CN110592097B - 调控水稻大穗基因、突变体及其分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域；具体涉及一种调控水稻大穗基因、其突变体及分子标记的应用。本发明公开了一种调控水稻大穗基因OsBP，该基因的用途为增加穗长、每穗实粒数、结实率、粒长、粒宽。本发明还公开了调控水稻大穗基因OsBP的分子标记CAPS‑4，该分子标记CAPS‑4用于水稻大穗鉴定和/或其后代辅助选择育种。

Description

调控水稻大穗基因、突变体及其分子标记和应用

技术领域

本发明属于生物领域；具体涉及一种调控水稻大穗基因、其突变体及分子标记的应用。

背景技术

水稻作为世界主要粮食作物，其产量的提高是缓解当今粮食安全问题的关键因素。穗部性状是水稻产量的直接影响因素，主要包括穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗粒数、着粒密度和结实率等，适当增加穗长、穗部籽粒数量和提高结实率一直是水稻高产的主要途径。

目前已知的调控水稻大穗基因有：IPA1基因、LP基因、OsCKX2基因等；IPA1基因受miRNA156调控，调节一次枝梗数目；LP基因通过提高一次枝梗和二次枝梗数形成大穗；OsCKX2基因通过调节激素含量改变穗型。

Ashikari,M.,Sakakibara,H.,Lin,S.,Yamamoto,T.,Takashi,T.,Nishimura,A.,&Matsuoka,M.(2005).Cytokinin oxidase regulates rice grainproduction.Science,309(5735),741-745.

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种调控水稻大穗基因及分子标记和应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控水稻大穗基因OsBP，该基因具有SeqID No：1所示的核苷酸序列。

本发明还同时公开了上述基因的用途：增加穗长、每穗实粒数、结实率、粒长、粒宽。

本发明还同时公开了调控水稻大穗基因OsBP的分子标记CAPS-4，以水稻作为物种，所述分子标记的正向引物为5’-CGGGATAGCCTACAAGCAGT’-3，反向引物为5’-ACCCACAAGACGACGATAGA-3’。

本发明还同时公开了上述分子标记CAPS-4的用途：用于水稻大穗鉴定和/或其后代辅助选择育种。

作为本发明的分子标记CAPS-4的用途的改进：当筛选突变体osbp和02428的后代时，选择后代中带型与突变体osbp带型一致、均为aa的单株用于育种，而带型为AA或者Ab时，均为常规穗型。

突变体osbp在基因LOC_Os01g10110中3’UTR处存在一个SNP，由C突变为T(图2)，将其命名为OsBP基因。

本发明涉及大穗型水稻材料osbp突变体的鉴定、基因定位及分子标记CAPS-4的开发利用。本发明通过EMS诱变处理籼稻9311，鉴定获得一个稳定遗传的大穗突变体osbp。因该突变体整体长势优良，穗长、每穗实粒数、结实率、粒长、粒宽、千粒重显著高于野生型9311，因而显著提升了单株osbp的单株产量。

在穗型改良育种过程中，将需要改良穗型的水稻材料与大穗型osbp杂交后构建F₂群体，在群体利用CAPS-4分子标记进行筛选。检测水稻大穗型的分子标记方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物进行纯化及酶切，检测判断水稻植株粒形的基因型，大穗水稻材料osbp和分子标记CAPS-4配套使用，可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。本发明设计特异性分子标记CAPS-4，对水稻苗期提取的DNA进行PCR扩增后，根据其PCR产物，检测不同水稻植株的基因型，该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是野生型9311和突变体osbp的表型比较；

