CN113136449B - 一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用 - Google Patents

一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用，所述微卫星分子标记具有序列表SEQ.ID.No.1‑SEQ.ID.No.13中任意一种或多种的核苷酸序列，对应序列表SEQ.ID.No.1‑SEQ.ID.No.13的微卫星分子标记的特异性引物分别为Pvj1、PVH4、PV14、Pv15、Pv21、Pv33、Pv39、Pv44、Pv49、Pv50、Pv51、Pv8、Pv23；本发明建立了一种制备沙鞭微卫星分子标记的方法，为进行沙鞭种质资源鉴定、遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、种群遗传结构分析、基因定位、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系等方面的研究提供分子标记。

Description

一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及沙鞭DNA分子标记技术领域，具体涉及一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用。
背景技术
沙鞭(Psammochloa villosa(Trin.)Bor)是禾本科(Poaceae)、针茅族(stipeae)、沙鞭属(Psammochloa)的一种多年生草本植物，主要分布于我国内蒙古高原及其毗邻沙区，如巴丹吉林沙漠、马兰布和沙漠、腾格里沙漠、库布齐沙漠、毛乌素沙地及甘肃河西走廊沙区、宁夏中北部和陕西北部沙区，是这些极端沙地环境下分布的关键或唯一草本物种，不仅具有重要的生态价值，而且也是我国沙漠地区重要的优势牧草；沙鞭具长而横走的根状茎，圆锥花序紧密直立，小穗具有短柄、淡黄色或白色，外稃密被长柔毛等特征，主要通过克隆繁殖进行后代繁育，具有很强的建群能力，是我国内蒙古沙地及其毗邻地区的先锋植物和建群草本物种；对流动沙丘具有很强的适应性，是沙地植物群聚的优势种，是典型的旱生和沙生植物，对维持这一区域内的生态系统平衡具有不可低估的作用；此外，沙鞭具有较强的耐旱、耐寒、耐碱以及抗病和抗风沙能力，加之花序相对粗长、穗多粒大等优点，是农牧业上禾草良种繁育和牧草利用的重要基因资源；通过开发合理的微卫星分子标记，可为沙鞭开展种质资源遗传多样性、种群结构、种群历史动态等遗传学研究提供有效技术手段，为后续沙鞭资源的合理开发奠定基础；
SSR(simple sequence repeats)即简单重复序列方法，其广泛分布于真核基因组，以特异引物PCR为基础的分子标记技术，通常称之为微卫星DNA(microsatellite DNA)，一般是以1－6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，如(AC)n、(GA)n、(AT)n、(AAG)n、(AAT)n等，n代表重复次数，从几个到几十个不等，长度一般在100～200bp之间；不同等位基因间的重复数具有高度变异性，这些变异表现为微卫星数目的整倍数变异或重复单位序列中的序列差异，因而SSR具有多态性；SSR标记具有分布广泛、特异性、共显性、操作简单等优势在植物分子标记相关研究中应用广泛；
因此，开发SSR微卫星分子标记，可为开展沙鞭种质资源遗传多样性、种群结构、种群历史动态等遗传学研究提供有效技术手段，而在现有技术中，并没有利用SSR方法对沙鞭进行遗传学方面的相关报道和研究。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用，通过利用限制性酶切位点相关的DNA基因组扫描技术开发出沙鞭微卫星分子标记并获得相应的引物，建立了一种制备沙鞭微卫星分子标记的方法，为进行沙鞭种质资源鉴定、遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、种群遗传结构分析、基因定位、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系等方面的研究提供分子标记。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种沙鞭微卫星分子标记，所述微卫星分子标记具有序列表SEQ.ID.No.1-SEQ.ID.No.13中任意一种或多种的核苷酸序列。
一种沙鞭微卫星分子标记的特异性引物，对应序列表SEQ.ID.No.1-SEQ.ID.No.13的微卫星分子标记的特异性引物对应的位点分别编号为Pvj1、PVH4、PV14、Pv15、Pv21、Pv33、Pv39、Pv44、Pv49、Pv50、Pv51、Pv8、Pv23。
优选的，所述Pvj1、PVH4、PV14、Pv15、Pv21、Pv33、Pv39、Pv44、Pv49、Pv50、Pv51、Pv8和Pv23的引物序列如下：
Pvj1的正向引物序列：5’-AAGAGCATTCCTTGCAGCA-3’；
Pvj1的反向引物序列：5’-ATGACTCCGGCATGTGGTT-3’；
