CN112592998B - 一种用于葡萄dna指纹图谱库构建的kasp引物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合及其应用，涉及指纹图谱技术领域；该引物组合基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出46个葡萄核心SNP标记设计得到，利用该套SNP标记组合建立DNA指纹图谱库，从而可以对葡萄品种进行聚类分析和品种鉴定，使得检测结果更精准、高效，基于该套引物组合标记首次有效区分出333份种质，是目前关于葡萄鉴定出的最大群体数。此外，本发明中提供的KASP引物组合在DNA质量满足一般KASP反应或常规PCR反应需求的情况下，对葡萄品质检测的准确度和分辨率均很高，检测效率是SSR标记的10‑20倍，检测成本与SSR标记相当，同时检测过程中无需使用丙烯酰胺等有毒化学试剂。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合及应用。
背景技术
葡萄，作为我国最重要的果树树种之一，既可以鲜食，又可以酿酒、制干、制汁和制罐。截止2018年底，全球葡萄栽植面积(包括酿酒葡萄、鲜食葡萄和制干葡萄)达到了744.9万公顷，产量达7780万吨，其中中国的葡萄种植面积(87.5万公顷)位居世界第二，产量(1170万吨)排名世界第一(http://www.oiv.int/en/)，葡萄产业已经成为我国重要产业和农民增收致富的支柱产业。然而，由于葡萄的无性繁殖能力强，适栽范围广，葡萄品种间交流频繁，难免发生同物异名或同名异物等现象。加之，当前葡萄苗木市场管理不够完善，随意更改品种名称、炒作品种等不良影响时有发生，极大损害了育种家的利益，因此，寻找一种经济、高效、准确的品种鉴别方法，对于提高我国葡萄种质资源的管理效率和品种保护能力具有重要意义。
近年来，DNA分子标记以具有周期短、不受环境影响、可实现高通量检测等优点，为葡萄品种鉴定提供了新的手段。其中SSR(simple sequence repeat)和SNP(singlenucleotide polymorphism)分子标记已被国际植物新品种权保护联盟(UPOV)BMT分子测试指南和国内《植物品种鉴定DNA指纹方法总则》(NY/T2594-2016)定为优先推荐的两种标记方法。目前，国内已研发出一套用于中国葡萄品种鉴定的30个SSR标记体系，并利用其中8个引物区分国内290个葡萄品种。但因SSR标记数量和检测通量有限、检测成本偏高、数据读取费时耗力等因素，限制了更大范围的葡萄品种鉴定工作。而SNP分子标记作为最新一代标记，具有数量多、具二态性、稳定遗传等优点，加上各种SNP高通量检测平台的出现，可以很好弥补SSR标记的技术缺陷，已在生物学、农业、医学和生物进化等领域得到了广泛应用。其中，LGC公司推出的KASP(kompetitive allele specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)技术，以具有更加高效、灵活、准确、低成本的优势特点，在国内外得到广泛应用。小麦、玉米、水稻、棉花、甘蓝、黄瓜等作物上已利用KASP技术获得的核心标记体系，为相应作物的品种鉴定和品种保护等工作做出重要贡献。而SNP标记在葡萄的品种鉴定应用中，目前主要使用成本较高的基因芯片和测序技术进行检测，如Cabezas等已构建了针对欧亚种葡萄的SNP鉴定体系，并确定了48个SNP为鉴定品种的标准位点；Laucou等基于18K SNPs葡萄基因芯片对945份材料筛出14个高多态性SNP标记用于欧洲地区栽培种鉴定。值得注意的是，国际上选出的SNP标记只在二倍体欧亚种中得到应用，而我国主栽的葡萄含有较多的多倍体品种。在国内，李贝贝等和Liang等利用不同重测序技术获得上万个SNP位点分别对304份和472份葡萄种质进行了遗传多样性分析，虽然有对多倍体葡萄品种进行遗传分析，但没有筛选出用最少的SNP位点组合来鉴别葡萄品种的具体结果。而在实际的葡萄品种鉴定工作中，研究者希望用最少的位点区分更多的样本，以达到高效、准确、廉价的鉴定目的，综合比较认为KASP技术更适合初期的SNP分子标记开发。
但是至今位置，并未有研究利用KASP技术筛选出一套能够鉴别中国葡萄品种的核心KASP标记，并构建葡萄品种指纹图谱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合及应用，从而解决现有技术中存在的前述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合，所述引物组合序列为SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:138。
本发明的另一目的是提供一种葡萄DNA指纹图谱库，所述葡萄DNA指纹图谱库包括用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合。
本发明的第三个目的是在于提供一种用于构建葡萄DNA指纹图谱库的方法，包括以下步骤：
S1，提取所有待测实验品种葡萄基因组DNA；
S2，采用基因测序技术对提取得到的基因组DNA进行测序，同时采用SNP标记法进行基因筛选，筛选出高质量SNP位点；
S3，根据筛选出的高质量SNP位点设计合成出KASP引物组合，用设计出的KASP引物组合进行PCR扩增；
S4，对PCR扩增产物进行检测。
优选地，步骤S1中所有实验品种普通包括348份葡萄种质，具体为215份欧亚种、95份欧美杂种、25份美洲种、8份欧山杂种、2份山葡萄种、2份刺葡萄种、1份毛葡萄。
优选地，步骤S2中具体包括：
S21,使用简化基因组测序技术对304份葡萄种质进行测序，获得多态性SLAF标签；
S22,对获得的多态性SLAF标签进行分析，得到群体SNP标记，然后通过五次特异性筛选，筛选出高质量SNP位点。
优选地，步骤S22中的五次特异性筛选具体包括：
(1)筛选出SNP位点在所有葡萄种质中的基因型缺失率<0.05的SNP位点，完成第一次筛选；
(2)依据筛选之后的SNP位点对应的次要等位基因频率>0.05，完成第二次筛选；
(3)基于第二次筛选之后的SNP位点对应的最小等位基因频率>0.3，完成第三次筛选；
(4)对第三次筛选之后的SNP位点进行重新测序，筛选出单个SNP位点平均测序深度>＝10×，完成第四次筛选；
(5)使用第四次筛选后的SNP位点前后各100bp序列同葡萄参考基因组比对后，根据特异性完成第五次筛选。
此处参考基因组采用https://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Gene在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastS earch&LINK_LOC＝blasthome)上进行同参考基因组比较，使用的Standarddatabases为RefSeq Representative genomens(refseq_representative_genomens)，Organism为wine grape(taxid:29760)。
优选地，步骤S3中PCR扩增过程中PCR反应体系包括KASP Master mix 5μL、KASPPrimer mix 0.14μL和模板DNA(50ng·μL-1)5μL；
反应条件如下：预变性94℃15min；梯度降温扩增94℃20s、61℃60s 10个循环、每循环-0.6℃、72℃30s；一般性扩增94℃20s、55℃60s 26个循环、72℃30s。
本发明还提供了葡萄DNA指纹图谱库在葡萄种质资源遗传分析、聚类分析、品种鉴别和葡萄分子育种中的应用。
