CN112695133A - 利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮相关联分子标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子标记技术领域，公开了一种利用BSA‑seq筛选与梨果实褐皮性状相关联分子标记的方法，包括：获得‘新高’和‘砀山酥’杂交组合的F1代群体；基因组DNA的提取纯化及混池构建；BSA‑seq分析；SSR分子标记的鉴定。本发明通过BSA‑seq技术，筛选与梨果实褐皮性状相关的分子标记，利用所获得的分子标记，有利于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析果实褐皮性状形成的分子机制打下基础，为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供重要的理论依据。

Description

利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮相关联分子标记方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及一种利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关联的分子标记方法。
背景技术
梨是世界主要的果树之一，具有较高的经济价值。我国梨的栽培面积及产量均居世界首位。然而，目前我国还没有选育出在世界上具有优势竞争力的梨新品种。提高梨品质已成为中国梨生产面临的一个十分突出的问题。梨的外观品质是影响其商品性的重要因素，其中，果皮色泽为重要的外观评价指标之一。研究发现，梨的褐色果皮可以保护果实免受疾病、昆虫及恶劣天气等的影响。解析梨褐色果皮的形成机制，改良果皮的色泽是梨育种工作中的重要方面。目前，关于梨果实褐皮的形成及分子调控机制还不清楚，且常规的梨育种存在效率低、周期长等问题。
在梨杂交后代中，果实的着色程度和质量均受亲本的影响。目前有关梨果实褐皮的遗传机理研究仍处于探索阶段。
分子标记是一类以分子水平上DNA序列的差异为基础的遗传标记，它直接反映了DNA水平上的遗传多样性。目前，已经有几十多种分子标记被发展利用。随着分子生物学的迅速发展，DNA分子标记技术已广泛应用于亲缘关系和遗传多样性分析，并取得很好的成绩。此外，SSR标记技术以其独特的优势也逐渐应用于果树品种鉴定方面的研究。王晶等鉴定了3个从未报道的甜樱桃品种的S基因型，验证了一种可以有效获得多态性SSR的途径，提供了9个新的多态性SSR及其等位基因大小，用12个分子标记构建了48个甜樱桃品种指纹图谱。近年来，随着基因组测序技术的飞速发展，第二代测序(短片段)数据和第三代测序(长片段)数据的综合应用，大大提升了基因组组装的完整度和准确性，为开展生物学研究提供了便利。梨基因组的揭秘为梨后基因组学的研究提供了基础。高通量测序技术能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，对揭秘目的基因的形成机理发挥了重要的作用。BSA-seq技术，结合了高通量测序技术和分离群体分组分析法来进行基因定位，能够快速建立基因型与表型之间的高分辨率关系。目前，该技术己经广泛应用到农艺性状的基因定位研究当中。豆峻岭采用BSA-seq技术对控制西瓜果皮黄色的候选位点进行初定位，之后开发大量的分子标记，通过一系列分子生物学实验最终将候选基因定位到4号染色体上。目前，利用BSA-seq技术对于梨果实褐皮性状方面的研究较少。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)目前关于梨果实褐皮的形成及分子调控机制还不清楚，且常规的梨育种存在效率低、周期长等问题。
(2)目前利用BSA-seq技术对于梨果实褐皮性状方面的研究较少。
解决以上问题及缺陷的难度为：实验材料的获得有季节性限制，且对于材料的筛选需要以果实颜色为判断。梨的基因组尚未得到完善，需要建库之后才能筛选得到SSR标记，所需实验时间较长。
解决以上问题及缺陷的意义为：利用获得的分子标记，有利于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析果实褐皮性状形成的分子机制打下基础，为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供重要的理论依据。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关联的分子标记方法。
本发明是这样实现的，一种利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关的分子标记方法，所述筛选分子标记方法包括以下步骤：
步骤一，获得‘新高’和‘砀山酥’杂交组合的F1代群体。
