CN115896331A - 一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记和dCAPS分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴别茄子果皮颜色的dCAPS分子标记及其应用，属于农作物育种。本发明提供的与控制茄子果皮的基因紧密连锁的dCAPS分子标记，位于茄子第10号染色体第19,558,828碱基处。本发明利用获得的分子标记及其特异性引物，可预测茄子果皮颜色，进而准确快速筛选绿色果皮茄子单株，从而减少工作量，降低育种成本，加快育种进程，具有很高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于作物育种技术领域，具体涉及一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记和dCAPS分子标记及其应用。
背景技术
茄子(Solanum melongena L.)是茄科茄属草本植物，在世界各地广为栽培，联合国粮食及农业组织将其列为第四大蔬菜作物。
茄子含有丰富的营养成分，并且口感好，食用方法多样，深受广大人民群众的喜爱。目前，中国已是全球最大的茄子生产国，也是全球茄子消费大国与出口大国。而不同地域的消费人群对于茄子果实颜色有着不同的需求，其颜色的种类、深浅以及均匀程度直接影响茄子的商品价值。若要选育特定颜色的茄子品种，传统育种的方法存在种植面积大，耗费时间长等缺陷。
随着分子育种的发展，利用分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)技术能够缩短育种年限，提高育种效率，是育种工作中的一个有力工具。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上因单个核苷酸的转换、颠换、插入和缺失引起的DNA序列变异。基于SNP位点开发的衍生酶切扩增多态性(derivedcleaved amplified polymorphic sequence,dCAPS)分子标记是针对酶切扩增多态性(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)分子标记的一种改良方法。通过在SNP位点附近引入错配碱基使其能够被限制性内切酶识别，具有共显性、位点特异、操作简单和成本低等优点，在品种分类和分子标记辅助育种中得到了广泛的应用。
然而目前还未有关于茄子颜色性状相关的SNP分子标记的报道，更未有基于dCAPS分子标记检测茄子果皮颜色方法的报道，这无疑阻碍了茄子育种进程，具有很高的实际应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记，能够快速、准确检测绿色果皮茄子品种。
本发明的目的还在于提供一种鉴别茄子果皮颜色的dCAPS分子标记及其应用，可大大减少茄子果皮颜色鉴定的工作量，提高工作效率，加快育种进程。
本发明提供了一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记，位于茄子参考基因组CNP0000734第10号染色体上第19,558,828碱基处存在多态性位点T/C，所述T控制绿色茄子果皮，所述C控制紫色茄子果皮。
优选的，所述SNP分子标记是在SEQ ID NO:1所示的DNA片段上第25位碱基处存在多态性位点T/C。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记开发的dCAPS分子标记EGP22363，所述dCAPS分子标记EGP22363由正向引物和反应引物扩增得到；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供了一种用于鉴别茄子果皮颜色的试剂盒，包括扩增所述dCAPS分子标记EGP22363的正向引物和反向引物以及限制性内切酶MnlⅠ。
优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增混合液和酶切缓冲液。
本发明提供了所述SNP分子标记、所述dCAPS分子标记EGP22363或所述试剂盒在鉴别茄子果皮颜色中的应用。
本发明提供了一种基于所述dCAPS分子标记EGP22363鉴别茄子果皮颜色的方法，包括以下步骤：
以待检测茄子的基因组DNA为模板，用所述dCAPS分子标记EGP22363的扩增引物进行PCR反应，得到PCR产物；
将所述PCR产物经限制性内切酶MnlⅠ酶切，根据得到的酶切片段长度判断茄子果皮颜色：
若只检测到长度210bp的片段，判断待测茄子样本果皮颜色为紫色；
若检测到长度分别175bp和35bp的两个片段，判断待测茄子果皮颜色为绿色；