一种葡萄品种鉴定方法，包括以下步骤：
A1获得待测葡萄的DNA；
A2确定获得的DNA中的46个SNP位点的基因，与指纹图谱库中所有的葡萄品种基因进行对比；
A3若待测葡萄的指纹图谱与所述的葡萄指纹图谱中任意一种葡萄的比对结果不一致，则待测葡萄为新品种，并将该新品种添加进指纹图谱库中。若待测葡萄的的指纹图谱与某一种葡萄的比对结果完全一致，则还需要进行其他信息比对才能判断是否为同一品种，其他信息比对包括产地、形状、口感等。
一种葡萄品种聚类分析方法，包括以下步骤：
B1分别提取待进行类群划分的所有葡萄品种基于46个SNP位点的基因组DNA；
B2利用PowerMarker的邻接算法计算葡萄种质的遗传距离，构建聚类图，对葡萄进行聚类分析。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合及其应用，该引物组合基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出46个葡萄核心SNP标记设计得到，利用该套SNP标记组合建立DNA指纹图谱库，从而可以对葡萄品种进行聚类分析和品种鉴定，使得检测结果更精准、高效，基于该套引物组合标记首次有效区分出333份种质，这是我国目前关于葡萄鉴定出的最大群体数。
此外，本发明中提供的KASP引物组合在DNA质量满足一般KASP反应(或常规PCR反应)需求的情况下，对葡萄品质检测的准确度和分辨率均很高，检测效率是SSR标记的10-20倍，检测成本与SSR标记相当，同时检测过程中无需使用丙烯酰胺等有毒化学试剂。
附图说明
图1是实施例2中针对VIT_6_1032391(A)、VIT_13_15071171(B)KASP标记荧光检测结果；
图2是实施例2中46个KASP标记在染色体上分布情况示意图
图3是实施例3中有效鉴定333个葡萄种质的KASP累计分子标记效率；
图4是实施例4中针对中国348个主要葡萄品种进行聚类分析得到的聚类图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合，所述引物组合序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:138，其具体位置和序列组成如下表中所示：
上述表格中的引物名称由“VIT_SNP所在的染色体号_SNP对应的具体位置”组成。
实施例2
本实施例提供一种包含实施例1中记载的用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合的葡萄DNA指纹图谱库，且该指纹图谱库的构建方法包括以下步骤：
S1，提取所有实验品种葡萄基因组DNA，本实施例中一共304种；
S2，采用基因测序技术对提取得到的基因组DNA进行测序，同时采用SNP标记法进行基因筛选，筛选出高质量SNP位点；
S3，根据筛选出的高质量SNP位点设计合成出KASP引物组合，用设计出的KASP引物组合进行PCR扩增；
S4，对PCR扩增产物进行检测。
其中，对于所有实验品种葡萄，本实施例中采用了348份葡萄种质，具体为215份欧亚种、95份欧美杂种、25份美洲种、8份欧山杂种、2份山葡萄种、2份刺葡萄种、1份毛葡萄，具体分类如下表所示：
提取DNA的方法具体为采用爱森生物科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，提取葡萄叶片DNA，采用NanoDrop 1000spectrophotometer(Themo)紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度(OD260mm/OD280mm＝1.7-2.1)，并用超纯水将浓度稀释至50ng·μL-1，按编号装入96孔PCR板中，用于高通量扩增检测。
步骤S2中，本课题组使用简化基因组测序技术(SLAF-seq)对所有实验葡萄种质进行测序(每个样品的平均测序深度为8.09×)，共开发466 618个SLAF标签，其中多态性SLAF标签有392 374个。通过对多态性SLAF标签进行分析，共获得4241 729个群体SNP标记。我们基于这4 241 729个SNP，依次以(1)SNP位点只在染色体上的DNA链上前后大于50bp序列保守，且具有二态性，SNP位点在304份葡萄种质中的基因型缺失率(Missing rate)<0.05，筛选出11813个SNP；(2)SNP位点对应的次要等位基因频率(MAF)>0.05，筛选出6221个SNP；(3)SNP位点对应的MAF>0.3，筛选出1237个SNP；(4)对第三次筛选之后的SNP位点进行重新测序，筛选出单个SNP位点平均测序深度>＝10×，完成第四次筛选，筛选出616个SNP；(5)对筛选出的616个SNP位点前后各100bp序列同葡萄参考基因组比对后，具备特异性，共筛选出517个高质量SNP位点。
此处参考基因组采用https://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Gene在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastS earch&LINK_LOC＝blasthome)上进行同参考基因组比较，使用的Standarddatabases为RefSeq Representative genomens(refseq_representative_genomens)，Organism为wine grape(taxid:29760)。
步骤S3中，从Ensemblplants网站下载筛选出的517个高质量SNP位点前后各100bp的葡萄DNA序列(https://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Gene)，设计合成引物。
在设计引物时，为保证引物的质量和退火温度尽可能的一致，本实施例中要求两条正向引物链变性温度在62.5℃左右，两条链前后温差不超过1℃，GC含量在50～55％；反向链变性温度在66℃，GC含量不超过60％的条件。最终517个SNP位点中，能成功设计KASP标记的SNP位点有442个，转化率为85.49％。
为节约成本，使用北京农科院蔬菜改良中心提供的Perl语言程序，在保证每条染色体上都有的前提下，基于442个SNP在测序的304份葡萄种质的基因型数据，计算出一组仅用27个SNP位点就能完全区分所有试验葡萄种质的标记组合。
为充分利用前人研究进展，我们将课题组前期筛选出的22个优质KASP标记也作为复筛标记的一部分，即共使用49个KASP标记对348份葡萄种质进行基因分型，检验49个标记的可靠性和稳定性。
在进行PCR扩增时，采用的PCR反应体系为KASP Master mix 5μL、KASP Primermix 0.14μL和模板DNA(50ng·μL-1)5μL，一共10.14μL；采用的PCR反应条件如下表所示：
经过PCR扩增后的扩增产物使用荧光微孔板检测仪检测，然后用LGC公司开发的SNP viewer 2.0软件读取检测数据。若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
步骤S4中进行PCR产物检测，具体过程为：
待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断348个葡萄种质基于每个SNP位点的基因型。
