CN114561484B - 一种扩增水稻产量相关基因位点的多重pcr引物组合及其试剂盒 - Google Patents

一种扩增水稻产量相关基因位点的多重pcr引物组合及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种扩增水稻产量相关基因位点的多重PCR引物组合、以及采用该多重PCR引物组合的水稻产量相关基因位点的扩增体系和试剂盒，以及采用该扩增体系获取水稻产量相关基因位点的序列的方法和水稻产量相关基因位点的检测方法；采用本发明的多重PCR引物组合及其扩增体系，能够从水稻基因组上通过单管操作一次性捕获多个水稻产量相关基因位点的序列片段，直接构建测序文库并匹配现有的测序平台；特别是对于水稻育种工作者来说，能够快速、方便且低成本地获取多个水稻产量相关基因信息，便于后续能够更快更准确地设计或验证育种路线，极大地提高了育种的效率。

Description

一种扩增水稻产量相关基因位点的多重PCR引物组合及其试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种扩增水稻产量相关基因位点的多重PCR引物组合、以及采用该多重PCR引物组合的水稻产量相关基因位点的扩增体系和试剂盒，以及采用该扩增体系获取水稻产量相关基因位点的序列的方法和水稻产量相关基因位点的检测方法，属于水稻分子生物学技术领域。
背景技术
粮食是人类生存的根本需求，也是社会发展和国家稳定的基石。改革开放以来，我国粮食在产量和质量以及产品多样性等诸多方面取得了长足的进步，全国粮食连续多年增产。然而，随着人口的增加和人们生活水平的提高，我国对粮食产量和质量都提出了更高的要求。此外，全球气候变化对农业生产的威胁频率增加，粮食安全问题仍不容忽视。
世界生物育种技术发展已经历了三个主要阶段：原始驯化选育(1.0时代)、常规育种(2.0时代)和分子育种(3.0时代)。近些年，分子生物学、计算生物学和基因组学等学科的理论进展催生了新型生物技术(如新一代测序、基因组编辑、单倍体制种等)，全面改写了作物育种的理论与策略，分子辅助育种研究取得了前所未有的飞跃，育种技术进入了分子设计育种或智能化育种4.0时代。
目前关于分子设计育种的研究策略主要包括以下内容：可以通过高通量测序的方式进行基因组de novo和重测序，获得该物种的参考基因组，一次性鉴定物种全部基因组资源，充分挖掘该物种的所有变异信息(SNP、InDel、CNV、SV等)，为后续位点筛选工作的展开奠定基础；可以利用测序获得的SNP位点定制高通量或中通量的SNP检测芯片，通过QTL定位、GWAS、选择性清除等策略找到目标性状相关的SNP位点，实现分子标记的筛选和性状定位；还可以采用低密度候选SNP位点定制的方式，进一步对大规模样本进行基因分型，满足常规应用的分子标记辅助育种需求。
水稻的产量育种，一直是水稻育种工作的重中之重。鉴于水稻产量是由多因素决定的复杂性状，这其中涉及到大量的与产量相关的基因位点；并且受环境影响，产量相关基因序列存在广泛的自然变异。虽然不少产量相关的基因位点通过图位克隆和突变体筛选的方法得到克隆和解析，但本领域技术人员在使用上述的分子生物学技术进行分子辅助育种或分子设计育种时，无法一次性捕获多个产量相关的基因位点序列，需要多次检测，周期长，成本高，操作极为繁琐复杂。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种用于扩增水稻产量相关基因位点的多重PCR引物组合，其中，
所述多重PCR引物组合包括第1～18引物对；
所述第1～18引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:3、SEQ IDNo:5、SEQ ID No:7、SEQ ID No:9、SEQ ID No:11、SEQ ID No:13、SEQ ID No:15、SEQ IDNo:17、SEQ ID No:19、SEQ ID No:21、SEQ ID No:23、SEQ ID No:25、SEQ ID No:27、SEQ IDNo:29、SEQ ID No:31、SEQ ID No:33、SEQ ID No:35所示；
所述第1～18引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:2、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:6、SEQ ID No:8、SEQ ID No:10、SEQ ID No:12、SEQ ID No:14、SEQ ID No:16、SEQ IDNo:18、SEQ ID No:20、SEQ ID No:22、SEQ ID No:24、SEQ ID No:26、SEQ ID No:28、SEQ IDNo:30、SEQ ID No:32、SEQ ID No:34、SEQ ID No:36所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述多重PCR引物组合还包括第19～38引物对；