步骤二，基因组DNA的提取纯化及混池的构建：根据杂交后代果实褐皮性状的调查结果，选取褐皮和非褐皮植株，提取基因组DNA，并按照DNA等量原则构建褐皮/非褐皮表型的对比基因池：B1(褐皮)和B2(非褐皮)。
步骤三，BSA-seq分析：对两个亲本及子代混池B1、B2样本进行BSA-seq，比对参考基因组，检测与梨果实褐皮性状显著相关的scaffolds。
步骤四，SSR分子标记的鉴定：利用SSRIT在线分析软件进行SSR搜索，利用琼脂糖凝胶电泳方法在分离群体上进行验证，筛选与褐皮性状相关的SSR分子标记。
进一步，步骤二中，所述基因组DNA的提取方法，包括：
(1)取腋芽或幼嫩的叶片0.1g，装入样品袋中，做好标记并放到-80℃的超低温冰箱内保存，以备DNA提取之用；
(2)将内含2％CTAB的提取缓冲液CTAB buffer事先在65℃预热，然后取800μL加入到2mL的离心管内，在65℃下保温；
(3)将植物材料放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，上下颠倒混匀，并放在65℃水浴锅中保温20min，期间多次颠倒混匀；
(4)将离心管取出，加体积比为24:1的800μL氯仿：异戊醇；颠倒充分混合，温和震荡2～3min，在高速离心机上14000rpm离心10min；
(5)将上清液转移到1.5mL离心管中，加入6μL 10mg·mL-1的RNase充分颠倒混匀，放在37℃恒温箱内温育1h，用体积比为24:1的氯仿:异戊醇抽提1次；
(6)将上清液转移到1.5mL离心管中，加500μL事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于-20℃冰箱中沉淀DNA 10min；
(7)在高速离心机上用14000rpm离心3min，弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA；
(8)用500μL 70％乙醇洗DNA沉淀两次，在超净工作台上干燥DNA 1h；
(9)将吹干的DNA溶于50μL超纯水中；将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度并将DNA浓度稀释到200ng·L-1。
进一步，步骤三中，所述进行BSA-seq分析的方法，包括：
利用超声波将亲本和混池基因组DNA序列片段化形成随机片段，对片段化的DNA依次进行末端修复、3′端加A、连接测序接头后，纯化连接产物，再利用磁珠吸附富集基因组长度为300-400bp范围的片段，经过PCR扩增形成测序文库。建好的文库先进行纯化、质检，质检合格的文库用Illumina NovaSeqTM平台进行测序，测序策略为Illumina PE150，总测序读长为300bp，比对到梨参考基因组进行后续分析。
步骤四中，所述进行梨果实褐皮性状的SSR分子标记筛选的方法，包括：
(1)下载白梨基因组序列，利用SSRIT在线分析软件对所下载序列进行SSR搜索，筛选SSR标记；
(2)对SSR标记进行引物设计与PCR扩增分析；
所述SSR标记筛选标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数分别大于或等于18次、9次、6次、5次、4次和3次，所有重复类型的总核苷酸数不能少于18个；
所述SSR标记的引物设计方法，包括：
应用Primer 5.0软件对含有SSR的序列进行引物设计；引物设计的主要参数为：引物长度控制在18～24bp；预期产物长度控制在150～550bp左右；SSR位点距离序列两端大于50bp；引物Tm值在50～65℃之间，且上、下游引物Tm值相差小于5℃；引物GC(％)含量45％～55％；
所述SSR标记的PCR扩增分析包括：
对SSR标记进行扩增分析；SSR反应体系为15μL，其中包括：模板DNA 20ng，10×Buffer，2.0μmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，正向和反向引物各0.2μmol·L-1，1.0UTaq酶；
PCR扩增在MJ Research PTC-200PCR扩增仪上进行；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，然后是95℃变性30s，合适退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；各引物的合适退火温度参照引物合成报告单；扩增产物用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测；经过电泳筛选后在分离群体上进行验证，若获得的多态性片段在后代绝大多数同类型个体上的表现与在对比基因池间的表现一致，说明该片段就是与褐皮性状相关的分子标记；