采用的具体的判断原则如下：如果某供试葡萄种质基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试葡萄种质基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试葡萄种质基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试葡萄种质基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试葡萄种质基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试葡萄种质基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。
最终，VIT_4_7279466、VIT_15_1706929、VIT_16_13454358三个标记因在检测348份葡萄种质时，没有较好的分型结果，将其舍弃，最终获得46个具有较好的荧光分型结果的SNP位点标记。
实施例3
本实施例提供一种葡萄品种鉴别的方法，包括以下步骤：
A1，获得待测葡萄的DNA；
A2，确定获得的DNA中的46个SNP位点的基因，与实施例2中记载的指纹图谱库中所有的葡萄品种基因进行对比；
A3，若待测葡萄的的指纹图谱与所述的葡萄指纹图谱中任意一种葡萄的比对结果不一致，则待测葡萄为新品种，并将该新品种添加进指纹图谱库中；若待测葡萄的的指纹图谱与所述的葡萄指纹图谱中某一种葡萄的比对结果完全一致，则还需要进一步比对才能判断待测葡萄是否为该品种葡萄；
进一步比对的过程包括比对产地、外形和口感等内容。
为了证明本发明中提供的指纹图谱库中采用的KASP标记的鉴定能力，本实施例中对46个KASP标记检测348份种质的基因型数据进行鉴定效率分析。通过基因型数据比对，发现348份种质中有26份种质分为11组对应的基因型一致，分别为‘早夏香’‘润堡早夏’和‘三本提葡萄’(同为夏黑的芽变品种)、‘京亚’和‘洛浦早生’(芽变品种)、‘茉莉香’和‘早茉莉’(疑似同物异名)、‘尼加拉’和‘贵州水晶’(疑似同物异名)、‘泽香’和‘泽玉’(疑似同物异名)、‘昌黎百年马奶’‘百年宣化白牛奶’和‘马奶’(疑似同物异名)、‘西营’‘白无核’和‘无核白’(疑似同物异名)、‘雷司令’和‘雷司令237/SO4’(无性系群体)、‘赤霞珠ISV-FV5’‘赤霞珠R5’和‘赤霞珠(a1)’(无性系群体)、‘110♀(兰州引)’和‘101-14♀’(无性系群体)、‘高妻’和‘先锋’(均有巨峰的遗传特征)。去除一致的基因型种质后，使用Perl语言程序，最终计算出一组仅用25个标记就能完全区分333份种质，鉴定效率达到了95.69％，如图3所示。
实施例4
本实施例提供一种葡萄品种聚类分析方法，该方法基于实施例2中的葡萄DNA指纹图谱库，包括以下步骤：分别提取待进行类群划分的所有葡萄品种基于46个SNP位点的基因组DNA；本实施例中待进行类群划分的所有葡萄品种为实施例2中所记载的348种葡萄品种。利用PowerMarker V3.25软件的邻接算法(Neighbor-joining)计算葡萄种质的遗传距离，并用Figtree v1.4.4构建聚类图，进行聚类分析。得到的聚类图如图4所示。结果表明，46个引物组可以将348个葡萄种质有效划分为两大类。
通过采用本发明公开的上述技术方案，得到了如下有益的效果：
本发明公开了一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合及其应用，该引物组合基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出46个葡萄核心SNP标记设计得到，利用该套SNP标记组合建立DNA指纹图谱库，从而可以对葡萄品种进行聚类分析和品种鉴定，使得检测结果更精准、高效，基于该套引物组合标记首次有效区分出333份种质，这是我国目前关于葡萄鉴定出的最大群体数。
此外，本发明中提供的KASP引物组合在DNA质量满足一般KASP反应(或常规PCR反应)需求的情况下，对葡萄品质检测的准确度和分辨率均很高，检测效率是SSR标记的10-20倍，检测成本与SSR标记相当，同时检测过程中无需使用丙烯酰胺等有毒化学试剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合及其应用
<160> 138
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgctgaaggt ttcttgaaaa agtactgat 49
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc ttccaatttt caattcattt aagagcatga c 51
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
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<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctacctcgga tctgaattga aactttgat 29
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gaaggtgacc aagttcatgc tgatgaatga ttgctaatta tattttagca tcta 54
<210> 23
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaaggtcgga gtcaacggat tatgaatgat tgctaattat attttagcat ctc 53
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gtctgattgt gatttatctg tggacgttaa 30
<210> 25
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gaaggtgacc aagttcatgc ttgtcttgac tcatcatatt tgacagca 48
<210> 26
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gaaggtcgga gtcaacggat ttgtcttgac tcatcatatt tgacagct 48
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ggtgtgaaga cgataatggg tccaat 26
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gaaggtgacc aagttcatgc tgcaagtcga gctctctgtc cg 42
<210> 29
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gaaggtcgga gtcaacggat tagcaagtcg agctctctgt cca 43
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ggcttatatt ggagataaag gagtcaactt 30
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gaaggtgacc aagttcatgc tttctggcct ttgaaccgcc cta 43
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gaaggtcgga gtcaacggat tttctggcct ttgaaccgcc ctt 43
