CN108004255A

CN108004255A - 水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4的编码序列及其应用

Info

Publication number: CN108004255A
Application number: CN201711149105.3A
Authority: CN
Inventors: 明凤; 毛婵娟; 何建美; 丁佳琳; 吕波; 张彬
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-11-18
Filing date: 2017-11-18
Publication date: 2018-05-08

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的属于细胞分裂素氧化/脱氢酶基因（记为OsCKX4）的编码序列及其应用。具体包括基因OsCKX4的克隆、OsCKX4基因器官表达模式，不同激素、不同胁迫处理后OsCKX4的表达量的变化。本发明还公开了基因OsCKX4的Tilling突变体的测序鉴定，可以影响水稻的根的生长以及产量。该基因OsCKX4可用于植物品种改良。

Description

水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4的编码序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及在水稻中表达的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4的编码序列及其应用。具体包括：细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4基因的核苷酸编码序列的克隆，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及OsCKX4 tilling突变体的检测以及根长和产量分析。

背景技术

细胞分裂素（Cytokinin，CK）是一类含有腺嘌呤环结构且在N⁶位置上的H被其他基团取代的植物激素。它可分为两大类：天然的细胞分裂素和人工合成的细胞分裂素。其中，天然的细胞分裂素包括游离态的细胞分裂素（如玉米素、玉米素核苷、二氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤等）（Kakimoto, 2003）和结合态的细胞分裂素（异戊烯基腺苷、甲硫基异戊烯基腺苷、甲硫基玉米素等）（Letham et al., 1983）。人工合成的细胞分裂素有激动素、6-苄基腺嘌呤和四氢吡喃苄基腺嘌呤等。有的化学物质的结构虽然不具有腺嘌呤结构，但仍有细胞分裂素的生理作用，如二苯脲（Letham and Zhang, 1989; Lichtenthaler 1999）。细胞分裂素主要存在于细胞分裂旺盛的植幼嫩组织中，如根尖茎尖、幼苗、果实及未成熟的种子等。在植物的生长发育过程中，有着十分重要的调节作用。它可促进愈伤组织的细胞增殖和芽的形成等；还可延缓叶片的衰老，促进侧芽的生长，抑制根部细胞延伸，还可以调节其代谢基因以及其它功能基因的表达。

在植物体内的细胞分裂素需要维持在一定的动态平衡，才能保证植株正常的生长发育。细胞分裂素的降解是由细胞分裂素氧化/脱氢酶（Cytokinin oxidase/dehydrogenase, CKX)催化的。首个CKX基因是在玉米中被克隆的，发现它们与玉米粒早期发育的形成过程有关（Massonneau et al., 2004）。拟南芥中有7个CKX基因，35S:AtCKX1转基因拟南芥株系中的根的分生区活性增强（Werner et al., 2003）。在水稻中有11个CKX基因，其中已有功能报道的CKX基因是OsCKX2和OsCKX4。OsCKX2(Gn1a)表达下降时，会导致细胞分裂素累积在花序分生组织中，增加繁殖器官的数目，穗粒数增加，最终可以提高水稻的产量，因此OsCKX2也称每穗实粒数基因（Ashikari et al., 2005）。而当OsCKX4过表达时，会导致水稻冠根的数目增多，根的长度变长；且通过介导生长素和细胞分裂素的信号通路，调节水稻根的发育（Gao et al., 2014）。

细胞分裂素与生长素在愈伤组织中，与植株的根和芽的分裂和分化之间存在着一定的拮抗作用。它在植株根系的胚后发育过程中扮演着重要的作用,包括叶片衰老、顶端优势、叶绿体的发育、花青素的产生和细胞分化等。有研究发现，细胞分裂素可以促进植物根的近端分生组织的细胞分化，会导致细胞分生组织和根生长减少，细胞分裂素可还以负调控水稻的冠根和侧根的起始，但可促进侧根伸长（Rani Debi et al., 2005）。OsMT2b编码一个金属硫蛋白的基因，它的表达会受到外源细胞分裂素的抑制，参与水稻的不定根发育（Yuan et al., 2008）。不定根生长发育关键调控因子OsWOX11能与ERF3互作，通过细胞分裂素信号通路能直接抑制在冠根原基表达的A型细胞分裂素响应因子OsRR2的表达，从而促进冠根的发育（Zhao et al., 2015）。在拟南芥中，A型细胞分裂素响应因子ARR7和ARR15的突变，会导致与根发育相关的基因表达异常，如PLT1和WOX5（Müller and Sheen, 2008）。