所述第19～38引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:37、SEQ ID No:39、SEQID No:41、SEQ ID No:43、SEQ ID No:45、SEQ ID No:47、SEQ ID No:49、SEQ ID No:51、SEQID No:53、SEQ ID No:55、SEQ ID No:57、SEQ ID No:59、SEQ ID No:61、SEQ ID No:63、SEQID No:65、SEQ ID No:67、SEQ ID No:69、SEQ ID No:71、SEQ ID No:73、SEQ ID No:75所示；
所述第19～39引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:38、SEQ ID No:40、SEQID No:42、SEQ ID No:44、SEQ ID No:46、SEQ ID No:48、SEQ ID No:50、SEQ ID No:52、SEQID No:54、SEQ ID No:56、SEQ ID No:58、SEQ ID No:60、SEQ ID No:62、SEQ ID No:64、SEQID No:66、SEQ ID No:68、SEQ ID No:70、SEQ ID No:72、SEQ ID No:74、SEQ ID No:76所示。
更优选的，所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池；所述第19～26引物对与所述第27～38引物对位于两个不同的引物池。
在本发明的一个进一步优选实施方案中，所述多重PCR引物组合还包括第39～55引物对；
所述第39～55引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:77、SEQ ID No:79、SEQID No:81、SEQ ID No:83、SEQ ID No:85、SEQ ID No:87、SEQ ID No:89、SEQ ID No:91、SEQID No:93、SEQ ID No:95、SEQ ID No:97、SEQ ID No:99、SEQ ID No:101、SEQ ID No:103、SEQ ID No:105、SEQ ID No:107、SEQ ID No:109所示；
所述第39～55引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:78、SEQ ID No:80、SEQID No:82、SEQ ID No:84、SEQ ID No:86、SEQ ID No:88、SEQ ID No:90、SEQ ID No:92、SEQID No:94、SEQ ID No:96、SEQ ID No:98、SEQ ID No:100、SEQ ID No:102、SEQ ID No:104、SEQ ID No:106、SEQ ID No:108、SEQ ID No:110所示。
更优选的，所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池；所述第19～26引物对与所述第27～38引物对位于两个不同的引物池；所述第39～48引物对与所述第49～55引物对位于两个不同的引物池。
在本发明的一个更进一步优选实施方案中，所述多重PCR引物组合还包括第56～64引物对；
所述第56～64引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:111、SEQ ID No:113、SEQID No:115、SEQ ID No:117、SEQ ID No:119所示、SEQ ID No:121、SEQ ID No:123、SEQ IDNo:125、SEQ ID No:127所示；
所述第56～64引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:112、SEQ ID No:114、SEQID No:116、SEQ ID No:118、SEQ ID No:120所示、SEQ ID No:122、SEQ ID No:124、SEQ IDNo:126、SEQ ID No:128所示。
更优选的，所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池；所述第19～26引物对与所述第27～38引物对位于两个不同的引物池；所述第39～48引物对与所述第49～55引物对位于两个不同的引物池；所述第56～60引物对与所述第61～64引物对位于两个不同的引物池。