PVH4的正向引物序列：5’-ATCCTTTGAGCATCCACCCCC-3’；
PVH4的反向引物序列：5’-GCTTGCTGAGGAGTCTCTGCGTCT-3’；
PV14的正向引物序列：5’-GATCCTGGGTTTGGAAGTG-3’；
PV14的反向引物序列：5’-CTTATAGTACTCTTCAAGCTCCTT-3’；
Pv15的正向引物序列：5’-AGCAGATTGGCAGAGAACTCAGG-3’；
Pv15的反向引物序列：5’-CTGCGCCTTCCTCCATCAT-3’；
Pv21的正向引物序列：5’-CCTCTACCGCCTCTTCGTCTCC-3’；
Pv21的反向引物序列：5’-GCGAACCAGAAGAGGTAGTACTC-3’；
Pv33的正向引物序列：5’-GCACCACGCCGGCAAGAAA-3’；
Pv33的反向引物序列：5’-CCGTGGACGACTTGCCGAAGA-3’；
Pv39的正向引物序列：5’-TCTGAGGTACAATATCCGAAGC-3’；
Pv39的反向引物序列：5’-ACTTGCGATTGAAGCGTGT-3’；
Pv44的正向引物序列：5’-AAGTAAGCCCAGAGCAGGAG-3’；
Pv44的反向引物序列：5’-AATCAGCCAATCATCAATCTCA-3’；
Pv49的正向引物序列：5’-GCCTTCGGGTGCGTGAGC-3’；
Pv49的反向引物序列：5’-CCTCGTCTTCCCCACGGTGA-3’；
Pv50的正向引物序列：5’-CGGCTGGACGAGGCGAAGGT-3’；
Pv50的反向引物序列：5’-CAGGAGGAGGGTGTTGGACGTGAC-3’；
Pv51的正向引物序列：5’-CGCCGCGTTCCCGCTGTA-3’；
Pv51的反向引物序列：5’-CCGTCCCCGCATTGCTGC-3’；
Pv8的正向引物序列：5’-TGGCAGTGGATGTGGAGCTGAT-3’；
Pv8的反向引物序列：5’-CACGGATGGATGGCACTGCTAC-3’；
Pv23的正向引物序列：5’-GACTAACCTCCTGGGCACT-3’；
Pv23的反向引物序列：5’-TGCCGCTGCATATGCCGAAG-3’。
一种制备沙鞭微卫星分子标记的方法，包括步骤
S1：RNA的提取与质量检测：采用Trizol法进行样本RNA的提取，获得RNA后；利用Nanodrop 2000与Agilent 2100进行总RNA质量检测；
S2：构建cDNA文库：RNA样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymerase I和RNase H合成二链cDNA，随后利用AMPure XPbeads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择；最后进行PCR扩增，并用AMPure XPbeads纯化PCR产物，得到最终的文库；
S3：文库质检：文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段大小进行检测，插入片段符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量；
S4：转录组测序：文库检测合格后，采用PacBio Sequel测序平台的SMRT(singlemolecule Real-time)单分子实时测序技术进行全长转录测序分析；
S5：测序数据质量评估：使用SMRTLink软件Iso-Seq流程获取全长转录组的分析过程主要包括3个阶段，获取CCS序列(CCS)，全长序列识别(classify)、isoform水平聚类(cluster)。
S6：SSR位点的检测和搜寻：采用MISA、SSRLocator和GMATA软件进行SSR检测和搜寻，三个软件共有的序列作为SSR引物待选序列；
S7：SSR引物设计：用Primer 5软件批量设计SSR引物，并鉴定其在不同沙鞭个体中的多态性，得到用于用于沙鞭属植物的微卫星分子标记的多态性引物。
一种沙鞭微卫星分子标记的特异性引物的应用，包括以下步骤
S1：沙鞭野外采样，采集野外生长良好的沙鞭叶片，放入事先已装有硅胶的小信封袋中，带回实验室进行DNA的提取，DNA提取采用改良的CTAB法进行；
S2：利用权利要求1所述的任意一对或多对引物，对已提取的沙鞭不同个体DNA进行PCR扩增；
S3：毛细管电泳检测：将筛选好的具有较高多态性的引物进行荧光标记，荧光修饰5’端标记6-FAM，用荧光标记正引物与普通反向引物于ABI3730XL DNA分析仪上进行毛细管电泳扩增；
S4：将扩增后产物送至华大基因测序，进行基因分型。
优选的，步骤S2所述的PCR扩增反应程序为：
(1)94℃预变性5min；
(2)94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，15次循环；
(3)94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，20次循环；
(4)72℃延伸5min；
(5)4℃保存。