a：开花期植株，标尺为28cm；b：成熟稻穗，标尺为5cm；c：成熟稻米，标尺为4mm；d：糙米，标尺为3mm。

图2是OsBP基因的定位；

a：OsBP初步定位在第一染色体上标记1.2和1MY06之间；b：OsBP被精细定位到一个28.04kb的区间；c：区间中包含4注释基因。

图3是OsBP基因的表达谱；

OsBP基因的根、叶、茎、叶鞘、茎尖分生组织及抽穗后3天、6天、10天、15天和20天的幼穗中的表达量。

图4是野生型9311和突变osbo之间的细胞分裂素脱氢酶酶活及细胞分裂素含量比较；

a：幼穗中的细胞分裂素脱氢酶酶活；b：幼穗种的细胞分裂素含量。**代表t检验在0.01水平上有显著差异。

图5是CAPS-4标记在不同单株中的条带；

a：扩增的PCR产物长度及NsiⅠ酶切位点序列；b：在不同单株中扩增的PCR产物条带；c：NsiⅠ酶切后的条带M：DL2000；9311：野生型9311；osbp：突变体osbp。

图6为OsBP基因在突变体中的序列；

表示5’-UTR；

表示3’-UTR；黑色部分为外显子；方框中的T为SNP。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、突变体osbp的农艺性状

取籼稻“9311”种子500g，浸种16h，用0.4％EMS诱变处理，8h后晾干，处理后的种子播种，M₁成熟后混合收种。次年播种M₂种子，获得大穗型突变体，突变体多代连续自交鉴定出稳定遗传的大穗突变体osbp。

与野生型水稻9311相比，突变体osbp整体长势优良，穗型明显变大(图1和表1)。突变体osbp的穗长、一次枝梗数、二次枝梗数显著高于野生型9311。突变体osbp的每穗粒数和每穗实粒数、结实率、粒长、粒宽、千粒重和单株产量同样显著高于野生型9311。而株高、一次枝梗和二次枝梗数之间的比值、单株有效穗、糙米粒长、糙米粒宽和收获指数两者之间没有明显差异。总体而言，突变体osbp的单株产量显著高于野生型9311。

表1、野生型和突变体osbp的农艺性状

**表示在0.01水平上显著差异；t测验。

实施例2、目标基因定位

1、DNA的提取

取新鲜的水稻叶片组织保存在-20℃的条件下。把叶片剪碎后，转移到2ml离心管中，并加入65℃预热的CTAB溶液800μl，加入小铁珠后研磨成匀浆。在65℃水浴中处理匀浆35min，在这期间每隔10min充分摇匀离心管一次。水浴完成后在离心管中加入等体积(800μl)的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，充分混匀离心管后，12000r离心10min。取离心后的上清液500μl于1.5ml离心管中，加入450μl异丙醇溶液和50μl的醋酸钠(3mol/L)溶液，并轻轻摇匀，于4℃条件下放置10min，于4℃条件下12000r离心5min。接着倒掉离心管上清液后加入400μl 75％的乙醇溶液，12000r离心3min，再次弃上清，室温中晾干离心管。最后在离心管中加入150μl超纯水，得到水稻基因组DNA，并用2％琼脂糖凝胶电泳来检测目的DNA的纯度，于4℃下保存。长时间保存的DNA需放置于-20℃的条件下。

2、PCR扩增及聚丙烯凝胶电泳检测

利用基因组DNA的PCR反应来进行SSR分析，PCR反应体系(10μl)为：DNA模板体积0.5μl，浓度10μM的正向和反向引物各0.15μl(表2)，dNTPs 0.15μl，10×PCR buffer 1μl，Taq酶0.2μl，最后用超纯水加至10μl。

PCR克隆需要的程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec、72℃30sec，30个循环；72℃5min；4℃反应停止。反应结束后，10μl的体系中加入1μl溴酚蓝染色液，并取1μl的混合液进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳约1.5h，接着在水平震荡仪上用0.1％硝酸银溶液处理凝胶10min，在用去离子水漂洗凝胶，最后用包含1.5％NaOH，0.019％碳酸氢钠和0.375％甲醛的显色液处理凝胶5min，直至肉眼可区分的条带结果出现，记录数据并拍照。