更优选的，所述多重PCR引物组合包括第一引物池和第二引物池；所述第1～6引物对、第19～26引物对、第39～48引物对和第56～60引物对位于所述第一引物池；所述第7～18引物对、第27～38引物对、第49～55引物对和第61～64引物对位于所述第二引物池。
本发明第二方面提供了一种水稻产量相关基因位点的扩增体系，其中，所述扩增体系包括用于扩增的缓冲体系和如上述的多重PCR引物组合。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，其中，所述试剂盒所采用的引物为上述的多重PCR引物组合。
本发明第四方面提供了一种获取水稻产量相关基因位点的序列的方法，其中，所述方法包括以下依次进行的步骤：
步骤1)提取水稻基因组DNA；
步骤2)采用如上述的扩增体系对所述步骤1)所获得的水稻基因组DNA进行PCR扩增，并对获得的扩增产物进行纯化，得到水稻产量相关基因位点的序列片段的混合物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述水稻基因组DNA是从水稻种子或水稻叶片中提取的。
本发明第五方面提供了一种水稻产量相关基因位点的检测方法，其中，所述检测方法包括采用如上述的方法获得水稻产量相关基因位点的序列片段的混合物，并以该混合物作为样本构建测序文库，并进行测序分析。
可以理解的，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例中)具体描述的各项技术特征之间可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不一一赘述。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，整合分析了目前已公开的水稻品种的产量相关基因信息以及突变信息，设计并通过大量实验验证，获得了覆盖水稻基因组全序列的多个产量相关基因位点的叠瓦式、多重PCR引物组合。这些PCR引物组合不仅能够从水稻基因组上通过单管操作一次性捕获多个水稻产量相关基因位点，并有效避免位点之间的相互干扰，提高准确性，且降低了交叉污染的风险；此外，这些引物之间基本没有相互作用，避免了引物二聚体的形成，减少了非特异性的扩增；因此，采用本申请的多重PCR引物组合及其扩增体系，大大削减了现有技术的繁琐操作，降低了成本、提高了扩增效率，更重要的是，能够直接构建测序文库并匹配现有的测序平台(例如目前主流的二代测序平台)。对于水稻育种工作者来说，能够快速、方便且低成本地获取多个水稻产量相关基因信息，便于后续能够更快更准确地设计或验证育种路线，极大地提高了育种的效率。
以下将结合具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到(例如，常规生化试剂商店购买得到的)。
1.用于扩增水稻产量相关基因位点的多重PCR引物组合
本申请的发明人整合分析了目前已公开的水稻品种的产量相关基因信息以及突变信息(约20万篇文献，几乎是所有已公开信息)；并针对这些基因位点及其突变信息设计了大量的叠瓦式、多重PCR引物组合。一方面为保证这些引物组合能够覆盖水稻基因组的多个产量相关基因位点，另一方面排除位点之间的、引物之间的相互干扰，发明人对这些候选引物对进行了大量实验验证，最终获得了能够一次性捕获多个水稻产量相关基因位点的多重PCR引物组合，具体如下表1所示。
表1
Figure GDA0003611952460000051
Figure GDA0003611952460000061
Figure GDA0003611952460000071
Figure GDA0003611952460000081
Figure GDA0003611952460000091
Figure GDA0003611952460000101
在本发明的一个具体实施方案中，多重PCR引物组合包括上表1中的第1～18引物对。优选的，第1～6引物对与第7～18引物对位于两个不同的引物池。在具体实施例中，第一轮多重PCR反应分两个反应管，其中一管中加入第1～6引物对的组合，作为第一引物池；另一管中加入第7～18引物对的组合，作为为第二引物池；完成第一轮多重PCR反应后，再将两管的PCR产物合并。
在本发明的另一个具体实施方案中，多重PCR引物组合包括上表1中的第1～38引物对。优选的，所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池；所述第19～26引物对与所述第27～38引物对位于两个不同的引物池；具体来说，这四组引物对在满足这些条件的基础上，可以任意组合形成一个引物池，或者一组独立作为一个引物池。例如，在具体实施例中，第一轮多重PCR反应分为两个反应管，其中一管中加入第1～6引物对和第19～26引物对的组合，作为第一引物池；另一管中加入第7～18引物对和第27～38引物对的组合，作为第二引物池；完成第一轮多重PCR反应后，再将两管的PCR产物合并。当然，在替代实施例中，也可以是第1～6引物对与第27～38引物对组合作为一个引物池，第7～18引物对与第19～26引物对组合作为另一个引物池；也可以是一组独立作为一个引物池的方式。