沙鞭微卫星分子标记或特异性引物在沙鞭遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析和/或进化与亲缘关系研究中的应用。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
针对目前技术尚未开发沙鞭微卫星标记的现状，本发明提出了一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用，通过利用限制性酶切位点相关的DNA基因组扫描技术开发出沙鞭微卫星分子标记并获得相应的引物，建立了一种制备沙鞭微卫星分子标记的方法，为进行沙鞭种质资源鉴定、遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、种群遗传结构分析、基因定位、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系等方面的研究提供分子标记，为开展沙鞭种质资源遗传多样性、种群结构、种群历史动态等遗传学研究奠定了基础，有利于沙鞭资源的合理开发。
附图说明
图1为本发明实施例1沙鞭cDNA文库构建原理示意图。
图2为本发明实施例1沙鞭测序下机序列信息介绍图。
图3为本发明实施例1转录组Iso-Seq分析流程。
图4为本发明实施例1CSS序列长度分布图，横坐标为CCS序列长度，纵坐标为对应长度序列数统计。
图5为本发明实施例1全长非嵌合体序列长度分布图，横坐标为序列长度，左边纵坐标为对应的序列量。
图6为本发明实施例1矫正后序列质量分布图，横坐标为序列质量值，纵坐标为对应的序列数。
图7为本发明实施例1去冗余后沙鞭转录本长度分布图。
图8为本发明实施例1不同类型SSR分类统计。
图9为本发明实施例1部分引物筛选电泳图。
图10为本发明实施例2基于引物Pv14的毛细管电泳图。
其中：图9-1为本发明实施例1Pv49、Pv50、Pv51、Pv44、Pv39引物筛选电泳图，图9-2为本发明实施例1Pv23、Pv8引物筛选电泳图；图10-1为本发明实施例27-5样本基于Pv14引物的毛细管电泳图，图10-2为本发明实施例28-2样本基于Pv14引物的毛细管电泳图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：参照附图1-10所示的一种沙鞭微卫星分子标记的特异性引物的制备方法方法，包括步骤
S1：RNA的提取与质量检测：采用经典提取方法(Trizol法)提取样本RNA，获得RNA后；利用Nanodrop 2000超微量分光光度计与Agilent 2100生物分析仪进行总RNA质量检测；
S2：构建cDNA文库：RNA样品经检测合格后，利用SMARTer PCR cDNA SynthesisKit试剂盒合成步骤S1得到的mRNA的全长cDNA，对全长cDNA进行加A尾并连接测序接头，再用AMPure XPbeads进行片段大小筛选。最后进行PCR扩增，并用AMPure XPbeads纯化PCR产物，得到最终的文库，沙鞭cDNA文库构建示意图如图1所示；
S3：文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段大小进行检测，插入片段符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量；
S4：转录组测序：文库检测合格后，采用PacBio Sequel测序平台的SMRT(singlemolecule Real-time)单分子实时测序技术(第三代测序)进行全长转录测序分析，如图2所示，测序之前转录本两端都会被加上adapter序列及引物，PacBio Sequel平台测序时，利用其超长读长，可以连续多次测通插入片段序列，每测通一次称为一个full pass，产生一个subread，下机数据格式为bam文件，里面包含了测序所得到的所有的subreads序列信息，下机信息介绍见图2，沙鞭下机原始数据见表1；
表1：原始序列数据统计
S5：测序数据质量评估：使用SMRTLink软件Iso-Seq流程获取全长转录组的分析过程主要包括3个阶段，获取CCS序列(CCS)，全长序列识别(classify)、isoform水平聚类(cluster)，分析流程见图3；
S5.1：CCS：从下机subreads的bam文件中提取CCS(Circular ConsensusSequences)序列，CCS序列统计详见表2，CCS序列长度分布见图4；
表2：原始序列数据统计
S5.2：Classify：根据序列中是否存在3'引物、5'引物和PolyA将CCS序列分成全长序列(FL，Full Length)与非全长序列(NFL，NonFull Length)，去除CCS序列两端primer和polyA/T尾序列，过滤全长序列的人工嵌合序列(artificial concatemers)，得到全长非嵌合序列(FLNC,Full-Length，Non-Chimeric)和非全长序列(NFL，Non-Full-Length)，同时根据primer信息和polyA/T尾也可以识别序列strand信息；
分类标准包括以下四个部分：
(1)包含5’和3’端primer；
(2)序列长度大于300bp；
(3)包含PolyA尾巴；
(4)不包含嵌合体序列；
沙鞭转录组分类结果见表3，对得到的全长非嵌合体序列统计如表3所示：