表2、精细定位时所用的引物序列

3、目的基因连锁分析

将突变体osbp和024284杂交获得F₁，将F₁自交，得F₂。

从上述突变体osbp和024284杂交获得的F₂定位群体中分别选出具有大穗表型单株和非大穗表型单株各12株，提取对应的DNA后按照粒形等体积混合DNA溶液，构建图位克隆分析方法中的大穗型群体与正常穗型群体。

从Gramene(http://ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html)中获得日本晴(粳稻品种)与9311(籼稻品种)的基因序列，通过NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对其基因组序列差异后，用Primer 5.0设计并获得分子标记。选择350对随机分布在水稻的十二条染色体上的SSR和InDel分子标记，利用BSA(Bulk Segregation Analysis)法来筛选连锁标记。

获得与目的基因连锁的分子标记后，用700株具有大穗表型的F₂单株对目的基因进行精细定位。在聚丙烯酰胺凝胶电泳条带中，根据每一个单株在不同引物(表2)中连锁的情况，与突变体osbp电泳条带完全相同的F₂单株用数字“1”表示；与02428电泳条带完全相同的F₂单株用数字“2”表示；同时表现出突变体osbp与02428电泳条带的F₂单株用数字“3”表示。因此通过公式(“2”的F₂单株数目的2倍+“3”的F₂单株数目)/F₂单株总数700的2倍)，得知当前分子标记与目的基因的遗传距离，从而不断缩小分子标记与目的基因连锁的距离。

在突变体osbp/野生型9311的F₂代遗传分析群体中，大穗形植株和非大穗型植株数目分别701株和2219株，经卡方检验符合3:1((χ²＝3.07<χ² _0.05＝3.84)的分离比。说明突变体osbp穗型的变化是由一个隐性核基因控制的。

利用图位克隆的方法，对突变体osbp/02428构建的F₂定位群体初步定位，发现位于第1染色体上的SSR标记1.2和Indel标记1MY06与目的基因连锁(图2)。接着利用1MY01、1MY02、1MY03、1MY04、1MY05等分子标记对700个F₂具大穗表型的单株进行精细定位，将目的基因定位在InDel标记1MY01和1MY03之间物理距离约为28.04kb的区间中(图2)。根据网站Rice Genome Annotation Project Website(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中的注释得知，目的区间内包含5个基因(表3)。对目的区间内的基因进行测序发现，突变体osbp在基因LOC_Os01g10110中3’UTR处存在一个SNP，由C突变为T(图2)，将其命名为OsBP基因。

OsBP基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

表3、目的区间内的候选基因

OsBP基因编码一种降解细胞分裂素的酶，比较不同组织中该基因的表达谱发现，突变体中该基因在根、茎、叶鞘、茎尖分生组织及抽穗后3天、6天、10天、15天和20天的幼穗中的表达均明显减弱(图3)。从而导致细胞分裂素水解酶活减弱，使得细胞分裂素在花序分生组织中累积(图4)。增加繁殖器官的数目，穗粒数就越多，形成大穗，最终提高水稻的产量。

实施例3、OsBP基因功能过表达验证

在引物两端加上Sac和EcoRⅠ酶切位点及相应的保护碱基，扩增OsBP基因的ORF序列，电泳割胶回收，将纯化后的片段连接到pCAMBIA1300中。转入大肠杆菌DH5α后提取质粒，通过电击转化方法将质粒转入至农杆菌LAB4404。选取9311种子，放置在诱导培养基诱导产生愈伤组织，再次继代培养21天的愈伤组织，再将携带有质粒的农杆菌侵染水稻愈伤组织。用40mg/L的潮霉素多次筛选，获得抗性愈伤组织，并在50mg/L的与分化培养基上培养11天。转至分化培养基上，25℃下光照培养直至出现抗性转基因植株。在T₁和T₂代观察转基因植株穗型，发现过表达条件下，植株穗型明显变小、粒形变小。