在本发明的另一个具体实施方案中，多重PCR引物组合包括上表1中的第1～55引物对。优选的，所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池；所述第19～26引物对与所述第27～38引物对位于两个不同的引物池；所述第39～48引物对与所述第49～55引物对位于两个不同的引物池；具体来说，这六组引物对在满足这些条件的基础上，可以任意组合形成一个引物池，或者一组独立作为一个引物池。在具体实施例中，第一轮多重PCR反应分为两个反应管，其中一管中加入第1～6引物对、第19～26引物对和第39～48引物对的组合，作为第一引物池；另一管中加入第7～18引物对、第27～38引物对和第49～55引物对的组合，作为第二引物池；完成第一轮多重PCR反应后，再将两管的PCR产物合并。当然，在替代实施例中，也可以采用其他的组合或是一组独立作为一个引物池的方式。
在本发明的另一个具体实施方案中，多重PCR引物组合包括上表1中的第1～64引物对。优选的，所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池；所述第19～26引物对与所述第27～38引物对位于两个不同的引物池；所述第39～48引物对与所述第49～55引物对位于两个不同的引物池；所述第56～60引物对与所述第61～64引物对位于两个不同的引物池；具体来说，这八组引物对在满足这些条件的基础上，可以任意组合形成一个引物池，或者一组独立作为一个引物池。在具体实施例中，第一轮多重PCR反应分为两个反应管，其中一管中加入第1～6引物对、第19～26引物对、第39～48引物对和第56～60引物对的组合，作为第一引物池；另一管中加入第7～18引物对、第27～38引物对、第49～55引物对和第61～64引物对的组合，作为第二引物池；完成第一轮多重PCR反应后，再将两管的PCR产物合并。当然，在替代实施例中，也可以采用其他的组合或是一组独立作为一个引物池的方式。
2.获取水稻产量相关基因位点的测序片段
在本发明的一个具体实施方案中，获取水稻产量相关基因位点的序列的方法，包括以下依次进行的步骤：
步骤1)提取水稻基因组DNA；
步骤2)对所述步骤1)所获得的水稻基因组DNA进行PCR扩增，并对获得的扩增产物进行纯化，得到水稻产量相关基因位点的序列片段的混合物。
步骤1)中，提取水稻基因组DNA的具体方法，可以采用现有技术中市售的全基因组DNA提取试剂盒及其提取方法，或者其他已公开的提取试剂及方法。
步骤1)中，水稻样本可采用种子、幼苗、叶片、穗子等组织或器官，优选水稻种子或水稻叶片。
具体在本实施例中，取水稻样品的种子(购自安徽荃银高科种业股份有限公司)约200mg～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨后移入2.0mL离心管；每管加入700μL经65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30min，期间轻微颠倒混匀；之后每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24：1)混合液，充分混合后静置10min，在12000rpm离心10min；吸取上清液转移至新的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min后在4℃、12000rpm离心10min。弃上清液，加入70％乙醇，洗涤2遍，获得水稻的全基因组DNA，自然条件下干燥，加入100μL水，充分溶解后供备用。
具体在本实施例中，步骤2)中，第1轮多重PCR反应分为2个反应管，其中一个反应管中加入第1～6引物对、第19～26引物对、第39～48引物对和第56～60引物对的组合，作为第一引物池(primer pool T1)，另一个反应管中加入第7～18引物对、第27～38引物对、第49～55引物对和第61～64引物对的组合，作为第二引物池(primerpool T2)；两个反应管中其他试剂相同，采用高保真Tag酶扩增体系(购自Thermo Fisher公司DreamTaq PCR MasterMix试剂盒)。
每个反应管中加入40ng上述步骤1)提取的水稻gDNA，聚合酶混合物10微升，第一/第二引物池5微升，增强缓冲液M(Enhance buffer M)2.5微升，增强缓冲液NB(EnhancebufferNB 1N)3.5微升，加入ddH2O补足至30微升。
第1轮多重PCR反应结束后，取第一引物池的反应管中PCR产物16微升，第二引物池的反应管中PCR产物14微升，合并成一管30微升(第1轮多重PCR反应的产物)。
第1轮多重PCR反应条件如下：
盖子加热至105℃；
95℃预热3min30s；
98℃退火20s，60℃延长4min，重复18个循环；
