CN116042654B - 甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因在创制重花瓣油菜种质中的应用 - Google Patents
甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因在创制重花瓣油菜种质中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于油菜遗传育种和基因工程技术领域，公开了甘蓝型油菜BnaA07.Douf‑1基因在创制重花瓣油菜种质中的应用。申请人精细定位并克隆了BnaA07.Douf‑1基因，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因转入重瓣甘蓝型油菜株系375中表达，可使花瓣数目由10‑15枚减少到4枚，在单瓣甘蓝型油菜B409和Westar中敲除该基因及其同源基因BnaC07.Douf‑1，会使油菜花瓣数目由4枚增加到5‑9枚。本发明克隆的甘蓝型油菜花瓣数目基因BnaA07.Douf‑1能够通过在油菜中定向敲除该基因及其同源基因而创制不同花型的甘蓝型油菜，应用于选育具高观赏价值的重花瓣油菜新品种，为观赏性油菜新品种的突破提供新种质和基因资源。
Description
技术领域
本发明属于油菜遗传育种和分子生物学技术领域，具体涉及甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因在创制重花瓣油菜种质中的应用。
背景技术
油菜是世界最重要的油料作物之一，也是我国第一大油料作物。随着全国各地油菜花节的顺利召开，油菜的种植给观赏旅游业也带来巨大的经济效益，因而，油菜花的观赏价值也逐渐引起油菜遗传育种工作者的重视。
在花型的研究方面，目前油菜中已报道的花瓣数目突变体或种质资源基本都是无花瓣或缺花瓣类型(Kelly,1995；余坤江，2017)，缺乏有实际观赏价值的花型突变体或种质资源。
重瓣性是花型的主要标志，也是决定开花植物观赏价值最重要的性状之一，因而是观赏园艺植物的主要育种目标。目前，植物中发现的重瓣性状绝大多数来源于花器官特征基因的同源异型突变，表现为雄蕊/雌蕊部分或全部瓣化(Bendahmane et al.,2013；Wang et al.,2020)，育性受到严重影响。当前已经克隆到的重瓣性状相关基因主要包括决定雌雄蕊特征的C类功能基因。对这些花瓣数目关键基因的分离和克隆，也大多是通过反向遗传学手段完成。在拟南芥中，C类AG基因的突变使得A类基因在第三轮花器官过度积累，从而导致雄蕊向花瓣同源异型转换，植株表现出花瓣数目增加，雄蕊数目减少(Bowman etal.,1991)。Noor等(2014)在矮牵牛中同时敲除C类MADS-box基因pMADS3和FBP6，获得了雄蕊瓣化的重瓣突变体，个别品种中还出现花中花。日本龙胆中的C类GsAG1基因由于插入反转录转座因子Tg s1引起重瓣龙胆的产生(Nakatsuka et al.,2015)。除以上植物，山茶、日本杜鹃和日本牵牛花中都发现了C类MADS-box基因突变导致的重瓣现象(Tasaki et al.,2017)。由于A类与C类基因之间存在相互拮抗作用，因此A类基因在重瓣的形成中也有重要作用。目前报道的多例显性重瓣突变体，都与A类AP2基因的突变有关，miR172也涉及其中(Gattolin et al.,2020)。拟南芥miR172主要在第三和第四轮花器官中高表达，抑制其靶标A类基因AP2在分生组织中心表达(Wollmann et al.,2010)。由于AP2与主要在分生组织中心表达的C类基因AG之间有拮抗作用，因此，当AP2在miR172的结合位点发生突变时，不再受miR172负调控的AP2在分生组织中心持续表达，同时抑制或降低AG基因的表达，从而导致花瓣或雄蕊数目增加，或形成花中花(Chen,2004；Zhao et al.,2007)。除花发育模型基因之外，很少有基因被证实与植物花瓣数目有关，也很少有育性正常的重瓣突变体或种质资源的报道。
本发明中所涉及的一个重瓣甘蓝型油菜种质资源，是一个花瓣数目为10-15枚(平均13.89±1.90枚)的稳定株系，命名为375。375重瓣性状不是由花发育模型基因同源异型突变导致的，它表现为除花瓣数目增多以外，其它花器官正常，育性正常，结实正常。本发明是从甘蓝型油菜中克隆BnaA07.Douf-1基因，并鉴定它在甘蓝型油菜重瓣花创制中的功能，通过缺失该基因在油菜中的功能来增加花瓣数目，对于培育观赏性油菜新品种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因在控制甘蓝型油菜花瓣数目中的应用，所述的BnaA07.Douf-1基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