表3：沙鞭CCS序列分类结果统计
S5.3：Cluster：使用ICE(Iterative isoform-clustering)算法通过比对将相似的FLNC序列聚成一簇(cluster)，每个cluster得到一条一致性序列(consensusisoforms)；
结合非全长序列，使用Quiver(或Arrow)算法对聚类对得到的consensusisoforms进行校正(polishing)，筛选高质量(HQ,polished High Quality)的序列进行后续分析；
高质量转录本的筛选条件为：
(1)全长序列(同时包含cDNAprimer和polyA信号尾)；
(2)高质量(predicted accuracy>＝0.99)；
(3)多于2条全长序列支持；
不同建库得到的HQ和LQ转录本统计结果如表4所示：
表4：高质量全长非嵌合体序列结果统计
S6.去冗余分析：由于实验建库过程中，RNA序列5’端可能存在降解，同时cluster算法(ICE)对灵敏度和特异性的高标准，导致Iso-Seq流程得到的polished后的序列中可能存在冗余转录本；筛选polish后的转录本与重构的GeneFamily的GMAP比对结果中identity>0.9，coverage>0.8的序列，使用ToFU软件(--dun-merge-5-shorter)合并仅5’端最后一个外显子有差异的序列进行去冗余，得到unique转录本。同时，为保证转录本信息的完整性，默认不采用cd-hit进行去冗余，同时对于未比对到GeneFamily的序列，与前面得到的unique转录本进行合并，得到最终的unique转录本，组装得到184076条unique，平均长度为2461bp，总长度为453051607bp。去冗余后转录本长度分布见图7，去冗余的统计信息如下：
表5：去冗余后转录本长度分布
S7：SSR位点的检测和搜寻：采用MISA(MIcroSAtellite:http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)、SSRLocator(http://www.microsatellite.org/ssr.php)和GMATA软件进行SSR检测和搜寻，三个软件共有的序列作为SSR引物待选序列，对应的各个unit size的最少重复次数分别为：1-10，2-6，3-5，4-5，5-5，6-5(如：1-10，以单核苷酸为重复单位时，其重复数至少为10才可被检测到；2-6，以双核甘酸为重复单位时，其最少重复数为6)对转录本进行SSR检测，共搜索到SSR位点93563个，单、二、三、四、五、六核苷酸SSR数目分别为50027、15609、26112、1030、317、468；不同类型核苷酸SSR数目统计见图8。
S8：SSR引物设计：用Primer 5软件批量设计SSR引物，基于转录组数据共设计了97对SSR引物，随机挑选地理位置上相距较远的20个个体进行PCR扩增。有13对引物扩增出条带清晰、多态性较高的产物，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，15次循环；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，20次循环；72℃延伸5min；4℃保存；部分引物琼脂糖凝胶电泳图如图9所示；
并鉴定其在不同沙鞭个体中的多态性，得到沙鞭属植物的微卫星分子标记的多态性引物，各引物的特点及微卫星分子标记的对应关系如表6所示：
表6：沙鞭微卫星引物特征及微卫星分子标记的对应关系
上述表6所示的13对用于沙鞭属植物的微卫星分子标记的多态性引物的引物编号分别为：Pvj1、PVH4、PV14、Pv15、Pv21、Pv33、Pv39、Pv44、Pv49、Pv50、Pv51、Pv8、Pv23，所述核苷酸序列分别如SEQ.ID.No.1-SEQ.ID.No.13所示序列。
实施例2：一种应用沙鞭微卫星分子标记分析沙鞭遗传多样性的方法，包括以下步骤
S1：沙鞭野外采样，采集野外生长良好的沙鞭叶片，放入事先已装有硅胶的小信封袋中，带回实验室进行DNA的提取，DNA提取采用改良的CTAB法进行，本研究采取39个居群195个沙鞭个体为实验材料，图表7所示：
表7：39个居群样本信息
S2：利用上述的任意一对或多对引物，对已提取的沙鞭不同个体DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，15次循环；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，20次循环；72℃延伸5min；4℃保存。
S3：毛细管电泳检测：将筛选好的具有较高多态性的引物进行荧光标记，荧光修饰5’端标记6-FAM，用荧光标记正引物与普通反向引物于ABI3730XL DNA分析仪上进行毛细管电泳扩增，如图10所示；
S4：将扩增后产物送至华大基因测序，进行基因分型；
S5：数据处理：毛细管电泳的结果使用GeneMapperV 3.2进行数据分析，同时将每个位点分别与样本扩增后的产物片段大小、数量转化成直观可见的图谱；利用DataFormater以及PGDspider 2.1.1.3软件进行格式转化，将所得片段长度数值转化为POPGEN软件可识别的格，式利用POPGEN 1.32软件计算遗传多样性指数；
