上述重组表达载体的表达载体构建工序。
12、根据权利要求1，3或5-8任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：包含将含有嵌合体基因的重组表达载体导入至植物细胞的形质改变工序，上述嵌合体基因由编码上述转录因子的基因和编码上述功能性肽的多核苷酸构成。
13、根据权利要求12所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：含有构建上述重组表达载体的表达载体构建工序。
14、根据权利要求1，3或9任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：包含将含有嵌合体基因的重组表达载体导入至植物细胞的形质改变工序，上述嵌合体基因由编码上述转录因子的基因和编码上述功能性肽的多核苷酸构成。
15、根据权利要求14所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：含有构建上述重组表达载体的表达载体构建工序。
16、根据权利要求1-4，10或11任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述转录因子为以下(a)或(b)记载的蛋白质：
(a)由序列号134所示氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号134所示氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成，具有促进与花器形成相关基因表达功能的蛋白质。
17、根据权利要求10或11所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，作为编码上述转录因子的基因，使用以下(c)或(d)记载的基因：
(c)将序列号135所示碱基序列作为开放读码框区域含有的基因、
(d)在严格的条件下杂交由序列号135所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因，并且编码促进与花器形成相关基因表达的转录因子的基因。
18、根据权利要求1，3，5，7，8，12或13任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，上述转录因子为以下(a)或(b)记载的蛋白质：
(a)由序列号136所示氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号136所示氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成，具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质。
19、根据权利要求1，3，5，7，8，12或13任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述转录因子为相对于序列号136所示氨基酸序列具有50％以上相同性、且具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质。
20、根据权利要求12或13任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，作为编码上述转录因子的基因，使用以下(c)或(d)记载的基因：
(c)将序列号137所示碱基序列作为开放读码框区域含有的基因、
(d)在严格的条件下杂交由序列号137所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因，并且编码促进与花药开裂相关基因转录的转录因子的基因。
21、根据权利要求1，3，6-8，12或13任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，上述转录因子为以下(a)或(b)记载的蛋白质：
(a)由序列号138所示氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号138所示氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成，具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质。
22、根据权利要求12或13任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，作为编码上述蛋白质的基因，使用以下(c)或(d)记载的基因：
(c)将序列号139所示碱基序列作为开放读码框区域含有的基因、
(d)在严格的条件下杂交由序列号139所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因，并且编码促进与花药开裂相关基因转录的蛋白质的基因。
23、根据权利要求1，3，9，14或15任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，上述转录因子为以下(a)或(b)记载的蛋白质：
(a)由序列号140所示氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号140所示氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。
24、根据权利要求14或15任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，作为编码上述转录因子的基因，使用以下(c)或(d)记载的基因：
(c)将序列号141所示碱基序列作为开放读码框区域含有的基因、
(d)在严格的条件下杂交由序列号141所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因，并且编码与雄蕊和雌蕊形成相关的蛋白质的基因。
25、一种不育性植物体的生产方法，其特征在于：
使用编码以下(a)或(b)所述蛋白质的基因：
(a)由序列号136所示氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号136所示氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列所构成，具有促进与花药开裂相关基因转录功能的蛋白质、
或者以下(c)或(d)所述的基因：
(c)将序列号137所示碱基序列作为开放读码框区域含有的基因、
(d)在严格的条件下杂交由序列号137所示碱基序列构成的基因与由互补碱基序列构成的基因，并且编码促进与花药开裂相关基因转录的转录因子的基因。
26、根据权利要求1-25任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，上述功能性肽为具有下述式(1)-(4)任一个所示氨基酸序列的肽：
(1)X1-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3
(式中，X1表示0-10个氨基酸残基、X2表示Asn或Glu、X3表示至少6个的氨基酸残基)
(2)Y1-Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3
(式中，Y1表示0-10个氨基酸残基、Y2表示Phe或Ile、Y3表示至少6个的氨基酸残基)
(3)Z1-Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3
(式中，Z1表示Leu、Asp-Leu或Leu-Asp-Leu，Z2表示Glu、Gln或Asp，Z3表示0-10个氨基酸残基)
(4)Asp-Leu-Z4-Leu-Ar g-Leu
(式中，Z4表示Glu、Gln或Asp)
27、根据权利要求1-25任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述功能性肽为具有序列号1-17任一个所示氨基酸序列的肽。
28、根据权利要求1-25任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，上述功能性肽为以下(e)或(f)记载的肽：
(e)具有序列号18或19所示氨基酸序列的肽、
(f)具有在序列号18或19所示氨基酸序列中，置换、缺失、插入、和/或附加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列的肽。
29、根据权利要求1-25任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，上述功能性肽具有下述式(5)所示的氨基酸序列：
(5)α1-Leu-β1-Leu-γ1-Leu
(式中，α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His，γ1表示Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp)。
30、根据权利要求1-25任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于，上述功能性肽具有下述式(6)-(8)任一个所示的氨基酸序列：
(6)α1-Leu-β1-Leu-γ2-Leu
(7)α1-Leu-β2-Leu-Arg-Leu
(8)α2-Leu-β1-Leu-Arg-Leu
(各式中的α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，α2表示Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His，β2表示Asn、Arg、Thr、Ser或His，γ2表示Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp)。
31、根据权利要求1-25任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述功能性肽具有序列号20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、38、39、40或152所示的氨基酸序列。
32、根据权利要求1-25任一项所述的不育性植物体的生产方法，其特征在于：上述功能性肽具有序列号36或37所示的氨基酸序列。
33、一种不育性植物体，是通过权利要求1-32任一项所述的生产方法生产的不育性植物体。
34、根据权利要求33所述的不育性植物体，其特征在于：在上述不育性植物体中，含有发育的植物个体、植物细胞、植物组织、愈伤组织、种子中的至少任一个。
35、一种不育性植物体生产试剂盒，其为用于进行权利要求1-32任一项所述生产方法的试剂盒，其特征在于，至少含有下述物质：编码促进与花器形成、雄蕊或雌蕊的形成、花药开裂、或者雄蕊和雌蕊的形成相关的基因表达的转录因子的基因、编码将任意转录因子转变为转录抑制因子的功能性肽的多核苷酸、含有启动子的重组表达载体。
36、根据权利要求35所述的植物的不育性植物体生产试剂盒，其特征在于：还含有用于将上述重组表达载体导入至植物细胞的试剂群。
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