利用甘蓝型油菜正常单瓣株系B409与重瓣株系375构建了分离群体，结合SLAF-seq技术混池分群分析，对控制花瓣数目的基因进行定位，利用图位克隆技术成功地分离了花瓣数目基因BnaA07.Douf-1，所述基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示，所述基因的多核苷酸的优选为SEQ ID NO.1所示。
本发明的保护范围包括，甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因在控制甘蓝型油菜花瓣数目中的应用，包括利用BnaA07.Douf-1和其同源基因BnaC07.Douf-1创制重花瓣转基因甘蓝型油菜；或是利用BnaA07.Douf-1基因创制单花瓣转基因甘蓝型油菜。
以上所述的应用中，优选的，创制重花瓣转基因甘蓝型油菜时，是通过将单瓣株系中的BnaA07.Douf-1和其同源基因BnaC07.Douf-1基因沉默、敲除或是编辑，使其丧失其原始功能；
以上所述的应用中，优选的，采取CRISPR/Cas9编辑方式进行重花瓣转基因甘蓝型油菜的创制，包括针对BnaA07.Douf-1基因和同源基因设计的两条sgRNA的序列分别为sgRNA1:GGTAGGAAGAGAGAG ATGTGAT和sgRNA2:GTTGGGTTGAAGAAGAGCCGGG；
以上所述的应用中，同源基因BnaC07.Douf-1的多核苷酸的优选为SEQ ID NO.3所示，基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.4所示。
以上所述的应用中，创制的重花瓣转基因甘蓝型油菜包含SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7或SEQ IDNO.9所示的基因，且同时包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示基因。
以上所述的应用中，优选的，创制单瓣转基因甘蓝型油菜时，是将BnaA07.Douf-1基因在重花瓣株系中进行表达；
以上所述的应用中，优选的，包括将BnaA07.Douf-1基因插入二元穿梭载体pCMBIA2300载体的KpnI-BamHI位点构建植物表达载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次从甘蓝型油菜中克隆得到了花瓣数目基因BnaA07.Douf-1，具体是利用甘蓝型油菜正常单瓣株系B409与重瓣株系375构建分离群体后通过图位克隆得到的。将该花瓣数目基因BnaA07.Douf-1通过基因工程改造技术导入甘蓝型油菜重瓣花株系375中，可使受体材料375的花瓣数目由10-15枚减少到4枚；在甘蓝型油菜正常单瓣株系B409/Westar中，利用CRISPR技术敲除BnaA07.Douf-1及其同源基因BnaC07.Douf-1可以使B409/Westar的花瓣数目由4枚增加到5-9枚，获得不同花型的甘蓝型油菜种质资源，不仅为观花油菜新品种的突破提供基因资源，也为增强油菜花节吸引力提供技术和材料支撑。
附图说明
图1为甘蓝型油菜B409和375的表型图；
其中A、B为B409的表型，C、D为375的表型。
图2为本发明实施例1中BnaA07.Douf-1基因的图位克隆；
其中A为基于SLAF-seq测序的初步定位；B为BnaA07.Douf-1区段连锁图谱；C为候选区间内的12个候选基因，D为重组单株自交后代表型。
图3为本发明实施例1中BnaA07.Douf-1基因的表达模式分析图。
图4为本发明实施例2中利用基因保守引物160-2L/R，特异引物160-15L/R和P160-6L/R分别在甘蓝型油菜正常单瓣株系B409和重瓣株系375基因组DNA中的扩增结果；
图中M为DNA Marker，片段大小依次为2000bp，1000bp，750bp、500bp、300bp和200bp，A图展示在B409中扩增出BnaA07.Douf-1和BnaC07.Douf-1条带，而在375中未扩增出BnaA07.Douf-1条带；B、C图展示在B409中扩增出BnaA07.Douf-1条带，而在375中未扩增出BnaA07.Douf-1条带。
图5为本发明实施例3中互补载体的构建图；
其中互补片段包含预测基因上游2000bp的启动子和992bp的编码区以及下游500bp的3’非翻译区。
图6为本发明实施例3中CRISPR/Cas9载体的构建图；
申请人在BnaA07.Douf-1基因的第1个外显子和第3个外显子上设计了2个sgRNA。