根系是一株植物的全部根的总称，它在植物生长发育过程中起着极其重要的作用。根系有吸收水分及养分、固定和支撑植株等功能，是植物激素、有机酸和氨基酸等物质合成与转化的重要场所。水稻属于禾本科单子叶作物，其根系由胚根（种子根）、冠根（不定根）和侧根组成（Coudert et al., 2010）。胚根是在发芽时期形成的第一条根，它是由根顶端分生组织分化形成的。冠根是由茎节处的中柱鞘细胞依次经过垂周分裂和平周分裂而成，从下位节向上位节发根。侧根是冠根分生出的次生根，可以分为大侧根和小侧根。通过对水稻根的径向切面观察，发现包括中柱（韧皮部、木质部和中柱鞘）、内皮层和皮质（通气组织、厚壁组织、外皮层和表皮）组成（Rebouillat et al., 2009）。它的径向结构反映了水稻根系能在有氧和缺氧条件下的生存的能力。

发明内容

本发明的目的在于提出一种新的水稻基因，还提供该水稻基因的蛋白编码序列，并提供该水稻基因的应用。

本发明提供的水稻中表达的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4基因编码序列及其应用，具体包括：细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4基因的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及OsCKX4 tilling突变体的检测以及根长和产量分析。

本发明通过克隆水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，结果显示OsCKX4基因在各个器官中组成型表达。其中在茎中的表达最高，而在根中的表达最低，叶片居中。在不同部位叶片中，在次新叶中的表达最高，而在老叶中的表达最低。盐胁迫下，OsCKX4的表达显著升高，而干旱处理后，OsCKX4的表达显著降低；在KT、 6-BA、IAA、2,4-D和NAA处理后，OsCKX4的表达都出现了而不同程度的升高。cks4 tilling突变体在幼苗期与野生型相比根长明显变短，而在成熟期，OsCKX4 tilling突变体的株高显著变矮，千粒重与结实率与野生型相比都显著降低。

本发明首先提供一种从水稻中克隆出的新的细胞分裂素氧化/脱氢酶基因，记为OsCKX4，为具有特定序列的DNA分子，其中开放阅读框为1590bp，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供编码这种水稻OsCKX4基因的蛋白分子，该序列编码529个氨基酸残基，分子量58.43kDa，等电点为7.8，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明还提供用于调取获得水稻样品中基因OsCKX4的一对核苷酸引物。该引物根据基因OsCKX4设计，使用此对引物对水稻样品cDNA进行PCR扩增可获得长1590bp的基因片段。具体的引物序列为：

Forward Primer：5' ATGCGGGGAGCCATGAAGCCGTCGA 3' （SEQ ID NO.3）

Reverse Primer：5' TCACAAGGACATAGGTAGTGATGCC 3' （SEQ ID NO.4）。

本发明还提供检测水稻基因OsCKX4在不同器官表达模式的方法，即利用所述基因OsCKX4的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列：

Forward Primer：5' TGTCAACCAACTGGAGATTGTG 3'（SEQ ID NO.5）

Reverse Primer：5' GAAGAGATCAGAGTTCACCTCGT 3'（SEQ ID NO.6）。

对水稻cDNA样品进行Real-timePCR, 然后检测该基因在茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA 经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：

（1）提取水稻器官的总RNA（Trizol，市售）；

（2）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA ，根据SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6设计引物，根据SEQ ID NO.1，跨越ORF区和3`UTR的78bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。