72℃保持5min。
最后对第1轮多重PCR反应所得到的产物(大小不同的水稻产量相关基因片段)进行纯化；例如，磁珠纯化，本实施例采用购自Beckman公司的AgencourtAMPure XP Kit纯化试剂盒，具体操作参见说明书，具体不再赘述。
3、测序(水稻产量相关基因位点的检测方法)
将上述第2部分获得的水稻产量相关基因位点的测序片段(第一轮多重PCR反应产物)的纯化后的混合物，构建测序文库，并进行测序分析。
在本申请的一个具体实施方案中，构建二代测序文库，上二代测序平台(例如，Roche/454FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer、Applied Biosystems SOLID system)进行测序。
具体在本实施例中，选取定量在10ng/μl的样本DNA，进行片段化处理，消化引物并进行磷酸化，随后根据所选择的测序平台进行接头序列PCR反应，对产物进行磁珠纯化后获得构建的二代测序文库，qPCR测文库浓度，质检后，上二代测序平台进行测序。
4.效果数据
本申请发明人选取了6种不同品种的水稻种子进行了上述第1-3部分的操作，捕获水稻产量相关基因位点的序列，并进行测序，以及水稻基因组分析软件分析；例如对于测序获得的原始数据采用Torrent Suite进行分析，主要包括信号处理、碱基召唤、PCR多克隆的剔除、测序质量评分、比对到对应水稻品种的全基因组参考序列等，再采用CoverageAnalysis插件分析测序深度及覆盖度等，分析结果参见下表1。
表1
Figure GDA0003611952460000131
Figure GDA0003611952460000141
附注：上表1中，参考1和参考2采用“日本晴”水稻种子DNA与动物DNA的混合物，作为抗干扰测试的参考样本；参考2的DNA样本的起始量为10ng，作为低浓度对照。
从上表1的结果可以看出，常规的6种不同品种的水稻种子的测序结果对于目标基因位点的捕获效率都达到了98％以上，覆盖度达到97％以上，所有目标基因位点的测序深度都达了1000倍以上。这说明，采用本发明的多重PCR引物组合能够从水稻基因组通过单管操作一次性捕获多个水稻产量相关基因位点，并有效避免位点之间的相互干扰。
此外，采用本申请的扩增体系大大削减了现有技术的繁琐操作，降低了成本、提高了效率；具体来说，采用本申请具体实施方式第1-3部分的方法，获取测序片段、构建文库以及二代测序，整个过程制需要约3.5小时(相比现有技术的方法，从核酸到文库一般要20小时以上)，极大地提高了扩增和测序的操作效率；对于水稻育种工作者来说，能够快速、方便且低成本地获取多个水稻产量相关基因信息，便于后续能够更快更准确地设计或验证育种路线，提高了育种的效率。
应当理解，上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (9)

1.一种用于扩增水稻产量相关基因位点的多重PCR引物组合，其特征在于，
所述多重PCR引物组合包括第1～18引物对；
所述第1～18引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:3、SEQ ID No:5、SEQ ID No:7、SEQ ID No:9、SEQ ID No:11、SEQ ID No:13、SEQ ID No:15、SEQ ID No:17、SEQ ID No:19、SEQ ID No:21、SEQ ID No:23、SEQ ID No:25、SEQ ID No:27、SEQ ID No:29、SEQ ID No:31、SEQ ID No:33、SEQ ID No:35所示；
所述第1～18引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:2、SEQ ID No:4、SEQ ID No:6、SEQ ID No:8、SEQ ID No:10、SEQ ID No:12、SEQ ID No:14、SEQ ID No:16、SEQ ID No:18、SEQ ID No:20、SEQ ID No:22、SEQ ID No:24、SEQ ID No:26、SEQ ID No:28、SEQ ID No:30、SEQ ID No:32、SEQ ID No:34、SEQ ID No:36所示；
所述第1～6引物对与所述第7～18引物对位于两个不同的引物池。
2.如权利要求1所述的多重PCR引物组合，其特征在于：
所述多重PCR引物组合还包括第19～38引物对；
所述第19～38引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:37、SEQ ID No:39、SEQ IDNo:41、SEQ ID No:43、SEQ ID No:45、SEQ ID No:47、SEQ ID No:49、SEQ ID No:51、SEQ IDNo:53、SEQ ID No:55、SEQ ID No:57、SEQ ID No:59、SEQ ID No:61、SEQ ID No:63、SEQ IDNo:65、SEQ ID No:67、SEQ ID No:69、SEQ ID No:71、SEQ ID No:73、SEQ ID No:75所示；