图7为本发明实施例3中互补载体阳性植株的PCR鉴定结果图。
图8为本发明实施例3中互补载体转基因T1代的表型图；
其中图A、B、C分别为对照375的花序、单朵花和各花器官表型；图D、E、F分别为转基因株系CL-1的花序、单朵花和各花器官表型，展现该株系花瓣数目降低到4-5枚；G、H、I分别为转基因株系CL-3的单朵花和各花器官表型，展现该株系花瓣数目降低到4枚。
图9为本发明实施例3中基因敲除CRISPR/Cas9载体转基因纯合T1代株系的表型图；
其中图A、B、C分别为对照Westar的花序，单朵花和各花器官表型；图D、E、F分别为纯合敲除株系bnadouf-1-1花序、单朵花和各花器官表型，展示该株系一朵5枚花瓣的花；G、H、I分别为纯合敲除株系bnadouf-1-2花序、单朵花和各花器官表型，展示该株系一朵6枚花瓣的花；G、H、I分别为纯合敲除株系bnadouf-1-3花序、单朵花和各花器官表型，展示该株系一朵9枚花瓣的花。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
甘蓝型油菜花瓣数目基因BnaA07.Douf-1的精细定位和候选基因确定
单株叶片DNA提取方法参见：Stewart and Via,1993,14(5):748-749。
将重瓣株系375和单瓣株系B409(《重花瓣甘蓝型油菜的遗传和花发育相关基因的表达研究》)杂交获得F1单株，重瓣株系375和单瓣株系B409的表型如图1所示。F1植株再与轮回亲本375进行连续回交，构建了一个包含565个单株的BC3分离群体。挑取BC3群体中的单瓣极端单株(花瓣数4枚)和重瓣极端单株(花瓣数8-12枚)各45株，按单株提取DNA并等量混合，分别建成单瓣和重瓣群体混合池，亲本B409和375各取10株分别混合成单瓣和重瓣亲本池，利用SLAF-seq(Specific Length Amplified Fr agment Sequencing)技术对4个混池测序，进行关键基因初步定位。取Δ(SNP_index)＝0.40为阈值，在甘蓝型油菜A07染色体上检测到一个0.45M(4,018,800-4,468,970bp)的候选区域与花瓣数目关联，将该基因命名为BnaA07.Douf-1。
基于甘蓝型油菜Darmor-bzh的参考基因组信息，在该候选区间内设计了57对分子标记，初步筛选经BC3群体验证后得到了13个与重瓣性状连锁的分子标记，其中6个SSR标记，2个SCAR标记，5个InD el标记。利用这些多态性标记对BC4群体单株进一步筛选分析，共鉴定出41株重组单株，在标记SSR2-6和SSR3-1一侧有2个重组单株，SSR4-3一侧有2个重组单株，根据重组单株的花瓣数目表型，将Bn aA07.Douf-1定位在标记SSR3-1和SSR4-3之间约155Kb的物理区段内。以上关键重组单株均套袋自交进行了后代验证。该候选区间内共有12个功能注释基因，对这12个基因进行qRT-PCR分析，发现BnaA07.Douf-1在单瓣株系B409不同发育时期的花蕾中正常表达，而在重瓣375中不表达，初步确定BnaA07.Douf-1可能是影响花瓣数目的关键基因，命名为BnaA07.Douf-1，编码一个RING家族的E3泛素连接酶。为了探究BnaA07.Douf-1在不同组织中的表达情况，分别提取B409不同组织的RNA进行反转录，得到cDNA后进行表达量检测，以油菜基因BnaActin7作为内参。结果显示，BnaA07.Douf-1除了在根中几乎不表达外，在幼嫩的花蕾、角果、叶片以及茎中都表达。结果如图3所示。
连锁图谱如图2所示，其中A为SLAF-seq分析得到的初定位区间；B为BnaA07.Douf-1区段遗传连锁图谱；C为候选区间内存在12个候选基因，D为重组单株自交后代表型统计。
实施例2：
甘蓝型油菜花瓣数目基因BnaA07.Douf-1的分离与克隆
在B409叶片中扩增候选基因BnaA07.Douf-1，其全长992bp，包含3个外显子和2个内含子。在甘蓝型油菜Darmor-bzh基因组数据库比对发现，BnaA07.Douf-1还有一个序列相似性达90％以上的同源拷贝BnaC07.Douf-1。利用BnaA07.Douf-1和BnaC07.Douf-1两拷贝保守引物160-2L/R分别在B409和375材料中扩增，扩增结果显示在B409中可以扩增到BnaA07.Douf-1及BnaC07.Douf-1，但在375仅能扩增到BnaC07.Douf-1(图4中A)。利用BnaA07.Douf-1特异引物160-15L和160-15R和高保真PCR法在B409和375中进行扩增，结果发现B409中可以扩增到该基因核苷酸序列，而在375中无片段扩增(图4中B)。