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
agtaggagag aaaagcctca attgtcaa 28
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gaaggtgacc aagttcatgc tcaacttcac ggtgaccgaa ttcata 46
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gaaggtcgga gtcaacggat taacttcacg gtgaccgaat tcatc 45
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ggtcgacggc agccacaggt tt 22
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gaaggtgacc aagttcatgc taggtggttg tgctgagatg gca 43
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gaaggtcgga gtcaacggat taggtggttg tgctgagatg gct 43
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
agtgagaaat acaaggcaga tggtctat 28
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gaaggtgacc aagttcatgc ttattcctac ctgcgtttcg tcga 44
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gaaggtcgga gtcaacggat tattcctacc tgcgtttcgt cgc 43
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ctgtggcccg gtggggctt 19
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gaaggtgacc aagttcatgc tgactgaatt aggggggttt ggg 43
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gaaggtcgga gtcaacggat tcgactgaat taggggggtt tgga 44
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cgtggtcatc catgttattg gaagcta 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gaaggtgacc aagttcatgc ttgttattga acaatcagtg agttgggt 48
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gaaggtcgga gtcaacggat tgttattgaa caatcagtga gttgggc 47
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
atggtgcaac aagtaccatt tttttatgct t 31
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gaaggtgacc aagttcatgc tggatgtgat gtaggggtcc ttgt 44
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gaaggtcgga gtcaacggat tgatgtgatg taggggtcct tgg 43
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
catatcacct tttctaggac taaaacccaa 30
<210> 52
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gaaggtgacc aagttcatgc tctgtattaa agctcttggg tgaaaaact 49
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gaaggtcgga gtcaacggat ttgtattaaa gctcttgggt gaaaaacg 48
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
attgttgggc acaaatacgc tcaagatt 28
<210> 55
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gaaggtgacc aagttcatgc tgttcaacca aagcctaaca atagatcat 49
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gaaggtcgga gtcaacggat tttcaaccaa agcctaacaa tagatcac 48
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gggttgaggt aggtattgta actctttttt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gaaggtgacc aagttcatgc tgcacaacaa tttctccagc ttcgtt 46
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gaaggtcgga gtcaacggat tcacaacaat ttctccagct tcgtc 45
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
agaaatggac tcacgtaggt gttaagtt 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
gaaggtgacc aagttcatgc ttctgcttga gggggagtga caa 43
<210> 62
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gaaggtcgga gtcaacggat tctgcttgag ggggagtgac ag 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
tagtggaaac atctcccact tgattcata 29
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
gaaggtgacc aagttcatgc tccatttttt gacttttggg tttactttgt t 51
<210> 65
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