对沙鞭39个居群195个个体进行了SSR扩增，扩增结果表明：微卫星位点在群体水平上期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)分别位于0.183～0.576和0.215～0.964之间；有效等位基因数(Ne)均值1.776，所有位点在1.362～2.546范围内；Shannon信息指数(I)介于0.278～0.946，均值为0.567。多态性位点百分比为77.1％；多态信息指数PIC值在0.317～0.747之间，均值为0.511，详见表8；以上结果表明筛选的SSR引物具有较高的多态性，并且具有较高的遗传多样性，可为后期沙鞭资源的开发利用提供新的研究方法；
表8：基于39个沙鞭居群的13个SSR位点遗传多样性指数信息
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 青海民族大学,青海师范大学
SEQUENCE LISTING
Pvj1
ggaatctctt ttctctctct ctctctcact agcagtgatg aatagaggag aattccagag 60
ctccctggtg caacagatga tctggagtgg taccggtagt gatacaaaca ccacaagctg 120
cagcaatatg atgagtagct tgaagacatg ccatgaggag aaagaggcgt ctcctaacat 180
gccctccttg tcttctccct ccatgctctt ctcccaacag tttcctcata tctcttcagg 240
cctagttcat atgaaccgtc ccccttgtct tccaagcttt cgtgatggcg gtggccgcca 300
ggagaacccc ttgccggagt cata 324
H4
gggggttttt ttttgtttgc gagccgtagg agacggcccc tcccgtcctc ctcctcctcc 60
tccgcatgaa ccttaaagca tctccggcgc cacgctcatc ggaggaggaa ccccgcgccc 120
gggcccgatt caatggccaa cagcaacctc ccgcaacgaa tcatcaaggt gtgccctccg 180
atctgatcat cccgaccgca gatctctcgc cgacttcaat ctgattcgct tccttttttg 240
ctaatttttt tggggggttc cgtgtggtcg gatctacgta ggagacgcag agactcctca 300
gcaagca 307
Pv14
gggggtatcg gcactgactt tgataggaga caaattgctt gggttacctg agggctggac 60
tcttgacgat tctaaagaag ggtctgctgc cactgatgag aaagctatcc atgagaagaa 120
gaagaagaag aagagtagtg aggatgttga tgatggggag gaaggtgata aaaaaaaaac 180
agagatctcc ttcgaggaca aggatgatct tgagcttgag gttgatgagt actactagaa 240
taaggagc 248
Pv15
gcgaatattt ctctgttcac gagcagcgcg ttcaggagag ccaggggaga agccgcagcc 60
caagccctca ccacaggagg gacaaccgtg atcgtggtga cttccgccgt gatggtcgtg 120
atggataccg tggtggtggt ggtggtgatg gataccgtgg tggtggtgct gatggttacc 180
ggggtggtgg tgatggttac cgtggtggcg gtgagggtta ccgaggtggc ggcggtgagg 240
gttaccgagg tggtggcggt ggtggacgta ggggtggagg caggcatgac aggtatgatg 300
atggaggaag gcgcag 316
Pv21
ccttccatcc ttctcgacct cgcctccgcc tcccccgacc ccgcgctcgc caatctcctc 60
ctctccctcc tctccccctc cggcccgctc ctcgcctccg ccgccgccgc cgaccgcctc 120
gccctcatcc gcttcgtctt cccctccgag cgcctccctt actggctccg cgtagccctc 180
gcctccgcca ccgacctcgt ctcgccgctc ctcgccgccc gcgtcggctc cgacctccac 240
ctctccgtct tcgagtacta cctcttctgg ttcgca 276
Pv33
aggcgcagaa gccgctgctg acaaggctga tgaggatggc cgggctccgc cccatcgacg 60