实施例4、OsBP基因编辑改良水稻穗型的方法

将目标基因的CDS序录入CRISPR-GE基因编辑便捷软件工具包(http://skl.scau.edu.cn/)，对基因进行靶点设计，寻找脱靶率低的最优靶点，并利用该工具包进行对应靶点的引物设计。采用Overlapping PCR的方法构建sgRNA表达盒，用于与pYLCRISRP/Cas9载体的连接。构建完成的质粒转入农杆菌后转化水稻愈伤组织，经过多次筛选及分化、再生，直至获得基因编辑植株，经过筛选，获得纯合的基因编辑植株。与野生型相比，基因编辑后的植株穗型变大，粒形变大。

实施例5、分子标记的开发及利用

1、配置组合及选择单株

1)配置组合：将需要进行穗型改良的水稻材料02428为母本，大穗材料osbp为父本，配置组合获得F₁种子，自交一代以后获得F₂杂交群体。

2)选择单株：在F₂杂交群体大部分植株已完成灌浆后，观察单株穗型及生长状况，将群体单株分为两类：第一类为生长旺盛的大穗型单株，第二类为生长情况一般且为正常穗型的单株。

2、分子标记的开发及验证

当osbp突变体的3’UTR处的C突变为T时，出现了一个新的酶切位点NsiⅠ，根据野生型和突变体的酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)，由此开发了一个CAPS标记，命名为CAPS-4。利用1MY01、1MY02、1MY03、1MY04、1MY05等分子标记对700个F₂具大穗表型的单株进行精细定位，将目的基因定位在InDel标记1MY01和1MY03之间物理距离约为28.04kb的区间中。对该区间测序发现，突变体osbp在基因LOC_Os01g10110中3’UTR处存在一个SNP(序列1，即，SEQ ID NO:1)，由C突变体成T，使突变体osbp突变体的该位点新产生了一个NsiⅠ酶切位点，由此开发了一个CAPS-4分子标记，具体流程如下：

1)PCR反应扩增目标片段：

PCR反应体系(10μl)为：DNA模板体积0.5μl，浓度10μM的分子标记CAPS-4的正向引物(5’-CGGGATAGCCTACAAGCAGT’-3)和反向引物(5’-ACCCACAAGACGACGATAGA-3’)各0.15μl，dNTPs 0.15μl，10×PCR buffer 1μl，Taq酶0.2μl，最后用超纯水加至10μl。PCR克隆需要的程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec、72℃30sec，30个循环；72℃5min；4℃反应停止。扩增获得PCR产物长度为666bp(图5b)。

2)PCR产物纯化：

利用Axyprep DNA凝胶回收试剂盒进行PCR产物纯化，具体流程如下：

①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶电泳，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。

②计入3倍凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后与75℃加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化。

③加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，温合均匀。

④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA制备管，12，000Xg离心1min。弃滤液。将制备管放回2ml离心管，加500μI BufferW1，12，000Xg离心305，弃滤液。将制备管放回2ml离心管，加700μI Buffer W2，12，000X 9离心305，弃滤液。以同样的法再用700μI Buffer W2洗涤一次12，000Xg离心1min。将制备管放回2ml离心管中，12，000Xg离心1min。

⑤将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管的膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min 12，000Xg离心1min洗脱DNA。

3)NsiⅠ酶切：

取8μl体积的PCR产物，加入8μl的酶切buffer(10mM Tris-HCl(pH 8.5),10mMMgCl₂,100mM KCl,0.1mg/mL牛血清蛋白)和2μl的NsiI(TaKaRa，大连)，加水至20μl。在37℃下温浴12小时，将扩增产物及酶切产物，经溴化乙锭染色后上样在1.2％琼脂糖凝胶上，电泳后在UVP凝胶成像仪上成像(图5c)。在F₂群体中所有具有大穗的个体跟突变体一样，被NsiI酶切成160bp和506bp这两个片段，即为aa带型。而具有正常穗型的单株出现了两种带型，其中一种带型是跟02428一致(即，为AA)，另外一些单株具有了双亲的带型(即，为AB)，如图5c。