所述第19～38引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:38、SEQ ID No:40、SEQ IDNo:42、SEQ ID No:44、SEQ ID No:46、SEQ ID No:48、SEQ ID No:50、SEQ ID No:52、SEQ IDNo:54、SEQ ID No:56、SEQ ID No:58、SEQ ID No:60、SEQ ID No:62、SEQ ID No:64、SEQ IDNo:66、SEQ ID No:68、SEQ ID No:70、SEQ ID No:72、SEQ ID No:74、SEQ ID No:76所示；
所述第19～26引物对与所述第27～38引物对位于两个不同的引物池。
3.如权利要求2所述的多重PCR引物组合，其特征在于：
所述多重PCR引物组合还包括第39～55引物对；
所述第39～55引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:77、SEQ ID No:79、SEQ IDNo:81、SEQ ID No:83、SEQ ID No:85、SEQ ID No:87、SEQ ID No:89、SEQ ID No:91、SEQ IDNo:93、SEQ ID No:95、SEQ ID No:97、SEQ ID No:99、SEQ ID No:101、SEQ ID No:103、SEQID No:105、SEQ ID No:107、SEQ ID No:109所示；
所述第39～55引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:78、SEQ ID No:80、SEQ IDNo:82、SEQ ID No:84、SEQ ID No:86、SEQ ID No:88、SEQ ID No:90、SEQ ID No:92、SEQ IDNo:94、SEQ ID No:96、SEQ ID No:98、SEQ ID No:100、SEQ ID No:102、SEQ ID No:104、SEQID No:106、SEQ ID No:108、SEQ ID No:110所示；
所述第39～48引物对与所述第49～55引物对位于两个不同的引物池。
4.如权利要求3所述的多重PCR引物组合，其特征在于：
所述多重PCR引物组合还包括第56～64引物对；
所述第56～64引物对的上游引物序列分别如SEQ ID No:111、SEQ ID No:113、SEQ IDNo:115、SEQ ID No:117、SEQ ID No:119所示、SEQ ID No:121、SEQ ID No:123、SEQ ID No:125、SEQ ID No:127所示；
所述第56～64引物对的下游引物序列分别如SEQ ID No:112、SEQ ID No:114、SEQ IDNo:116、SEQ ID No:118、SEQ ID No:120所示、SEQ ID No:122、SEQ ID No:124、SEQ ID No:126、SEQ ID No:128所示；
所述第56～60引物对与所述第61～64引物对位于两个不同的引物池。
5.如权利要求4所述的多重PCR引物组合，其特征在于：
所述多重PCR引物组合包括第一引物池和第二引物池；
所述第1～6引物对、第19～26引物对、第39～48引物对和第56～60引物对位于所述第一引物池；所述第7～18引物对、第27～38引物对、第49～55引物对和第61～64引物对位于所述第二引物池。
6.一种水稻产量相关基因位点的扩增体系，其特征在于：
所述扩增体系包括用于扩增的缓冲体系和如权利要求1至5中任意一项所述的多重PCR引物组合。
7.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒所采用的引物为如权利要求1至5中任意一项所述的多重PCR引物组合。
8.一种获取水稻产量相关基因位点的序列的方法，其特征在于，所述方法包括以下依次进行的步骤：
步骤1)提取水稻基因组DNA；
步骤2)采用如权利要求6所述的扩增体系对所述步骤1)所获得的水稻基因组DNA进行PCR扩增，并对获得的扩增产物进行纯化，得到水稻产量相关基因位点的序列片段的混合物。
9.一种水稻产量相关基因位点的检测方法，其特征在于：
所述检测方法包括采用如权利要求8所述的方法获得水稻产量相关基因位点的序列片段的混合物，并以该混合物作为样本构建测序文库，并进行测序分析。
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