gaaggtcgga gtcaacggat tccatttttt gacttttggg tttactttgt a 51
<210> 66
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
taggatgata aagaggacag catcaataaa a 31
<210> 67
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
gaaggtgacc aagttcatgc tgacatgttt ccatactgat cctccta 47
<210> 68
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gaaggtcgga gtcaacggat tacatgtttc catactgatc ctcctg 46
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ctggacattt tcaaccatga tgatgatgat 30
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
gaaggtgacc aagttcatgc taaggagagc atttggttct cttcc 45
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
gaaggtcgga gtcaacggat tgaaggagag catttggttc tcttca 46
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
cccaatgaaa gctccatcaa atccataat 29
<210> 73
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
gaaggtgacc aagttcatgc tatcttctac tcatcgtttt ccttccaa 48
<210> 74
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
gaaggtcgga gtcaacggat tcttctactc atcgttttcc ttccac 46
<210> 75
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tatataaata atagtaagaa aaatgaggga aggaa 35
<210> 76
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
gaaggtgacc aagttcatgc tgtccagttg tggatttctc agcaa 45
<210> 77
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
gaaggtcgga gtcaacggat ttccagttgt ggatttctca gcag 44
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
aagggctctt cttccctctc ttgtt 25
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gaaggtgacc aagttcatgc ttggatgcac ggatcattgc tcc 43
<210> 80
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gaaggtcgga gtcaacggat ttggatgcac ggatcattgc tcg 43
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
caaaatcttc ttacggtcta tgattatgag aat 33
<210> 82
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gaaggtgacc aagttcatgc taaaaagaaa agggaaaaca aaaaactact cc 52
<210> 83
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
gaaggtcgga gtcaacggat taaaaaaaga aaagggaaaa caaaaaacta ctct 54
<210> 84
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gatttcattg attagttggg tttggtttga a 31
<210> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
gaaggtgacc aagttcatgc ttcctccgct tctccgccc 39
<210> 86
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
gaaggtcgga gtcaacggat ttcctccgct tctccgccg 39
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
aaaatcttgc gggcgtagtc gagat 25
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
gaaggtgacc aagttcatgc tgcgtgccgg ttgaaattga atttatg 47
<210> 89
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
gaaggtcgga gtcaacggat tgcgtgccgg ttgaaattga atttatt 47
<210> 90
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
ggtttccatg ttttaactct caaaagacaa attt 34
<210> 91
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
gaaggtgacc aagttcatgc tggtccctca cctattactc cag 43
<210> 92
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
gaaggtcgga gtcaacggat tcggtccctc acctattact ccaa 44
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
tttcggacat ggaaagcttg agtttctt 28
<210> 94
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
gaaggtgacc aagttcatgc ttgagtcaat ctcgccgaat atgagt 46
<210> 95
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
gaaggtcgga gtcaacggat tagtcaatct cgccgaatat gagc 44
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