tcgaggtcga gccgggcacc accatgcacg tctgggctcc caagcaccac gccggcaaga 120
aaggcaccac catcagccct ctcgagccca gcgccggcgc cgacgacacc accaagaagc 180
catccagtgg caggaggagg aggaggagga aggatcccga gtccaagccc aacgtcgtcc 240
tcatccacgg cttcgcc 247
Pv39
cggcagaaga gtatgcagct tctgttggtt tggcttacag tcaggtccga atatggttca 60
aggagcggag gaggaaagag aggagacaga tggaagctat aggggctcac aggcagacac 120
aacttagtgc aagatcaaat gggcttagat ccagtagcag cagcagcagc agctcctcca 180
agtcttccta ttttaccctg actcccttga tgggtttacg atgatgatga tgatatctct 240
gttgatagga gtatgagctt tgaacgaaag aaacacacaa gtctatcgca agta 294
Pv44
cggccggtca gtagaggaga gctggaggag gaggaggagg agttgttgat caagggtgaa 60
gatagctctt cacatacttc gacagaggta actaatgccg aggtgacaaa gccagatgtc 120
gagcacggag ttgctgaaca gagtactctg acggggaaga aagattgtgg ccatgctgag 180
tgcaaggaag ctgagattga tgattggctg atta 214
Pv49
acggggagag gccgcgctca tggcgcgtcg gggctcatcg ggctcggtcg cggccgcctc 60
tcgctggtct cccagacggg cgccaccagg ttctcctact gcctcacgcc gtacttccac 120
gagagcggat cttccagcca cctgttcgtc ggcgcgtcgg cgagcttgag cggcggcggc 180
ggcggcgcag tgacgtccat gccgttcgtg aagagcccca aggattaccc ctacaacacg 240
ttctactacc tcccgctggt ggggatcacc gtggggaaga cgagga 286
Pv50
ccgggaaaca ctgtccgctc gtcgaggccg agcagcggct gctggagatc caggaggtcg 60
tggccggcgg caatggcatc ggcgggagcg gcggcggcgg cggcccgtgg aaggaggtgg 120
catccaaggc cggagtccgt cgcgtgctgg ccactgtgct ggctctgcag ttcttccagc 180
aggcgtcggg catcgactcg gtggtgctgt acggccctcg cgtgctcgcc atggccggcg 240
tcacgtccaa caccctcctc ctga 264
Pv51
gggggttgca gtggagcgat cagggacggc gagtaccagc acctcgaccg gcacgtgtgt 60
ttggattaca ccgggatgaa cctcttctcc cacgcgcaga tgaactcgtc cgtgccgtcc 120
acgtccacgg cggcggcggc ggcggcgacg acggcgtggc ggccgccctt cttcttcatc 180
gtgtacaggt cggagagcat gatgacgctg gtggagcaac gctgggacgg cgga 234
Pv8
gcgaaacgac tgtgacgtga tgtcgctgcc agccggcgat gatgagcaag agcagaaaat 60
gcaaatgaag cagcagcagg aggtggcagt gtccgaggac gatggggagt cgttcgaagt 120
ggagagcatc atgaaacaag tagcagcagc agcagcagca ggcaaaggca atcaattagt 180
tgcggatcct gcgtacgact atagcccgtc gtcagcaggt aagctgggga agacggagca 240
ggcattcgac caagctgaag ctggagctcc tgtagcagtg cctccatccg tga 293
Pv23
ctgctgcgca catggatgcc gtgctcgtcg ctcttcttgc cgctctacct gatctcgatc 60
gggcaaggcg gctacaaccc ttcgctgcag gccttcggcg ccgaccagct cggcatcggc 120