本发明还提供检测水稻基因OsCKX4在高盐、干旱胁迫以及激素处理下的表达模式变化的方法，即将水稻进行高盐、干旱胁迫以及激素处理后，提取水稻叶片中的RNA；利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，进行定量PCR检测。其步骤如下：

（1）将两周大的水稻苗置于150mM氯化钠溶液中，28℃培养高盐胁迫处理0、2、4、8、12以及24h；干旱处理0、2、4、8、12以及24h；置于10µM IAA、10µM KT、10µM 2,4-D、10µM NAA、10µM6-BA中，28ºC分别培养0、2、4、8、12以及24h进行激素处理；

（2）提取前述个处理的水稻苗的叶和根中的总RNA（Trizol，市售）；

（3）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA ，根据SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6设计引物，根据SEQ ID NO.1，跨越ORF区和3`UTR的78bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。

本发明还提供检测水稻OsCKX4 tilling突变体与野生型水稻在根长及产量改变的方法，其步骤如下：

（1）突变体株系与野生型的种子浸泡在水中24h，让种子充分吸涨。随后将种子玻璃培养皿内，放在水稻恒温培养箱内37℃催芽至露白，每天换水防止长霉。选取萌发一致的种子，将其转移至种子架上，置于基础营养液中，28℃培养箱培养；

（2）分别提取突变体以及野生型对照组中的总DNA，利用引物进行实时荧光定量PCR检测，确定突变位置以及筛选纯合株系。对应的引物序列为：

Forward Primer：5' CAAACTCGATTGATCCACAGATAG 3'（SEQ ID NO.7）

Reverse Primer：5' GAAGGTCTCAAAGTCCGAGTAGAG 3'（SEQ ID NO.8）；

（3）观察统计每天实验组与对照组的生长情况，并在一周时，观察并测量突变体株系与野生型株系的根长。

本发明还提供了OsCKX4 tilling突变体水稻与野生型水稻在成熟期株高及产量改变的方法，其步骤如下：

（1）突变体株系与野生型的种子浸泡在水中24h，让种子充分吸涨。随后将种子玻璃培养皿内，放在水稻恒温培养箱内37℃催芽至露白，每天换水防止长霉；

（2）将催芽后的种子均匀地散在苗床上，表面不能积水，种子播撒后，用手抹平，让种子陷入泥中，不应太深；

（3）育苗3-4周后，三叶期，根系发达方可移苗。过早会造成根部损伤，后期发育不良。移苗后1-2周可按每颗苗0.5g尿素少量施肥。浇水一般提前将水放在温室内1天温热后再浇；

（4）成熟期测量突变体与野生型水稻的株高，并统计千粒重与结实率。

本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。

可见，本发明提供的水稻基因OsCKX4可用于植物品种改良，如用于改善水稻抗高盐、干旱胁迫、激素胁迫的等性能，从而提高水稻产量。

附图说明

图1为水稻OsCKX4的不同器官表达模式分析。其中，A为水稻根、茎、二叶、三叶、四叶、五叶、六叶的结构图；B为水稻二叶、三叶、四叶、五叶、六叶的代表图；C为各个器官中OsCKX4的表达量。

图2为水稻OsCKX4基因在高盐和干旱处理下的表达分析。其中，A是用150mM NaCl处理0-24h后水稻的OsCKX4基因表达量变化；B是在干燥空气中处理0-24h后水稻的OsCKX4基因表达量变化。

图3为水稻OsCKX4基因在6-BA和KT处理下的表达分析。其中，A是10μM KT处理0-24h后水稻的OsCKX4基因表达量变化；B是10μM 6-BA处理0-24h后水稻的OsCKX4基因表达量变化。

图4为水稻OsCKX4基因在IAA、2,4-D和NAA处理下的表达分析。其中，A是10μM IAA处理0-24h后水稻的OsCKX4基因表达量变化；B是10μM 2,4-D处理0-24h后水稻OsCKX4基因表达量的变化；C是10μM NAA处理0-24h后水稻OsCKX4基因表达量的变化。

