CN116426684B - 一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记及应用 - Google Patents

一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记，缺失的片段为SEQ ID NO:1所示。在紫色果皮的茄子基因组中包含SEQ ID NO:1所示序列，在绿色果皮的茄子基因组中缺失SEQ ID NO:1所示序列。本发明通过检测茄子紫色果皮性状紧密连锁的分子标记，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本，而且大大提高选择效率。本发明中茄子紫色果皮紧密连锁InDel分子标记检测方便快速，结果稳定，不受环境影响，具有准确快速筛选紫色果皮茄子单株的特点。

Description

一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记及应用。
背景技术
茄子(SolanummelongenaL.)是茄科茄属草本植物，原产于热带地区，营养价值高，含有丰富的维生素、酚类和抗氧化成分，在世界各地广泛种植。
茄子含有丰富的营养成分，并且口感好，食用方法多样，深受广大人民群众的喜爱。而不同地域的消费人群对于茄子果实颜色有着不同的需求，其颜色的种类、深浅以及均匀程度直接影响茄子的商品价值。此外，紫色茄子果皮中的花青素含量高，能够作为天然花青素的稳定来源，用于食品添加剂、着色剂以及抗氧化剂中。但是，若要选育特定颜色的茄子品种，需要种植茄子后，待茄子结果观察果皮颜色，选择目标果皮颜色的植株进行后代培育。可见传统育种的方法存在种植面积大，耗费时间长等缺陷，随着分子育种的发展，利用分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)技术能够缩短育种年限，提高育种效率，是育种工作中的一个有力工具。
插入缺失(insertion-deletion，InDel)指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者缺失。然而目前还没有关于茄子果皮颜色性状相关的InDel分子标记的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记，利用所述分子标记可以在苗期通过DNA检测鉴别果实颜色，克服茄子育种中需要在果实期进行颜色筛选的缺点，简化茄子不同果皮颜色品种或品系的培育过程。
本发明提供了一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记，缺失的片段为SEQ ID NO:1所示。
优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了一种用于扩增所述InDel分子标记的引物，包括核苷酸序列如SEQID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物。
本发明提供了一种用于鉴定茄子果皮颜色的检测试剂盒，包括所述引物和PCR扩增反应试剂。
本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物或所述检测试剂盒在检测或鉴别茄子果皮颜色或茄子育种中的应用。
优选的，所述检测茄子果皮颜色的方法，包括以下步骤：
采用所述引物进行PCR扩增待测样本的InDel分子标记的DNA片段，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物的长度进行分析，根据PCR扩增产物的长度判断茄子果皮颜色：
若所述PCR扩增产物的长度仅为214bp时，判断待测样本的茄子果皮颜色为绿色；
若所述PCR扩增产物的长度仅为234bp时，判断待测样本的茄子果皮颜色为紫色；
若所述PCR扩增产物的长度包括214bp和234bp时，判断待测样本的茄子果皮颜色为紫色。
优选的，所述PCR扩增的反应程序为94℃5min；94℃30sec，5256℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。
优选的，所述PCR扩增的反应体系为2×HieffPCRMasterMix5μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、基因组DNA0.4μL，无菌去离子水补充至10μL。
优选的，所述PCR扩增产物的长度进行分析的方法包括电泳和/或测序。
优选的，所述电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳。