gacggcgacg gcggcgcggg gtccggcacg acggaggagg aggaggagga ggaggagggc 180
aaggtgaaga gcaagttctt ccagtggtgg tacttcggca tatgcagcgg cagcctcc 238
<120> 一种沙鞭微卫星分子标记、引物对及其制备方法与应用
<160> 0
<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims (4)

1.特异性引物组合物，其特征在于：包括Pvj1、PvH4、Pv14、Pv15、Pv21、Pv33、Pv39、Pv44、Pv49、Pv50、Pv51、Pv8和Pv23的引物，所述Pvj1、PvH4、Pv14、Pv15、Pv21、Pv33、Pv39、Pv44、Pv49、Pv50、Pv51、Pv8和Pv23的引物序列如下：
Pvj1的正向引物序列：5，-AAGAGCATTCCTTGCAGCA-3，；
Pvj1的反向引物序列：5，-ATGACTCCGGCATGTGGTT-3，；
PvH4的正向引物序列：5，-ATCCTTTGAGCATCCACCCCC-3，；
PvH4的反向引物序列：5，-GCTTGCTGAGGAGTCTCTGCGTCT-3，；
Pv14的正向引物序列：5，-GATCCTGGGTTTGGAAGTG-3，；
Pv14的反向引物序列：5，-CTTATAGTACTCTTCAAGCTCCTT-3，；
Pv15的正向引物序列：5，-AGCAGATTGGCAGAGAACTCAGG-3，；
Pv15的反向引物序列：5，-CTGCGCCTTCCTCCATCAT-3，；
Pv21的正向引物序列：5，-CCTCTACCGCCTCTTCGTCTCC-3，；
Pv21的反向引物序列：5，-GCGAACCAGAAGAGGTAGTACTC-3，；
Pv33的正向引物序列：5，-GCACCACGCCGGCAAGAAA-3，；
Pv33的反向引物序列：5，-CCGTGGACGACTTGCCGAAGA-3，；
Pv39的正向引物序列：5，-TCTGAGGTACAATATCCGAAGC-3，；
Pv39的反向引物序列：5，-ACTTGCGATTGAAGCGTGT-3，；
Pv44的正向引物序列：5，-AAGTAAGCCCAGAGCAGGAG-3，；
Pv44的反向引物序列：5，-AATCAGCCAATCATCAATCTCA-3，；
Pv49的正向引物序列：5，-GCCTTCGGGTGCGTGAGC-3，；
Pv49的反向引物序列：5，-CCTCGTCTTCCCCACGGTGA-3，；
Pv50的正向引物序列：5，-CGGCTGGACGAGGCGAAGGT-3，；
Pv50的反向引物序列：5，-CAGGAGGAGGGTGTTGGACGTGAC-3，；
Pv51的正向引物序列：5，-CGCCGCGTTCCCGCTGTA-3，；
Pv51的反向引物序列：5，-CCGTCCCCGCATTGCTGC-3，；
Pv8的正向引物序列：5，-TGGCAGTGGATGTGGAGCTGAT-3，；
Pv8的反向引物序列：5，-CACGGATGGATGGCACTGCTAC-3，；
Pv23的正向引物序列：5，-GACTAACCTCCTGGGCACT-3，；
Pv23的反向引物序列：5，-TGCCGCTGCATATGCCGAAG-3，。
2.根据权利要求1所述的特异性引物组合物的应用方法，其特征在于：所述的特异性引物组合物的应用包括步骤
S1：沙鞭野外采样，采集野外生长良好的沙鞭叶片，放入事先已装有硅胶的小信封袋中，带回实验室进行DNA的提取，DNA提取采用改良的CTAB法进行；
S2：利用权利要求1所述的特异性引物组合物，对已提取的沙鞭不同个体DNA进行PCR扩增；
S3：毛细管电泳检测：将所述引物进行荧光标记，荧光修饰5’端标记6-FAM，用荧光标记正引物与普通反向引物于ABI3730XL DNA分析仪上进行毛细管电泳扩增；
S4：将扩增后产物送至华大基因测序，进行基因分型。
3.根据权利要求2所述的特异性引物组合物的应用方法，其特征在于：步骤S2所述的PCR扩增反应程序为：
（1）94℃预变性5min；
（2）94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，15次循环；
（3）94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，20次循环；
（4）72℃延伸5min；
（5）4℃保存。
4.权利要求1所述的特异性引物组合物在沙鞭遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析和/或进化与亲缘关系研究中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Genetic Variation and Clonal Diversity of Psammochloa villosa (Poaceae) Detected by ISSR Markers;ANG LI等;Annals of Botany;第87卷;585-590 *

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