aaactcaaga ttggacagca atatccatat t 31
<210> 97
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
gaaggtgacc aagttcatgc tttacaacag acgctttctc catgg 45
<210> 98
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gaaggtcgga gtcaacggat tgttacaaca gacgctttct ccatga 46
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
gtagggttgt cagattagga gggaaa 26
<210> 100
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
gaaggtgacc aagttcatgc tcgtccggat gcattgcgcc t 41
<210> 101
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
gaaggtcgga gtcaacggat tgtccggatg cattgcgccc 40
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
ggcaaacgct gattggctgg agta 24
<210> 103
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gaaggtgacc aagttcatgc tggatttatg gaggaaacaa agaaaactg 49
<210> 104
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
gaaggtcgga gtcaacggat tggatttatg gaggaaacaa agaaaacta 49
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
ctgctggaac tgccggtcat tgat 24
<210> 106
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
gaaggtgacc aagttcatgc ttggagggta aaaatgaact caatttgac 49
<210> 107
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
gaaggtcgga gtcaacggat tattggaggg taaaaatgaa ctcaatttga t 51
<210> 108
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
cctttctgat gatagaagca gtgggaa 27
<210> 109
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
gaaggtgacc aagttcatgc ttgttgcagc agataatgca tacgac 46
<210> 110
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
gaaggtcgga gtcaacggat tatgttgcag cagataatgc atacgaa 47
<210> 111
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
cacacttcta ttttatcatc agcaccttta tt 32
<210> 112
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
gaaggtgacc aagttcatgc tgataagtcc aggatccaga gcc 43
<210> 113
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
gaaggtcgga gtcaacggat taaagataag tccaggatcc agagct 46
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
tatgggagtg gccatgttac tccta 25
<210> 115
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
gaaggtgacc aagttcatgc tgttcaagct gggggagaat atatac 46
<210> 116
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
gaaggtcgga gtcaacggat tggttcaagc tgggggagaa tatatat 47
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
gtcggagtcc atgtatcgcc gtta 24
<210> 118
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
gaaggtgacc aagttcatgc tgctgaacac actttttcca agttcg 46
<210> 119
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
gaaggtcgga gtcaacggat taagctgaac acactttttc caagttca 48
<210> 120
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
ggtttgggag gggacaaaga tctaatt 27
<210> 121
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
gaaggtgacc aagttcatgc taaaatctcc agggcctttc atcaca 46
<210> 122
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
gaaggtcgga gtcaacggat tatctccagg gcctttcatc acg 43
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
ctgatttggc aggctgcact tacta 25
<210> 124
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
gaaggtgacc aagttcatgc tactaaaatc tcccacagct tcctca 46
<210> 125
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
gaaggtcgga gtcaacggat ttaaaatctc ccacagcttc ctcg 44
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
ggtcatgatt acgagccaca taaattacta 30