3、水稻基因型分型

利用突变体osbp作为父本，开展分子标记辅助育种。

凡是与突变体osbp对应的条带大小一致的基因型标记为aa，即父本为aa带型，具有160bp和506b这两个片段；

母本带型的为AA，即，只有666bp这一个片段；

杂合基因型则为Aa，即，有666bp、160bp和506bp这三个片段。

在群体筛选过程中，根据特异性分子标记CAPS-4的带型，检测显性基因A和隐性基因a的存在与否。凡是酶切条带与osbp突变体一致的均为大穗型。

验证实验如下：

待测材料为以大穗材料osbp为父本、水稻材料02428为母本的构建F₂群体，随机选择92株，经检测，条带为aa的共21株，其种植所得的结果均为大穗型植株；而，条带为AA或者Aa的共71株，其种植所得的结果均为普通穗型植株。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 调控水稻大穗基因、突变体及其分子标记和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atctagctat ctatcagctg ccttccatcg tcagcacaca aactacacaa gaatctgctt 60

atttataggc caccttgtcc cttctacaat ggtgcaagaa cacacaaatt cacacacaca 120

ctgacacaca caaaccgatc gattgattga ttgataatga agcaagagca ggtcaggatg 180

gcagtgctcc tcatgctcaa ctgcttcgtc aaggccacgg cgccgccgcc atggccgccg 240

tcggcttcgt ccgcctcctt cctcgacgac ctcggcgacc tcggcatcgc gccgctcatc 300

cgcgccgacg aggcgggcac cgcgcgcgcc tccgccgact ttggcaacct ctccgtcgcc 360

ggcgtcgggg cgcctcggct cgccgccgcc gccgccgtgc tctacccgtc gcgccccgcc 420

gacatcgccg cgctgctgcg cgcgtcgtgc gcacgcccgg cgccgttcgc ggtgtccgcg 480

cgggggtgtg gccactcggt gcacggccag gcctccgcgc ccgacggcgt cgtcgtcgac 540

atggcgtcgc tcggccgcct gcagggcggc ggcgcgcggc gcctcgccgt gtcagtggag 600

gggcggtacg tcgacgccgg cggcgagcag ctgtgggtgg acgtgctgcg cgcgtccatg 660

gcgcacgggc tcacgccggt gtcgtggaca gactacctcc acctcaccgt cggcggcacg 720

ctgtccaacg ccggcatcag cggccaggcc ttccgccatg gcccccagat ttccaacgtg 780

ctagagctcg acgtcatcac cggtacgtag atccatcaca tctactaaga cacgcgccgc 840

catgatcgag gtaattaagg tataggtgtt ttgacgtata catgtatctg caggtgtcgg 900

ggagatggtg acgtgctcga aggagaaggc gccggacctg ttcgacgcgg tgctgggcgg 960

gctggggcag ttcggcgtca tcacgcgggc gcgcatcccg ctcgcgccgg cgccggcgag 1020

ggcgcggtgg gtgcggttcg tgtacacgac ggcggcggcg atgacggccg accaggagcg 1080

cctcatcgcc gtcgatcgcg ccggcggcgc cggcgcggtg ggcgggctga tggactacgt 1140

cgagggctcg gtccacctga accagggcct ggtcgagacc tggcgcacgc agccgcagcc 1200

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cggcggcgcc gccgggccgt ccgccgccga cgttgacaag gtatactagc tagctactag 1380

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aagctgcaaa aacttttggc gccacctggg gcttacgctt acgcacgcat gcaattaagg 1500