图5为OsCKX4的两个突变体c2-1和c12-1与WT的OsCKX4 DNA序列（A，B）与蛋白质序列（C，D）的比对。

图6生长一周OsCKX4 tilling突变体与野生型水稻WT幼苗的根长分析。

图7成熟期OsCKX4 tilling突变体与野生型水稻WT的株高、千粒重与结实率分析。其中，A、B为株高对比照相；C为千粒重统计；D为结实率对比。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989）中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1水稻基因OsCKX4的克隆

1.水稻品种Nipponbare（Oryza sativa Japonica）在培养箱(SPX-250-GB,Shanghai,China) 中培养：生长条件为光周期16h /8h (L/D)，28℃；

2. RNA提取。取100mg左右新鲜的水稻植物组织材料，液氮充分研磨。加1 ml Trizol试剂，涡旋15 s后室温放置5 min。加0.2 ml氯仿，去蛋白，12000rpm离心10min后上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10 min，12k rpm离心10min，弃上清，用DEPC处理过的水配制的75%乙醇1 ml洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5-10 min，溶于20 μlDEPC水中，测OD值，电泳检测；

3. 基因的克隆。以逆转录的水稻cDNA第一链为模板，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行PCR，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID NO.1。

实施例2水稻OsCKX4基因器官表达模式分析

分别提取水稻茎、幼叶、老叶、根等中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行实时荧光定量PCR检测（图1，A，B，C）。结果显示，OsCKX4基因在各个器官中组成型表达。其中在茎中的表达最高，而在根中的表达最低，叶片居中。在不同部位叶片中，在次新叶中的表达最高，而在老叶中的表达最低。

实施例3水稻基因OsCKX4在干旱、高盐胁迫以及植物激素处理下的表达模式分析

对两周大的水稻幼苗分别进行10µM IAA、10µM KT、10µM 2,4-D、10µM NAA、10µM 6-BA、150μM NaCl以及干旱（dry air）处理0、2、4、8、12以及24h，分别提取叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行实时荧光定量PCR检测。结果显示，盐胁迫下（图2A），OsCKX4的表达显著升高；而干旱处理后，OsCKX4的表达显著降低（图2B）。细胞分裂素为代表的KT、 6-BA（图3，A，B）和生长素为代表的IAA、2,4-D和NAA（图4，A，B，C）处理后，OsCKX4的表达都出现了而不同程度的升高。

实施例4 OsCKX4 tilling突变体的分子鉴定

分别提取突变体以及野生型对照组中的总DNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测与测序（图5）。根据OsCKX4的c2-1和c12-1两个突变体分别与WT的CKX4 的DNA序列比对，结果发现：c2-1在761处，G突变成A；c12-1在759处，C突变成T（图5，A，B）。以上均在OsCKX4的编码区发生了突变，为有义突变。OsCKX4的两个突变体c2-1和c12- 1与WT的CKX4蛋白（图5，C，D）比对显示，c2-1中第75处的亮氨酸（L）突变为丝氨酸（S）,c12-1中第76处的蛋氨酸（M）突变成缬氨酸（V）。

实施例5 OsCKX4 tilling突变体水稻根长的改变

28ºC培养一周大的OsCKX4 tilling突变体与野生型WT对照组进行根长测量（图6）。结果显示，OsCKX4 tilling突变体与野生型WT相比，其根长显著变短。

实施例6 OsCKX4 tilling突变体水稻株高、千粒重与结实率的改变

对成熟期OsCKX4 tilling突变体与野生型WT对照组进行株高测量（图7，A）。结果显示，OsCKX4 tilling突变体与野生型WT相比，其株高表型明显变矮（图7，B）。对成熟期OsCKX4 tilling突变体与野生型WT对照组进行千粒重（图7，C）与结实率的统计（图7，D）。结果显示，OsCKX4 tilling突变体与野生型WT相比，千粒重与结实率显著降低。