若同时检测到175bp、35bp和210bp的三个片段，判断待测茄子果皮颜色为紫色的杂合型。
优选的，所述PCR反应的体系为10μl，无菌去离子水3.8μL、2×Hieff PCR MasterMix 5μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、茄子基因DNA 0.4μL。
优选的，所述PCR反应的体系为94℃5min；94℃30sec，52～56℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。
优选的，所述PCR产物酶切反应体系为10μL包括以下组分：PCR产物2μL、无菌去离子水6.8μL、Cutsmart Buffer1μL、MnlⅠ0.2μL。
本发明提供了一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记，位于茄子参考基因组CNP0000734第10号染色体上第19,558,828碱基处存在多态性位点T/C，所述T控制绿色茄子果皮，所述C控制紫色茄子果皮。本发明从绿色果皮茄子和紫色果皮茄子杂交后代F1以及F1自交后代F2为材料经高通量测序，锁定与绿色果皮茄子紧密连锁的区域和SNP位点。实验筛选表明，第10号染色体上第19,558,828碱基的位点存在的多态性与茄子果皮颜色连锁性较好。且基于该位点检测果皮颜色，说明所述SNP分子标记能够准确有效鉴别茄子果皮颜色，为特定果皮颜色的茄子育种提供了检测靶点。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记开发的dCAPS分子标记EGP22363，所述dCAPS分子标记EGP22363由正向引物和反应引物扩增得到；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。基于本发明提供的dCAPS分子标记EGP22363检测茄子果皮颜色，准确率高达88％以上，可从苗期进行鉴定，不仅节约生产成本，而且操作简便等特点，能够对茄子果皮颜色进行有效地检测，可用于果皮颜色相关茄子的选育。
附图说明
图1为BSA-seq方法定位目标性状关联区间示意图；横坐标为染色体的位置，纵坐标为SNP-Ratio算法的计算值；
图2为48对引物扩增片段酶切示意图，1至2号泳道模板为QD绿色果皮茄子，3至4号泳道模板为8G紫色果皮茄子，5至6号泳道模板为QD和8G的F1代紫色果皮茄子的酶切产物检测结果；未出现的引物意为酶切后无条带或条带微弱；
图3为5对多态性引物扩增片段酶切示意图；1至2号泳道模板为QD绿色果皮茄子，3至4号泳道模板为8G紫色果皮茄子，5至6号泳道模板为QD和8G的F1代紫色果皮茄子的酶切产物检测结果；
图4为一种EGP22363 dCAPS分子标记酶切片段多态性示意图；泳道信息如下：M为DL2000 DNA Marker，DL2000 DNA marker从上至下条带大小依次是2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。1至3号泳道模板为QD绿色果皮茄子，4至6号泳道模板为8G紫色果皮茄子，7至9号泳道模板为QD和8G的F1代紫色果皮茄子的酶切产物检测结果；
图5为一种EGP22363 dCAPS分子标记酶切片段多态性鉴定果皮颜色示意图；M为DL2000 DNA Marker，DL2000 DNA marker从上至下条带大小依次是2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。1至42号分别代表不同品种的茄子酶切扩增产物检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记，位于茄子参考基因组CNP0000734第10号染色体上第19,558,828碱基处存在多态性位点T/C，所述T控制绿色茄子果皮，所述C控制紫色茄子果皮。
在本发明中，所述SNP分子标记优选是在SEQ ID NO:1(TTATGGTATAATTAGAATTCAAATYATCTTTAATGTTTTTCTAAATTATATTATTTTTAAAATATATAAATATTACTTGAAAAAATTATGATTATACACTGATAGTGTATATAATTTAAACTCAAAATTTAATTTGTTGTTTGGATTGTATACCACAAATCACAATACATATATATCCACATGCAAAGTGTTGATATTATCGCAACTCAC所示的DNA片段上第25位碱基Y处存在多态性位点T/C。