B409中该基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。在该基因上游2kb和下游1kb的区域分别设计引物P160-6L和P160-6R，在单瓣B409中可以扩增出条带，而在重瓣375中没有带型显示(图4中C)，说明重瓣375中BnaA07.Douf-1基因缺失。对BnaA07.Douf-1及其BnaC07.Douf-1进行序列比较，结果表明，BnaC07.Douf-1与BnaA07.Douf-1之间相似性高达95.5％，有54个碱基的差异，其中20个碱基的变异位于外显子区域，34个碱基的变异位于内含子区域。其中BnaC07.Douf-1的多核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示，该基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.4所示。
PCR扩增的反应体系是：50ng模板DNA，各0.5μl正向和反向引物，2x Taq MasterMix，加ddH2O到总体积为10μL。PCR循环参数为94℃(30s)—56℃(30s)—72℃(60s)，共35个循环。接着用1.0％琼脂凝胶检测扩增产物，PCR检测结果如图4所示。图中M为DNA Marker，片段大小依次为2000bp，1000bp，750bp、500bp、300bp和200bp，A图为特异引物160-15分别在B409和375中扩增的结果，B图为启动子加基因本身的引物P160-6分别在B409和375中扩增的条带。本实施例所用到的引物序列如下：
160-2L:GCACAAGACCTAATGATATGATGACC
160-2R:GCTCTCAATTATTAGCGATATAAACCT；
160-15L：GCTGCCGGTCATTTCTCTCTCTCTCTCGC
160-15R：ATAGTACACCATCATGTGTC；
P160-6L：ACATTTTAAGATAGATTTTTAGTGCTTAATG
P160-6R：GGTAAGAGGTTATCACTTATCAATCATATCT。
实施例3：
甘蓝型油菜花瓣数目基因BnaA07.Douf-1的功能验证和应用
1.遗传互补载体的构建
为了验证BnaA07.Douf-1的功能，根据Darmor参考基因组序列，用SnapGene软件开发引物，在B409中扩增出该基因基因组序列(包含上游2000bp的启动子和992bp的编码区以及下游500bp的3’非翻译区)，酶切位点分析后发现该序列不存在Kpn I和BamH I酶切位点。因此在左右扩增引物中添加在Kpn I和BamH I酶切位点，利用高保真PCR聚合酶扩增得到3.5kb大小的片段，其中所采用的引物的序列为：
CL：GGGGTACCAGAGGGTTTCTAAAACGACGTG
CR：CGGGATCCATCGCACGAGAAAATAGAGGAG
将扩增出的目的基因片段通过重组的方式插入二元穿梭载体pCMBIA2300载体的KpnI-BamHI位点。该载体在植物体内的抗性为卡那霉素。表达载体的构建图如图5所示。
2.CRISPR/Cas9载体的构建
考虑到同源基因之间可能存在一定程度的功能冗余，为验证BnaA07.Douf-1基因在创制重瓣花油菜新种质中的应用潜力，我们在构建CRISPR/Cas9载体时，同时针对BnaA07.Douf-1和其同源基因BnaC07.Douf-1共有的序列设计sgRNA。共设计2个sgRNA，一个位于两个基因的第1个外显子，另一个位于两个基因的第3个外显子，载体构建按照中国农业大学陈其军老师的方法进行(Xing et al 2014)，两条sgRNA的序列分别为sgRNA1:GGTAGGAAGAGAGAGATGTGAT和sgRNA2:GTTGGGTTGAAGAAGAGCCGG G，表达载体图如图6所示。简要步骤如下：
1)在CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)网站设计引物后进行PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-DT1T2为模板进行四引物扩增。160-BsF/160-BsR为正常引物浓度；160-F0/160-R0稀释20倍。
2)纯化回收PCR产物，建立如下酶切连接体系：2μl的PCR片段，2μl pHSE401，1.5μl10x NEB T4 Buffer，1.5μl Cutsmart buffer，1μl BsaI，1μl T4 Ligase，6μl ddH2O。PCR反应程序：37℃，5h；50℃，5min；80℃，10min。取5μl转化大肠杆菌感受态。Kana平板筛选。菌落PCR鉴定，并挑3个阳性克隆用引物U626-IDF和U629-IDF扩增测序。引物序列如下：