参考文献

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序列表

<110> 复旦大学

<120> 水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX4的编码序列及其应用

<130> 001

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1590

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atgcggggag ccatgaagcc gtcgatcgtg cactgcctca agctgctcat gctgctggcg 60

ctcggcgggg tcaccatgca cgtccccgac gaggacgacg tggtcgcgtc gctcggggcg 120

ctgcgcctcg acggccattt cagcttcgac gacgcccacg ccgccgcccg ggacttcggc 180

aaccggtgca gcctcctgcc ggcggccgtg ctccaccctg gctcggtgtc cgacgtcgcc 240

gccaccgtca ggcgcgtgtt ccagctgggc aggagctcgc cgctcaccgt cgcggcgcgc 300

gggcacggcc actcgctcct cggccagtcc caggccgccg gcgggatcgt cgtcaagatg 360

gagtccctcg ccgccgccgc agccagggcg gtgcgggtgc acggcggcgc gtcgccccac 420

gtggacgccc cgggcggcga gctctggatc aacgtgctgc atgagacgct caagcacggg 480

ctggcgccca ggtcatggac cgactacctc catctcacag tcggtggcac cttgtcgaat 540

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gagattgtga cagggagggg agaagttgtc acctgctcgc acgaggtgaa ctctgatctc 660

ttctacgctg ctcttggcgg cctgggccag tttgggatca tcaccagggc tcggattgct 720

cttgaacctg ctccaaagat ggtgcggtgg atacgtgttc tctactcgga ctttgagacc 780

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gacccagtgc aggcaagcca gttccagtcg gatggaagag tgctatactg ccttgagctg 960

acgatgaact tcaaccacga tgaggctgac atcatggaac aggaagttgg tgcgctgcta 1020

tctcgactca gatacatatc gtccactcta ttctacaccg atgtcacata cctggagttc 1080

ttggacaggg tgcacacttc tgagctgaag ctgagggctc aaggcctctg ggaagtccca 1140

cacccgtggc tgaatcttct gatcccaagg agcacagtcc acaaatttgc aaaggaagtc 1200

ttcggcaaga tcctaaaaga tagcaacaat ggtcccatac tgctttaccc agtgaacaga 1260

accaagtggg acaacagaac atcagtggtc ataccagatg aagaaatttt ctacctggtt 1320

gggttcctat cttcagcacc atcatcctca ggtcatggta gtgtcgaaca tgcaatgaac 1380

ctgaacaaca aaatagtgga cttctgtgaa aagaatggtg ttgggatgaa acagtatcta 1440

gcaccctaca ctacacagaa gcagtggaaa gcccacttcg gagcaaggtg ggagacattt 1500

gaacggagga aacacacgta cgatccccta gcaatcctag ctccagggca gagaatattt 1560

ccaaaggcat cactacctat gtccttgtga 1590

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Arg Gly Ala Met Lys Pro Ser Ile Val His Cys Leu Lys Leu Leu

1 5 10 15

Met Leu Leu Ala Leu Gly Gly Val Thr Met His Val Pro Asp Glu Asp

20 25 30

Asp Val Val Ala Ser Leu Gly Ala Leu Arg Leu Asp Gly His Phe Ser

35 40 45

Phe Asp Asp Ala His Ala Ala Ala Arg Asp Phe Gly Asn Arg Cys Ser

50 55 60

Leu Leu Pro Ala Ala Val Leu His Pro Gly Ser Val Ser Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Thr Val Arg Arg Val Phe Gln Leu Gly Arg Ser Ser Pro Leu Thr

85 90 95

Val Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Leu Leu Gly Gln Ser Gln Ala

100 105 110

Ala Gly Gly Ile Val Val Lys Met Glu Ser Leu Ala Ala Ala Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Val Arg Val His Gly Gly Ala Ser Pro His Val Asp Ala Pro

130 135 140

Gly Gly Glu Leu Trp Ile Asn Val Leu His Glu Thr Leu Lys His Gly

145 150 155 160

Leu Ala Pro Arg Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly Gly

165 170 175

Thr Leu Ser Asn Ala Gly Val Ser Gly Gln Ala Phe Arg His Gly Pro

180 185 190

Gln Val Ser Asn Val Asn Gln Leu Glu Ile Val Thr Gly Arg Gly Glu

195 200 205

Val Val Thr Cys Ser His Glu Val Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala

210 215 220

Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ala

225 230 235 240

Leu Glu Pro Ala Pro Lys Met Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser

245 250 255

Asp Phe Glu Thr Phe Thr Glu Asp Gln Glu Lys Leu Ile Ala Ser Glu

260 265 270

Lys Thr Phe Asp Tyr Ile Glu Gly Phe Val Ile Ile Asn Arg Thr Gly

275 280 285

Ile Leu Asn Asn Trp Arg Thr Ser Phe Lys Pro Gln Asp Pro Val Gln

290 295 300

Ala Ser Gln Phe Gln Ser Asp Gly Arg Val Leu Tyr Cys Leu Glu Leu

305 310 315 320

Thr Met Asn Phe Asn His Asp Glu Ala Asp Ile Met Glu Gln Glu Val

325 330 335

Gly Ala Leu Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Ile Ser Ser Thr Leu Phe Tyr

340 345 350

Thr Asp Val Thr Tyr Leu Glu Phe Leu Asp Arg Val His Thr Ser Glu

355 360 365

Leu Lys Leu Arg Ala Gln Gly Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu

370 375 380

Asn Leu Leu Ile Pro Arg Ser Thr Val His Lys Phe Ala Lys Glu Val

385 390 395 400

Phe Gly Lys Ile Leu Lys Asp Ser Asn Asn Gly Pro Ile Leu Leu Tyr

405 410 415

Pro Val Asn Arg Thr Lys Trp Asp Asn Arg Thr Ser Val Val Ile Pro

420 425 430

Asp Glu Glu Ile Phe Tyr Leu Val Gly Phe Leu Ser Ser Ala Pro Ser

435 440 445

Ser Ser Gly His Gly Ser Val Glu His Ala Met Asn Leu Asn Asn Lys

450 455 460

Ile Val Asp Phe Cys Glu Lys Asn Gly Val Gly Met Lys Gln Tyr Leu

465 470 475 480

Ala Pro Tyr Thr Thr Gln Lys Gln Trp Lys Ala His Phe Gly Ala Arg

485 490 495

Trp Glu Thr Phe Glu Arg Arg Lys His Thr Tyr Asp Pro Leu Ala Ile

500 505 510

Leu Ala Pro Gly Gln Arg Ile Phe Pro Lys Ala Ser Leu Pro Met Ser

515 520 525

Leu

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

atgcggggag ccatgaagcc gtcga 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 4

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<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Oryza sativa

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<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 7

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<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 8

gaaggtctca aagtccgagt agag 24

Claims

1. 一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的基因，记为OsCKX4，全长2842bp，其中开放阅读框为1590bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2. 一种如权利要求1所述的基因OsCKX4编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码529个氨基酸残基，分子量58.43kDa，等电点为7.8，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3. 一对用于调取获得水稻样品中基因OsCKX4的引物序列，其特征在于，根据权利要求1所述基因OsCKX4设计，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4. 一种检测水稻基因OsCKX4 mRNA表达模式的方法，其特征在于，利用权利要求1所述基因OsCKX4的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列见SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6，对水稻cDNA样品进行Real-time PCR，然后检测该基因在茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA 经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：提取水稻不同器官的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行定量PCR检测。

5. 一种检测水稻在干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后，基因OsCKX4表达含量变化的方法，其特征在于，具体步骤为：将水稻进行低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后，提取水稻的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ，利用引物SEQ ID NO.5和SEQID NO.6，进行定量PCR检测。

6. 一种检测水稻OsCKX4 tilling突变体的方法，其特征在于，具体步骤为：提取OsCKX4 tilling突变体和野生型对照组水稻的总DNA；利用引物SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8，进行PCR检测。

7.如权利要求1所述的水稻基因OsCKX4在植物品种改良中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，所述的植物品种改良包括改善水稻抗高盐、干旱胁迫、激素胁迫的性能。