<210> 127
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
gaaggtgacc aagttcatgc tacccaatgg aatcgatcca atgtca 46
<210> 128
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
gaaggtcgga gtcaacggat tccaatggaa tcgatccaat gtcg 44
<210> 129
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
ctggttaatt tcagacgaag ccaagtata 29
<210> 130
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
gaaggtgacc aagttcatgc taccattcgt ccaaatgcca aaaaacta 48
<210> 131
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
gaaggtcgga gtcaacggat taccattcgt ccaaatgcca aaaaactt 48
<210> 132
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
caactcgtgt tacctttatt caggaacaa 29
<210> 133
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
gaaggtgacc aagttcatgc tcaatgtgta ttacttcagt tttgaactca a 51
<210> 134
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
gaaggtcgga gtcaacggat taatgtgtat tacttcagtt ttgaactcag 50
<210> 135
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
ctgtcaaaag attccagaca aggactta 28
<210> 136
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
gaaggtgacc aagttcatgc tggtcttcat ccaagatatg tatctcatt 49
<210> 137
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
gaaggtcgga gtcaacggat tggtcttcat ccaagatatg tatctcata 49
<210> 138
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
catacgatta aatggatgcg ggcagtt 27
Claims (2)
1.一种用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合，其特征在于，所述引物组合序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:138。
2.权利要求1所述的用于葡萄DNA指纹图谱库构建的KASP引物组合在葡萄种质资源遗传分析、聚类分析、品种鉴别和葡萄分子育种中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011527841.XA CN112592998B (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种用于葡萄dna指纹图谱库构建的kasp引物组合及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011527841.XA CN112592998B (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种用于葡萄dna指纹图谱库构建的kasp引物组合及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112592998A CN112592998A (zh) | 2021-04-02 |
| CN112592998B true CN112592998B (zh) | 2022-09-02 |
Family
ID=75199873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011527841.XA Active CN112592998B (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种用于葡萄dna指纹图谱库构建的kasp引物组合及应用 |
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997028278A1 (de) * | 1996-02-02 | 1997-08-07 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verwendung von primern für universelle fingerprint-analysen |
| CN108103238A (zh) * | 2018-03-02 | 2018-06-01 | 沈阳农业大学 | 山葡萄snp分子标记及在遗传图谱构建、白腐病抗性定位中的应用 |
| CN108998563A (zh) * | 2018-09-21 | 2018-12-14 | 南京农业大学 | 精确鉴定葡萄果皮颜色的引物及其应用 |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
| US7250296B2 (en) * | 2003-03-05 | 2007-07-31 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Nucleotide sequences of 2S albumin gene and its promoter from grape and uses thereof |
-
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- 2020-12-22 CN CN202011527841.XA patent/CN112592998B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Establishment and application of an SNP molecular identification system for grape cultivars;WANG Fu-qiang et al.;《Journal of Integrative Agriculture》;20220430;第21卷(第4期);第1044-1057页 * |
| 分子标记在山葡萄品种鉴定上的应用现状;宋慧芳等;《北方园艺》;20161231;第17卷;第188-192页 * |
Also Published As
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