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明以褐皮梨品种‘新高’和非褐皮梨品种‘砀山酥’及其杂交组合的F1代群体为试材，通过BSA-seq技术，筛选到与梨果实褐皮性状相关的分子标记，利用获得的分子标记，有利于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析果实褐皮性状形成的分子机制打下基础，为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供重要的理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关联分子标记方法流程图。
图2是本发明实施例提供的与梨果实褐皮相关联分子标记电泳验证图；标记PbSSR1在群体‘新高’ב砀山酥’中的扩增情况：DNA Marker DL2000；B1.褐皮性状基因池；B2.非褐皮性状基因池；1-10.褐皮性状个体；11-20.非褐皮性状个体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮相关联分子标记方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮相关联分子标记方法包括以下步骤：
S101，获得‘新高’和‘砀山酥’杂交组合的F1代群体。
S102，基因组DNA的提取纯化及混池的构建：根据杂交后代果实褐皮性状的调查结果，选取褐皮和非褐皮植株，提取基因组DNA，并按照DNA等量原则构建褐皮/非褐皮表型的对比基因池：B1和B2。
S103，BSA-seq分析：对两个亲本及子代混池B1、B2样本进行BSA-seq，比对参考基因组，检测与梨果实褐皮性状显著相关的scaffolds。
S104，SSR分子标记的鉴定：利用SSRIT在线分析软件进行SSR搜索，利用琼脂糖凝胶电泳方法在分离群体上进行验证，筛选与褐皮性状相关的SSR分子标记。
本发明提供的利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关联的分子标记方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1中本发明提供的利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关联分子标记方法仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
1、内容、目标以及解决的关键问题
1.1发明内容
本发明以‘新高’和‘砀山酥’及其杂交组合的F1代群体为试材，利用BSA-seq技术筛选与梨果实褐皮性状相关联的分子标记。本发明前期工作中已初步筛选到一个与梨果实褐皮性状相关的SSR标记。
梨果实褐皮性状的分子标记鉴定：根据杂交后代果实褐皮性状的调查结果，选取褐皮和非褐皮植株各20株，提取基因组DNA，然后按照DNA等量原则构建褐皮/非褐皮表型的对比基因池B1和B2。对两个亲本及子代混池B1、B2样本进行BSA-seq，比对梨参考基因组，筛选与褐皮性状相关的SSR分子标记。
2.2目标
(1)鉴定出与梨果实褐皮性状相关联的分子标记；
(2)为现代分子标记辅助育种提供技术依据。
2.3解决的关键问题
筛查与梨果实褐皮性状紧密连锁的分子标记，为生产上梨杂交后代的标记辅助选择育种提供技术依据。
2、采取的技术方案及可行性分析
2.1技术方案
2.1.1梨果实褐皮性状的分子标记鉴定
2.1.1.1基因组DNA的提取与纯化
采用褐皮品种‘新高’与非褐皮品种‘砀山酥’及其杂交组合的F1代群体为材料，田间观察结果植株的果皮颜色，对果皮性状的分离情况进行记录，采集幼嫩的叶片或腋芽用于植物基因组DNA提取。
基因组DNA的提取参考田义轲等的方法，并加以改良，主要步骤如下：
(1)取腋芽或幼嫩的叶片0.1g，装入样品袋中，做好标记并放到-80℃的超低温冰箱内保存，以备DNA提取之用；
(2)将内含2％CTAB的提取缓冲液CTAB buffer事先在65℃预热，然后取800μL加入到2mL的离心管内，在65℃下保温；
(3)将植物材料放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，上下颠倒混匀，并放在65℃水浴锅中保温20min，期间多次颠倒混匀；
(4)将离心管取出，加体积比为24:1的800μL氯仿：异戊醇；颠倒充分混合，温和震荡2～3min，在高速离心机上14000rpm离心10min；
(5)将上清液转移到1.5mL离心管中，加入6μL 10mg·mL-1的RNase充分颠倒混匀，放在37℃恒温箱内温育1h，用体积比为24:1的氯仿:异戊醇抽提1次；
(6)将上清液转移到1.5mL离心管中，加500μL事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于-20℃冰箱中沉淀DNA 10min；