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记开发的dCAPS分子标记EGP22363，所述dCAPS分子标记EGP22363由正向引物和反应引物扩增得到；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(5’-TTATGGTATAATTAGAATTCAAATCC-3’，其中下划线碱基为引入的错配碱基)所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3(5’-GTGAGTTGCGATAATATCAACACTT-3’)所示。所述扩增的产物为SEQ ID NO:4(TTATGGTATAATTAGAATTCAAATCCTCTTTAATGTTTTTCTAAATTATATTATTTTTAAAATATATAAATATTACTTGAAAAAATTATGATTATACACTGATAGTGTATATAATTTAAACTCAAAATTTAATTTGTTGTTTGGATTGTATACCACAAATCACAATACATATATATCCACATGCAAAGTGTTGATATTATCGCAACTCAC，其中下划线部分表示MnlⅠ限制性内切酶的识别位点)所示。
本发明提供了一种用于鉴别茄子果皮颜色的试剂盒，包括扩增所述dCAPS分子标记EGP22363的正向引物和反向引物以及限制性内切酶MnlⅠ。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括PCR扩增混合液和酶切缓冲液。本发明对PCR扩增混合液和酶切缓冲液没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR扩增混合液和酶切缓冲液即可。
本发明提供了所述SNP分子标记、所述dCAPS分子标记EGP22363或所述试剂盒在鉴别茄子果皮颜色中的应用。
本发明提供了一种基于所述dCAPS分子标记EGP22363鉴别茄子果皮颜色的方法，包括以下步骤：
以待检测茄子的基因组DNA为模板，用所述dCAPS分子标记EGP22363的扩增引物进行PCR反应，得到PCR产物；
将所述PCR产物经限制性内切酶MnlⅠ酶切，根据得到的酶切片段长度判断茄子果皮颜色：
若只检测到长度210bp的片段，判断待测茄子样本果皮颜色为紫色；
若检测到长度分别175bp和35bp的两个片段，判断待测茄子果皮颜色为绿色；
若同时检测到175bp、35bp和210bp的三个片段，判断待测茄子果皮颜色为紫色的杂合型。
本发明对待测茄子的基因组DNA提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的在本发明中，所述PCR反应的体系优选为10μl，无菌去离子水3.8μL、2×Hieff PCR MasterMix 5μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、茄子基因DNA 0.4μL。所述PCR反应的体系优选为94℃5min；94℃30sec，52～56℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。所述PCR产物酶切反应体系优选为10μL包括以下组分：PCR产物2μL、无菌去离子水6.8μL、Cutsmart Buffer1μL、MnlⅠ0.2μL。
在本发明中，所述酶切片段长度优选采用电泳检测分析完成。根据条带长度即可预测茄子果皮颜色，进而准确快速筛选绿色果皮茄子单株。
下面结合实施例对本发明提供的一种鉴别茄子果皮颜色的dCAPS分子标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
茄子果皮颜色遗传群体的构建和DNA提取
(1)群体构建
本发明实施例中使用茄子品种QD(绿色果皮茄子)和8G(紫色果皮茄子)为亲本，在春秋大棚进行杂交(正交)和自交，配制成遗传群体，即Pl(QD)、P2(8G)、和F2。遗传群体同时定植于大棚，不分离世代P1、P2、Fl各种30株，分离世代F2种404株，常规栽培管理。
遗传群体的茄子到达商品成熟期后收获进行鉴定。根据茄子种质资源描述规范，每株采收两个达到商品成熟、符合品系特征且发育正常的对茄，于深色背景板上拍摄果实照片，室内进行比色分级。根据供试材料亲本及F2群体果皮颜色分离表现，将茄子种质资源描述规范定为绿色和紫色两类。
(2)DNA提取
亲本绿果皮茄子QD和紫果皮茄子8G分别取3个单株混合样提取DNA；从F2代中随机挑取25份绿色果皮植株(F2代中资源描述规范定为绿的株系)，一起构成绿色果皮子代混池BSAg，从F2代中随机挑取25份紫色果皮茄子(F2代中资源描述规范定为紫的株系)，一起构成紫色果皮茄子子代混池BSAp；共计4个样本池。