U626-IDF:TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC
U629-IDR:AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC。
3)将阳性克隆摇菌提质粒，转化农杆菌感受态GV3101。
引物序列如下：
160-BsF：ATATATGGTCTCGATTG GTTGGGTTGAAGAAGAGCCGTT
160-F0：TGGTTGGGTTGAAGAAGAGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
160-R0：AACTCCTTCTCTCTCTACACTACAATCTCTTAGTCGACTCTAC
160-BsR：ATTATTGGTCTCGAAACTCCTTCTCTCTCTACACTACAA。
3.农杆菌介导的遗传转化
正确的重组质粒通过常规冻融法导入农杆菌菌株GV3101。利用农杆菌介导的油菜遗传转化方法，将互补载体转化甘蓝型油菜重瓣花375，CRISPR/Cas9载体转化B409和Westar。
4.互补转基因阳性单株的PCR鉴定和表型鉴定
对互补载体遗传转化的54个转基因单株进行PCR扩增，阳性植株按照常规方法提取叶片总DNA，用载体pCAMBIA2300上通用引物M13-48和片段中间引物160-4进行PCR鉴定，共获得49株转基因阳性苗，鉴定所用的引物序列如下：
M13-48:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
160-4:CGAACCAGCTCAAGCCATTTG
PCR扩增的反应体系是：30ng模板DNA，各0.5μl正向和反向特异引物(如上所示)，2x Taq Ma ster Mix，加ddH2O到总体积为10μl。PCR循环参数为94℃(30s)—55℃(30s)—72℃(120s)，共35个循环。然后用1.0％琼脂凝胶检测扩增产物。检测结果如图7所示。
在49个互补转基因阳性T0代单株中，27株的花瓣数目有所减少，不同的转基因单株花瓣数平均值约为6.38±0.95枚。连续自交获得T2代株系，观察比较对照375以及转基因株系花瓣数目和花器官表型，结果如图8所示。调查发现T2代株系平均花瓣数目约为5.17±0.54枚，与对照375相比显著降低。图8中，图A、B、C分别为对照375的花序、单朵花和各花器官表型，图D、E、F分别为转基因株系CL-1的花序、单朵花和各花器官表型，展现该株系花瓣数目降低到4-5枚，G、H、I分别为转基因株系CL-3的单朵花和各花器官表型，展现该株系花瓣数目降低到4枚花瓣。由此确定，BnaA07.Douf-1确实影响油菜花瓣数目。
5.敲除载体转基因阳性单株的编辑位点检测和表型鉴定
利用已构建好的敲除载体在甘蓝型油菜Westar(该类型单株花瓣数是4枚)进行遗传转化，使用引物U626-IDF/U629-IDR对T0代CRISPR/Cas9转基因植株进行CAS9蛋白的阳性检测。
通过水平胶检测，有明亮条带且大小的单株符合则视为阳性单株，发现有120株阳性苗。随后针对BnaA07.Douf-1和其同源基因BnaC07.Douf-1的两个靶点分别设计特异引物，利用高通量测序方法对靶向序列进行检测。对解码数据分析后发现CRISPR/Cas9载体转化的T0代单株中有59株发生了编辑，发生编辑的单株中，有23个单株花瓣数目增加到5-7枚。两个靶点的特异性引物序列如下：
检测BnaA07.Douf-1基因编辑位点测序的引物为：
A7-S1L:GGAGTGAGTACGGTGTGC GGCGCTTTCACGGCGGTGCT
A7-S1R:GAGTTGGATGCTGGATGG TGTGTAAGTTACAATCTTTCCTGCC；
A7-S2L:GGAGTGAGTACGGTGTGC CGACTAAATTGGAGCAAGGGAAAGG
A7-S2R:GAGTTGGATGCTGGATGG CCGTCTTGAACTGGTCTAAAC。
检测BnaC07.Douf-1基因编辑位点测序的引物为：
C7-S1L:GGAGTGAGTACGGTGTGC GATTTCACGGCGGTGCTCCA
C7-S1R:GAGTTGGATGCTGGATGG TTGTAAGTTACAATCTTTCCCAAG；
C7-S2L:GGAGTGAGTACGGTGTGC TGAATAAATTGGAGCAAGGGAAAATT
C7-S2R:GAGTTGGATGCTGGATGG TGGTAGGTGGACCAATGTCTCACCCA。