(7)在高速离心机上用14000rpm离心3min，弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA；
(8)用500μL 70％乙醇洗DNA沉淀两次，在超净工作台上干燥DNA 1h；
(9)将吹干的DNA溶于50μL超纯水中；将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度并将DNA浓度稀释到200ng·L-1。
2.1.1.2BSA-seq分析
构建果实褐皮/非褐皮表型的对比基因池，每个混池中DNA等量混合，利用超声波将亲本和混池基因组DNA序列片段化形成随机片段，对片段化的DNA依次进行末端修复、3′端加A、连接测序接头后，纯化连接产物，再利用磁珠吸附富集基因组长度为300-400bp范围的片段，经过PCR扩增形成测序文库。建好的文库先进行纯化、质检，质检合格的文库用Illumina NovaSeqTM平台进行测序，测序策略为Illumina PE150，总测序读长为300bp，比对到梨参考基因组进行后续分析。
2.1.1.3梨果实褐皮性状的SSR分子标记的筛选
下载西洋梨和白梨基因组序列，利用SSRIT在线分析软件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)对所下载序列进行SSR搜索，筛选SSR标记。
SSR标记筛选标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数分别大于或等于18次、9次、6次、5次、4次和3次，所有重复类型的总核苷酸数不能少于18个。
对SSR标记进行引物设计与PCR扩增分析。
SSR标记的引物设计：
应用Primer 5.0软件对含有SSR的序列进行引物设计。引物设计的主要参数为：引物长度一般控制在18～24bp；预期产物长度控制在150～550bp左右；SSR位点距离序列两端大于50bp；引物Tm值在50～65℃之间，且上、下游引物Tm值相差小于5℃；引物GC(％)含量45％～55％。
SSR标记的PCR扩增分析：
对SSR标记进行扩增分析。SSR反应体系为15μL，其中包括：模板DNA 20ng，10×Buffer，2.0μmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，正向和反向引物各0.2μmol·L-1，1.0UTaq酶。
PCR扩增在MJ Research PTC-200PCR扩增仪上进行。PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，然后是95℃变性30s，合适退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。各引物的合适退火温度参照引物合成报告单。扩增产物用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测。经过电泳筛选后在分离群体上进行验证，若获得的多态性片段在后代绝大多数同类型个体上的表现与在对比基因池间的表现一致，说明该片段就是与褐皮性状相关的分子标记。
2.2技术路线
与梨果实褐皮性状相关联的分子标记电泳验证图如图2所示。
表1本发明针对褐皮性状跑出差异条带的SSR引物(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0002936515270000091
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002936515270000101
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮相关联分子标记方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccatcttca ctctacaaga aatcattgtc caataaataa gcaagttttg 50

Claims (4)

1.一种利用BSA-seq(Bulked-segregant analysis by pooled sequencing，混合群体分离分析法)筛选与梨果实褐皮性状相关联分子标记的方法，其特征在于，所述筛选分子标记的方法包括：
获得‘新高’和‘砀山酥’杂交组合的F1代群体；
基因组DNA的提取纯化及混池的构建：根据杂交后代果实褐皮性状的调查结果，选取褐皮和非褐皮植株，提取基因组DNA，并按照DNA等量原则构建褐皮/非褐皮表型的对比基因池：B1(褐皮)和B2(非褐皮)；
BSA-seq分析：对两个亲本及子代混池B1、B2样本进行BSA-seq，比对参考基因组，检测与梨果实褐皮性状显著相关的scaffolds；