本发明提供了一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记，缺失的片段为SEQ ID NO:1所示。本发明提供了一个能有效甄别紫色果皮茄子的InDel分子标记ID1299，通过检测茄子紫色果皮性状紧密连锁基因，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本，而且大大提高选择效率。本发明中茄子紫色果皮紧密连锁InDel分子标记检测方便快速，结果稳定，不受环境影响。通过PCR扩增电泳检测分析，即可预测茄子果皮颜色，进而准确快速筛选紫色果皮茄子单株，准确性达到100％。
附图说明
图1为BSA-seq方法定位目标性状关联区间示意图；其中横坐标为染色体的位置，纵坐标为ED算法的计算值；
图2为17对引物扩增片段示意图；M为DL2000DNAMarker，DL2000DNAmarker从上至下条带大小依次是2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1号泳道模板为QD绿色果皮茄子，2号泳道模板为8G紫色果皮茄子，3号泳道模板为QD和8G的F1代紫色果皮茄子的酶切产物检测结果；未出现的引物意为扩增后无条带或条带微弱；
图3为一种ID1299InDel分子标记酶切片段多态性示意图；泳道信息如下：M为DL2000DNAMarker，DL2000DNAmarker从上至下条带大小依次是2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1号泳道模板为QD绿色果皮茄子，2号泳道模板为8G紫色果皮茄子，3号泳道模板为QD和8G的F1代紫色果皮茄子；
图4为一种ID1299InDel分子标记酶切片段多态性鉴定果皮颜色示意图；M为DL2000DNAMarker，DL2000DNAmarker从上至下条带大小依次是2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1至42号分别代表不同品种的茄子PCR扩增产物检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记，缺失的片段为SEQ ID NO:1(GCTTTACATAAGCACCAAGG)所示。
在本发明中，所述InDel分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(AGAGAAAGCACCCC ACTTGCAACATTATTAAATTCCAGATTCCCTGT TGCGAACCAAAATATCTTGAGAAAAAACTTGGATATCCAAAAACTTGC TCTCTTTTCATAGTGGAAACCCAAATAATTGCACAAAAAAGTGAAACAAACAAGAAAGCAATGTTTAATAACAAAGGT[GCTTTACATAAGCACCA AGG/-]ATGTGACCAAGTAGTCCCTAAAGCGAGAAAAAGACTCGCGA，其中[]内为插入缺失位点的序列差异，-表示缺失，下划线处序列为扩增引物位置)所示。在紫色果皮的茄子基因组中包含GCTTTACATAAGCACCAAGG(SEQ IDNO:1)序列，在绿色果皮的茄子基因组中缺失GCTTTACATAAGCACCAAGG(SEQ ID NO:1)序列。
本发明提供了一种用于扩增所述InDel分子标记的引物，包括核苷酸序列如SEQID NO:3(AGAGAAAGCACCCCACTTGC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(TCGCGAGTCTTTTTCTCGCT)所示的反向引物。所述引物的PCR扩增产物为SEQ ID NO:2所示的InDel分子标记。
本发明提供了一种用于鉴定茄子果皮颜色的检测试剂盒，包括所述引物和PCR扩增反应试剂。
在本发明中，所述PCR扩增反应试剂优选包括2×HieffPCRMasterMix。
本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物或所述检测试剂盒在检测或鉴别茄子果皮颜色或茄子育种中的应用。
在本发明中，所述检测或鉴别茄子果皮颜色的方法，优选包括以下步骤：
采用所述引物进行PCR扩增待测样本的InDel分子标记的DNA片段，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物的长度进行分析，根据PCR扩增产物的长度判断茄子果皮颜色：
若所述PCR扩增产物的长度仅为214bp时，判断待测样本的茄子果皮颜色为绿色；
若所述PCR扩增产物的长度仅为234bp时，判断待测样本的茄子果皮颜色为紫色；
若所述PCR扩增产物的长度包括214bp和234bp时，判断待测样本的茄子果皮颜色为紫色。
在本发明中，所述待测样本包括茄子苗期材料的叶片。