将T0代单株自交，T1代纯合株系花瓣数目为5-9枚，除花瓣数目发生变化外，个别单株也出现了双柱头以及花丝变短的现象，但育性和结实性不受影响。在敲除载体转基因T1代株系中，观察比较对照West ar以及敲除株系花瓣数目和花器官表型，结果如图9所示。其中图A、B、C分别为受体Westar的花序，单朵花和各花器官表型，图D、E、F分别为纯合敲除株系bnadouf-1-1花序、单朵花和各花器官表型，展示该株系单株5枚花瓣的表型，G、H、I分别为纯合敲除株系bnadouf-1-2花序、单朵花和各花器官表型，展示该株系单株5-6枚花瓣的表型，G、H、I分别为纯合敲除株系bnadouf-1-3花序、单朵花和各花器官表型，展示该株系单株7-9枚花瓣的表型。
bnadouf-1-1株系中，BnaA07.Douf-1经编辑后的多核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，BnaC07.Douf-1经编辑后的多核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示；
bnadouf-1-2株系中，BnaA07.Douf-1经编辑后的多核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，BnaC07.Douf-1经编辑后的多核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示；
bnadouf-1-3株系中，BnaA07.Douf-1经编辑后的多核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示，BnaC07.Douf-1经编辑后的多核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。
即本发明成功克隆获得了甘蓝型油菜花瓣数目基因BnaA07.Douf-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。将花瓣数目基因BnaA07.Douf-1通过基因工程技术导入至甘蓝型油菜重瓣株系375或者在正常单瓣油菜Westar和B409中敲除BnaA07.Douf-1及其同源拷贝，均可导致甘蓝型油菜花瓣数目的变化，因此，本发明可用于油菜花型遗传育种的研究，创制不同花型的甘蓝型油菜品系，为观赏性油菜新品种的突破提供基因和材料资源，为增强油菜花节吸引力提供技术和材料支撑。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1. 甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因在控制甘蓝型油菜花瓣数目中的应用，所述基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
2. 甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因及其同源基因BnaC07.Douf-1在创制重花瓣转基因甘蓝型油菜中的应用，所述BnaA07.Douf-1基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示，所述同源基因BnaC07.Douf-1基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的应用，是通过将单瓣株系中的BnaA07.Douf-1及其同源基因BnaC07.Douf-1沉默、敲除或是编辑，使其丧失其原始功能。
4. 根据权利要求3所述的应用，是采取CRISPR/Cas9 编辑方式进行重花瓣转基因甘蓝型油菜的创制，包括针对BnaA07.Douf-1基因和其同源基因BnaC07.Douf-1设计的两条sgRNA的序列分别为sgRNA1:GGTAGGAAGAGAGAGATGTGAT和sgRNA2:GTTGGGTTGAAGAAGAGCCGGG。
5. 甘蓝型油菜BnaA07.Douf-1基因在创制单花瓣转基因甘蓝型油菜中的应用，所述基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的应用，是将BnaA07.Douf-1基因在甘蓝型油菜重花瓣株系中进行表达。
7. 根据权利要求6所述的应用，包括将BnaA07.Douf-1基因插入二元穿梭载体pCMBIA2300 载体的 KpnI - BamHI 位点构建植物表达载体。
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