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tttggagtat taaatataga ctaataaaaa aactaatttc ataaatgaga gctaatccgc 1620

gagacgaatt ttttaagcct aattaatcta taattataaa agtttattgt agcatcacat 1680

tgtcaaaatc atgacataat tagactcaaa agattcgtct cgtgaattag tccaagatat 1740

ggaatatgtt ttataattag tgtatgttta atactccaaa ttagtattca aacatctggt 1800

gtgacatgga cttggaataa gtccgtggaa accaaacaga ccctaacggt gcatgaaatt 1860

gaagtctctt gcgccgtcga catcgtcgta cttggcctac cacttttgtc tgccacgcga 1920

tgcacctctc gctatcacac acctaactgg aagtaattaa ataattattc gattctgtgt 1980

taattttttt ttatcttcct tagttcccgg agagacaaag attagatact atagtagcaa 2040

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tttcgtccaa aacagtgaaa agcatgcgtg ctagtgtagg tagtagctac caggacgaat 2220

tatatcatta acagtatttg tagcacatca aggaaaaact tgtcttttta aacactgtta 2280

cagtcttcag aacgcacaac tttaacaggt atttttgtat tatatttttt taaaaaaaaa 2340

taaaggtaat aaaattatgg tattgtaaaa gtatattttt aaggaaaatc atataaccaa 2400

tcaaaagttt atgaagatat acatattgat gttcaaagtt actaaaagtt gacttaaaca 2460

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agcatttcta attatatgca tctagacaaa tgcatataaa aatactttat tttttaaagt 2580

gagggagtat caattttgag catgtagcta gactagatta gtgtatgtct acgcacatat 2640

ctgttgttct gcacaaaact actactcatc ggtcctaaaa tataagaatt taaaattgga 2700

tgggacatac cctaatacaa tgaatttaga catggacata tactagtaat accatgtact 2760

acctccatcc caaaataagt tcacttttca tccatctcac acataccaat agaaagtact 2820

acaaatttcg gttattctct attttcacaa actccgatgc aatgattatt ttaaaaataa 2880

acttatttta gaataaatgg aatgagcaaa atataaactg gtgtgtttga ggagaagggg 2940

attgaggaga ttgggaagat acgcaaaacg aggtgagcca ttagctcatg attaattgag 3000

tattaactat tttaaatttc aaaaatggat taatatgatt ttttaaagca actttcctat 3060

ataaaatttt tacaaaaaac acaccgttta atagtttgga aagcgtactt gcggaaaacg 3120

aggtgctttc tccctcaatg tcgtccaaac gaacgctgcc ttattacggg actgaggaat 3180

tagagctttg ccagaaagaa atcagcatcg ccagcttgga cctaccatcc atgcatgcat 3240

catgtggcca ttgacacatc acatagtatg tgctagctag ctagcttttg atcatagtta 3300

catgtatcta gctaggctag aagctggaaa ccgatggata tgatggatct ctcatggatg 3360

acaggccagc caaagatctg tgcgccacta gatacagtgc atgcatcagc ttgtatggtt 3420

ataaccctag ctagccagct ttagcacaca catgcatatg catgcatgag cccccatctt 3480

ttgcaacacg accgaccaac tatgttggct ctatatagat agctagctag ttattccatg 3540

catatacagt ttgcatttcc tagctatagc ttttgctatg tgatccgaga agatcctgca 3600

tgcccacacg tgacacgtca cacacacatg tggacaaagt actgcctcac tttatccttg 3660

catgacgtca cgtcgccacc tgtccatcca cgctgctagt gctggcaaaa ttaataactc 3720

gatcaaattt cggtgatctc tctgcaaaga atttgatgaa ttttaccaac atatatgctt 3780

taatttcttt gcttgatttt atttgcagag gatggatgtg ctgcgtcgcg agctgcggca 3840

cgagcgcggg ttcgtgttcg cgcaggacgt ggcgtacgcc gggttcctgg accgcgtcca 3900

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Claims (2)

1.调控水稻大穗基因OsBP，其特征在于：该基因的核苷酸序列如Seq ID No：1所示。

2.如权利要求1所述的调控水稻大穗基因OsBP在增加水稻的穗长、每穗实粒数、结实率、粒长、粒宽中的用途。

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