在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选为94℃5min；94℃30sec，5256℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。所述PCR扩增的反应体系优选为2×HieffPCRMasterMix5μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、基因组DNA0.4μL，无菌去离子水补充至10μL。
所述PCR扩增产物的长度进行分析的方法优选包括电泳和/或测序。所述电泳优选包括8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在本发明中，选择目标果皮颜色的茄子用于后续茄子育种。本发明对所述茄子育种的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的作物育种方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
茄子果皮颜色遗传群体的构建和DNA提取
(1)群体构建
本发明实施例中使用茄子品种QD(绿色果皮茄子)和8G(紫色果皮茄子)为亲本，在春秋大棚进行杂交(正交)和自交，配制成遗传群体，即Pl(QD)、P2(8G)和F2。遗传群体同时定植于大棚，不分离世代P1、P2、Fl各种30株，分离世代F2种404株，常规栽培管理。
遗传群体的茄子到达商品成熟期后收获进行鉴定。根据茄子种质资源描述规范，每株采收两个达到商品成熟、符合品系特征且发育正常的对茄，于深色背景板上拍摄果实照片，室内进行比色分级。根据供试材料亲本及F2群体果皮颜色分离表现，将茄子种质资源描述规范定为绿色和紫色两类。
(2)DNA提取
亲本绿果皮茄子QD和紫果皮茄子8G分别取3个单株混合样提取DNA；从F2代中随机挑取25份绿色果皮植株(F2代中资源描述规范定为绿的株系)，一起构成绿色果皮子代混池H1，从F2代中随机挑取25份紫色果皮茄子(F2代中资源描述规范定为紫的株系)，一起构成紫色果皮茄子子代混池H2；共计4个样本池。
利用CTAB法提取以上四个样本池的叶片总DNA，具体步骤如下：取0.1克新鲜子叶，经液氮研磨或者钢珠打碎、2×CTAB裂解液裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀和70％乙醇洗涤等过程，最终DNA沉淀溶解于20μLTE溶液。用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。
实施例2
高通量测序寻找紫色果皮茄子关联区域
(1)高通量测序：利用IlluminaNovaSeq测序平台对提取的亲本池QD、8G，以及茄子绿色果皮子代混池H1、茄子紫色果皮子代混池H2进行双端测序。
(2)测序原始序列处理：将高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(basecalling)分析，转化为原始测序序列(rawdata)。然后根据一定的规则，对测序得到的原始测序序列进行过滤处理，主要标准如为：1)采用AdapterRemoval去除3’端的接头污染；2)采用滑动窗口法进行质量过滤，窗口大小设置为5bp，步长设置为1bp。每一次往前移动一个碱基，取5个碱基计算窗口的平均Q值，若最后一个碱基的Q值≤2，则仅保留该位置之前的碱基；若窗口的平均Q值≤20，则仅保留该窗口倒数第二个碱基及之前的碱基；3)若双末端中任意一条reads的长度≤50bp，则去除该双末端reads。
(3)SNP位点检测：将过滤之后得到的clean reads，比对到参考基因组(ChinaNational GenBank accession No.CNP0000734)，并利用GATK软件对四个样本(QD、8G、H1和H2)进行SNP检测，然后用ANNOVAR软件对四个样本检测到的SNP位点的位置信息、类型进行注释。
(4)目标性状关联区域定位：根据质量值、深度、重复性等对全基因组中所有的潜在多态性SNP位点进行进一步的过滤，从而得到高质量的可信SNP位点。然后通过ED算法(见公式I)将目标性状关联到基因组的相关区域。计算混池中等位基因频率差异得到ED值，越大的ED值代表该突变位点与目标性状的关联程度越高。
其中每个字母(A、T、C、G)表示对应的核苷酸频率，mut表示突变型，wt表示野生型。同时为了减小误差以及降低噪声的影响，将ED值提高到它的四次幂(ED4，Euclideandistanceraisedtothefourthpower)，最后利用Loessfit进行统计学散点平滑处理，峰值高的地方就是目标基因所在的位置(图1)。
实施例3
InDel分子标记引物的筛选与检测方法
(1)从亲本和F1代中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。将引物溶解后，对亲本DNA进行PCR扩增。反应体系见表1：