SSR分子标记的鉴定：利用SSRIT在线分析软件进行SSR搜索，利用琼脂糖凝胶电泳方法在分离群体上进行验证，筛选与褐皮性状相关的SSR分子标记。
2.如权利要求1所述的利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮相关联分子标记的方法，其特征在于，所述基因组DNA的提取方法，包括：
(1)取腋芽或幼嫩的叶片0.1g，装入样品袋中，做好标记并放到-80℃的超低温冰箱内保存，以备DNA提取之用；
(2)将内含2％CTAB的提取缓冲液CTAB buffer事先在65℃预热，然后取800μL加入到2mL的离心管内，在65℃下保温；
(3)将植物材料放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，上下颠倒混匀，并放在65℃水浴锅中保温20min，期间多次颠倒混匀；
(4)将离心管取出，加体积比为24:1的800μL氯仿：异戊醇；颠倒充分混合，温和震荡2～3min，在高速离心机上14000rpm离心10min；
(5)将上清液转移到1.5mL离心管中，加入6μL 10mg·mL-1的RNase充分颠倒混匀，放在37℃恒温箱内温育1h，用体积比为24:1的氯仿:异戊醇抽提1次；
(6)将上清液转移到1.5mL离心管中，加500μL事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于-20℃冰箱中沉淀DNA 10min；
(7)在高速离心机上用14000rpm离心3min，弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA；
(8)用500μL 70％乙醇洗DNA沉淀两次，在超净工作台上干燥DNA 1h；
(9)将吹干的DNA溶于50μL超纯水中；将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度并将DNA浓度稀释到200ng·L-1。
3.如权利要求1所述的利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关联分子标记的方法，其特征在于，所述进行BSA-seq分析的方法，包括：
利用超声波将亲本和混池基因组DNA序列片段化形成随机片段，对片段化的DNA依次进行末端修复、3′端加A、连接测序接头后，纯化连接产物，再利用磁珠吸附富集基因组长度为300-400bp范围的片段，经过PCR扩增形成测序文库；建好的文库先进行纯化、质检，质检合格的文库用Illumina NovaSeqTM平台进行测序，测序策略为Illumina PE150，总测序读长为300bp，比对到梨参考基因组进行后续分析。
4.如权利要求1所述的利用BSA-seq筛选与梨果实褐皮性状相关联分子标记的方法，其特征在于，所述进行与梨果实褐皮性状相关联的SSR分子标记筛选的方法，包括：
(1)下载梨基因组序列，利用SSRIT在线分析软件对所下载序列进行SSR搜索，筛选SSR标记；
(2)对SSR标记进行引物设计与PCR扩增分析；
所述SSR标记筛选标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数分别大于或等于18次、9次、6次、5次、4次和3次，所有重复类型的总核苷酸数不能少于18个；
所述SSR标记的引物设计方法，包括：
应用Primer 5.0软件对含有SSR的序列进行引物设计；引物设计的主要参数为：引物长度控制在18～24bp；预期产物长度控制在150～550bp左右；SSR位点距离序列两端大于50bp；引物Tm值在50～65℃之间，且上、下游引物Tm值相差小于5℃；引物GC(％)含量45％～55％；
所述SSR标记的PCR扩增分析包括：
对SSR标记进行扩增分析；SSR反应体系为15μL，其中包括：模板DNA 20ng，10×Buffer，2.0μmol·L-1 MgCl2，0.2mmol·L-1 dNTPs，正向和反向引物各0.2μmol·L-1，1.0U Taq酶；
PCR扩增在MJ Research PTC-200 PCR扩增仪上进行；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，然后是95℃变性30s，合适退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；各引物的合适退火温度参照引物合成报告单；扩增产物用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测；经过电泳筛选后在分离群体上进行验证，若获得的多态性片段在后代绝大多数同类型个体上的表现与在对比基因池间的表现一致，说明该片段就是与梨褐皮性状相关的分子标记。
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