利用CTAB法提取以上四个样本池的叶片总DNA，具体步骤如下：取0.1克新鲜子叶，经液氮研磨或者钢珠打碎、2×CTAB裂解液裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀和70％乙醇洗涤等过程，最终DNA沉淀溶解于20μL TE溶液。用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。
实施例2
高通量测序寻找绿色果皮茄子关联区域
(1)高通量测序：利用Illumina NovaSeq测序平台对提取的亲本池QD、8G，以及茄子绿色果皮子代混池BSAg、茄子紫色果皮子代混池BSAp进行双端测序。
(2)测序原始序列处理：将高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(basecalling)分析，转化为原始测序序列(raw data)。然后根据一定的规则，对测序得到的原始测序序列进行过滤处理，主要标准如为：1)采用Adapter Removal去除3’端的接头污染；2)采用滑动窗口法进行质量过滤，窗口大小设置为5bp，步长设置为1bp。每一次往前移动一个碱基，取5个碱基计算窗口的平均Q值，若最后一个碱基的Q值2，则仅保留该位置之前的碱基；若窗口的平均Q值20，则仅保留该窗口倒数第二个碱基及之前的碱基；3)若双末端中任意一条reads的长度50bp，则去除该双末端reads。
(3)SNP位点检测：将过滤之后得到的clean reads，比对到参考基因组(ChinaNational GenBank accession No.CNP0000734)，并利用GATK软件对四个样本(GP05、PP05、BSAg和BSAp)进行SNP检测，然后用ANNOVAR软件对四个样本检测到的SNP位点的位置信息、类型进行注释。
(4)目标性状区域定位：根据质量值、深度、重复性等对全基因组中所有的潜在多态性SNP位点进行进一步的过滤，从而得到高质量的可信SNP位点。然后通过SNP-Ratio算法将目标性状关联到基因组的相关区域。SNP-Ratio的计算方法为：把基因组划分成一定大小的区间，将BSAg中和QD的allele相同的reads数目记为BSAg.QD，BSAg中和8G的allele相同的reads数目记为BSAg.8G，以此类推，分别计算BSAg和BSAp中的SNP ratio：BSAg.QD/BSAg.8G和BSAp.QD/BSAp.8G。然后用BSAg的结果与BSAp结果的比值作图。
(5)目标性状关联区域的确定：将SNP-ratio用500kb为窗口，100kb滑动，峰值较高的区间为目的基因所在的位置。
实施例3
dCAPS分子标记引物的筛选与检测方法
(1)从亲本和F1代中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。将引物溶解后，对亲本DNA进行PCR扩增。反应体系见表1。
表1 PCR扩增反应体系
(2)PCR扩增程序见表2。
表2 PCR扩增反应程序
(3)PCR产物酶切反应体系为(以MnlⅠ为例)见表3。
表3 PCR产物酶切反应体系
37℃恒温2小时，65℃终止反应。其中，限制性内切酶和限制性内切酶配套缓冲液为NEB公司产品。
(4)聚丙烯酰胺电泳、成像与分析：制备浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶：量取18ml的30％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(30％Acr-Bis，29：1)，36ml的无菌水，13.5ml的5×TBE缓冲液，600μl的10％APS，25μl的TEMED，混合后灌入制胶玻璃板。待凝胶完全凝固后，放入垂直电泳槽中，取2μl待测酶切产物加入凝胶点样孔中，接通电源进行电泳，电泳条件为：电泳仪电压150V，电流100-200A，电泳时间1小时10分钟。然后将凝胶从玻璃板中取出，放入600ml渗透液中(1.2g硝酸银，600ml蒸馏水)，摇晃15min后取出，在清水中漂洗两次，每次30秒，再放入600ml显色液中(9.6g氢氧化钠，6.48ml甲醛，600ml蒸馏水)，摇晃1-3min，直到能清楚看到Marker条带。最后蒸馏水清洗，拍照。观察样本条带位置差异。
(5)引物多态性鉴定：以亲本QD和8G的DNA为模板，通过PCR扩增，所合成的48对引物均能扩增出特异性条带。分别用相应的内切酶RsaⅠ、AluⅠ、MseⅠ、HpaⅡ和MnlⅠ酶切之后，电泳检测，发现有5对引物扩增片段的酶切产物呈现多态性。
(6)茄子绿色果皮dCAPS分子标记的确定：以不同果皮颜色的茄子为材料，进一步验证上述呈现多态性的5对引物，以判断扩增产物酶切片段多态性是否与果皮颜色相关。最终发现，d-19558828的引物扩增片段酶切产物的多态性，与茄子果皮颜色连锁性较好。
表4标记引物序列表
注：下划线为5对多态性引物。
实施例4