表1
(2)PCR扩增程序见表2
表2
(3)聚丙烯酰胺电泳、成像与分析：制备浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶：量取18ml的30％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(30％Acr-Bis，29：1)，36ml的无菌水，13.5ml的5×TBE缓冲液，600μl的10％APS，25μl的TEMED，混合后灌入制胶玻璃板。待凝胶完全凝固后，放入垂直电泳槽中，取2μl待测PCR产物加入凝胶点样孔中，接通电源进行电泳，电泳条件为：电泳仪电压150V，电流100～200A，电泳时间1小时10分钟。然后将凝胶从玻璃板中取出，放入600ml渗透液中(1.2g硝酸银，600ml蒸馏水)，摇晃15min后取出，在清水中漂洗两次，每次30秒，再放入600ml显色液中(9.6g氢氧化钠，6.48ml甲醛，600ml蒸馏水)，摇晃1-3min，直到能清楚看到Marker条带。最后蒸馏水清洗，拍照。观察样本条带位置差异。
(4)引物多态性鉴定：以亲本QD和8G的DNA为模板，通过PCR扩增17对引物的片段，电泳检测条带大小，发现有1对引物扩增片段产物呈现稳定的多态性(图2，图3)。
(5)引物多态性鉴定：以亲本QD和8G的DNA为模板，通过PCR扩增17对引物的片段，电泳检测条带大小。在这17对引物中，ID5881、ID6006、ID0671和ID5442扩增有条带但缺乏多态性；ID5850和ID1299扩增具有多态性；其余引物扩增后无条带或条带微弱(表3，图2，图3)。选择引物ID1299进行后续验证。
(6)茄子紫色果皮InDel分子标记的验证：以不同果皮颜色的茄子为材料，进一步验证选择的呈现多态性的1对引物，以判断扩增产物片段多态性是否与果皮颜色相关。最终发现，引物扩增片段产物的多态性，与茄子果皮颜色连锁性较好。
表3标记引物序列表2010.2
注：下划线为多态性引物。
实施例4
InDel分子标记在茄子果皮颜色甄别中的适用性鉴定
选择不同颜色果皮(绿色和紫色)的茄子材料共计42份，这些材料均为本科室搜集不同地方来源的品种资源，这些材料与本发明中的亲本材料具有不同的遗传背景，这些材料可作为测试该引物是否均有普遍适用性的供试材料。对本发明的InDel分子标记进行验证。利用CTAB法提取上述茄子叶片的基因组DNA，将ID1299分子标记对应的引物用于PCR扩增，对PCR扩增产物进行片段大小鉴定。
(1)田间资源描述结果表明：
1-6、17、21、23、24、28号共11个样本为绿色果皮茄子；
7-16、18-20、22、25-27、29-42号共31个样本为紫色果皮茄子。
(2)ID1299InDel标记检测显示：
从图4可以看出：
1)在绿色果皮茄子中，该InDel分子标记在11个样本中均能够得到214bp的特有条带，全部与分子标记结果一致。
2)在紫色果皮茄子中，该InDel分子标记在31个样本中均能够得到234bp的条带，其中37号样本为杂合型，具有214bp和234bp的条带。
在这个实施案例中，本发明开发出检测茄子果皮颜色的分子标记ID1299对于果皮颜色甄别的准确率高达100％(表4；42份材料中所有田间资源性状观测结果与分子标记检测结果一致)，且可以从分子水平，在苗期进行鉴定，不仅节约生产成本，而且操作简便等特点，能够对茄子果皮颜色进行有效地检测，可用于果皮颜色相关茄子的选育。
表4利用InDel分子标记鉴别茄子果皮颜色的数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种与茄子果皮颜色性状紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：AGAGAAAGCACCCCACTTGCAACATTATTAAATTCCAGATTCCCTGTTGCGAACCAAAATATCTTGAGAAAAAACTTGGATATCCAAAAACTTGCTCTCTTTTCATAGTGGAAACCCAAATAATTGCACAAAAAAGTGAAACAAACAAGAAAGCAATGTTTAATAACAAAGGT[GCTTTACATAAGCACCAAGG/-]ATGTGACCAAGTAGTCCCTAAAGCGAGAAAAAGACTCGCGA；
其中[]内为插入缺失位点的序列差异，-表示缺失；
在紫色果皮的茄子基因组中包含SEQ ID NO:1所示序列，在绿色果皮的茄子基因组中缺失SEQ ID NO:1所示序列。
2.权利要求1所述InDel分子标记在检测或鉴别茄子果皮颜色或茄子育种中的应用。
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