dCAPS分子标记在茄子果皮颜色甄别中的适用性鉴定
选择不同颜色果皮(绿色和紫色)的茄子材料共计42份，这些材料均为本科室搜集不同地方来源的品种资源，这些材料与本发明中的亲本材料具有不同的地方来源，这些材料可作为测试该引物是否均有普遍适用性的供试材料。对本发明的dCAPS分子标记进行验证。利用CTAB法提取上述茄子叶片的基因组DNA，将EGP22363dCAPS分子标记对应的引物d-19558828用于PCR扩增，并用MnlⅠ对PCR扩增产物进行酶切和片段大小鉴定。
(1)田间资源描述结果表明：
1-6、17、21、23、24、28号共11个样本为绿色果皮茄子；
7-16、18-20、22、25-27、29-42号共31个样本为紫色果皮茄子。
(2)EGP22363 dCAPS标记检测显示：
从图2可以看出：
1)在绿色果皮茄子中，该dCAPS分子标记有6个样本酶切能够得到175bp的特有条带，有5个株系不符合标记检测结果，其中1、3、4、6、28仅能得到210bp的条带；
2)在紫色果皮茄子中，该dCAPS分子标记在31个样本中酶切均能够得到210bp的条带，全部与分子标记结果一致。
在这个实施案例中，本发明开发出检测茄子果皮颜色的分子标记EGP22363dCAPS及其检测引物，对于果皮颜色甄别的准确率高达88％(表1；42份材料中有37份田间资源性状观测结果与分子标记检测结果一致)，且可以从叶片水平，在苗期进行鉴定，不仅节约生产成本，而且操作简便等特点，能够对茄子果皮颜色进行有效地检测，可用于果皮颜色相关茄子的选育。
表5利用dCAPS分子标记鉴别茄子果皮颜色的数据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，位于茄子参考基因组CNP0000734第10号染色体上第19,558,828碱基处存在多态性位点T/C，所述T控制绿色茄子果皮，所述C控制紫色茄子果皮。
2.根据权利要求1所述与茄子果皮颜色性状紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记是在SEQ ID NO:1所示的DNA片段上第25位碱基处存在多态性位点T/C。
3.一种基于权利要求1所述SNP分子标记开发的dCAPS分子标记EGP22363，其特征在于，所述dCAPS分子标记EGP22363由正向引物和反应引物扩增得到；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种用于鉴别茄子果皮颜色的试剂盒，其特征在于，包括扩增权利要求3所述dCAPS分子标记EGP22363的正向引物和反向引物以及限制性内切酶MnlⅠ。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增混合液和酶切缓冲液。
6.权利要求1或2所述SNP分子标记、权利要求3所述dCAPS分子标记EGP22363或权利要求4所述试剂盒在鉴别茄子果皮颜色中的应用。
7.一种基于权利要求3所述dCAPS分子标记EGP22363鉴别茄子果皮颜色的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待检测茄子的基因组DNA为模板，用权利要求3所述dCAPS分子标记EGP22363的扩增引物进行PCR反应，得到PCR产物；
将所述PCR产物经限制性内切酶MnlⅠ酶切，根据得到的酶切片段长度判断茄子果皮颜色：
若只检测到长度210bp的片段，判断待测茄子样本果皮颜色为紫色；
若检测到长度分别175bp和35bp的两个片段，判断待测茄子果皮颜色为绿色；
若同时检测到175bp、35bp和210bp的三个片段，判断待测茄子果皮颜色为紫色的杂合型。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR反应的体系为10μl，无菌去离子水3.8μL、2×HieffPCR MasterMix 5μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、茄子基因DNA 0.4μL。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR反应的体系为94℃5min；94℃30sec，52～56℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。
10.根据权利要求7～9任意一项所述方法，其特征在于，所述PCR产物酶切反应体系为10μL包括以下组分：PCR产物2μL、无菌去离子水6.8μL、Cutsmart Buffer 1μL、MnlⅠ0.2μL。
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