CN113832246A - 一种基于mSNP技术检测甘蓝/花椰菜种子纯度的混样检测方法 - Google Patents
一种基于mSNP技术检测甘蓝/花椰菜种子纯度的混样检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于mSNP技术检测甘蓝/花椰菜种子纯度的混样检测方法，其利用引物对1F/R～19F/R进行，所述引物对1F/R～19F/R的基因序列见SEQ ID No.1～38；本发明采用mSNP技术，在扩增子不变的情况下，可以检测到更多的SNP变异；采用混样的方法进行检测，在减少扩增工作量的同时降低了测序成本，也加快了检测速度，可在一天时间内最多完成1440粒种子的检测。本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。
Description
技术领域
本发明属于种子纯度检测领域，具体涉及一种基于mSNP技术检测甘蓝/花椰菜种子纯度的混样检测方法。
背景技术
甘蓝(Brassica oleracea L.)是十字花科芸薹属甘蓝种，起源于地中海至北海沿岸，是国内普遍种植的一种蔬菜。花椰菜(Brassica oleracea L.)俗称菜花，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，不仅营养丰富，还具有清热解毒的功效。花椰菜自十九世纪从欧洲传入中国后，在我国已有二百多年的种植历史，在全国范围内均有种植。
种子纯度是品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示，是表示同一批种子品种一致性程度的高低。生产中目前推广的品种大多是一代杂交种，在制种过程中，存在亲本自交混入自交系籽粒、收获时混入其他品种籽粒或混入质量不合格的籽粒等造成种子纯度下降。各国对种子质量都极为关注，制定了一系列的检验规程和质量标准来保证种子的质量。种子纯度鉴定有常规鉴定法、电泳鉴定法和DAN分子标记鉴定法。常规鉴定包括对种子形态鉴定、发育期的形态特征和生物学特征鉴定等。该鉴定方法需要的时间较长、受人为主观和环境影响较高。电泳鉴定法是根据品种蛋白质结构的差异来揭示基因的差异，不同物种每一类蛋白质的种类、含量不同，在品种鉴定上大多是根据醇溶蛋白和球蛋白的多样性来进行区分。蛋白质电泳由于种子贮藏蛋白的种类较少、难以区分关系相近的材料。同工酶电泳与蛋白质电泳相比，酶带显现更为灵敏，但是对实验条件要求更严格、可用的同工酶有限等，所以电泳分析有时还需要结合其他分析结果进行判断。随着DNA分子标记技术的迅速发展，目前已经在作物种子纯度鉴定上有了广泛的应用。常见的DNA分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等。RFLP具有重复性好、共显性等优点，但每次检测到的多态性位点相对较少且成本昂贵。RAPD受实验条件的影响大、稳定性较差。AFLP具有RFLP的稳定性和PCR技术的高效性、重复性好、多态性好；但该分析标记对技术要求较高、提取的DNA纯度和内切酶的质量要求严格。SSR标记是共显性标记、多态性丰富、重复性好，但是需要对微卫星两端的保守序列进行寻找和分析，引物开发具有一定困难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于mSNP技术检测甘蓝/花椰菜种子纯度的混样检测方法，其高效、准确、成本低。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
技术方案一：
一种于mSNP技术的甘蓝和/或花椰菜种子纯度检测的引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；
所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQIDNo.1所示，R引物的序列如SEQIDNo.2所示；
所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQIDNo.3所示，R引物的序列如SEQIDNo.4所示；
所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQIDNo.5所示，R引物的序列如SEQIDNo.6所示；
所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQIDNo.7所示，R引物的序列如SEQIDNo.8所示；
所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQIDNo.9所示，R引物的序列如SEQIDNo.10所示；
所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQIDNo.11所示，R引物的序列如SEQIDNo.12所示；
所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQIDNo.13所示，R引物的序列如SEQIDNo.14所示；
所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQIDNo.15所示，R引物的序列如SEQIDNo.16所示；
所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQIDNo.17所示，R引物的序列如SEQIDNo.18所示；
所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQIDNo.19所示，R引物的序列如SEQIDNo.20所示；
所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQIDNo.21所示，R引物的序列如SEQIDNo.22所示；
所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQIDNo.23所示，R引物的序列如SEQIDNo.24所示；
所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQIDNo.25所示，R引物的序列如SEQIDNo.26所示；
所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQIDNo.27所示，R引物的序列如SEQIDNo.28所示；
所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQIDNo.29所示，R引物的序列如SEQIDNo.30所示；
所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQIDNo.31所示，R引物的序列如SEQIDNo.32所示；
所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQIDNo.33所示，R引物的序列如SEQIDNo.34所示；
所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQIDNo.35所示，R引物的序列如SEQIDNo.36所示；
所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQIDNo.37所示，R引物的序列如SEQIDNo.38所示。
进一步的，引物对1F/R～19F/R由mSNP技术获得。
技术方案二：
一种根据上述的引物组检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其包括如下步骤：
步骤1、选材：选取1个或多个甘蓝和/或花椰菜品种；每份甘蓝和/或花椰菜样品至少采用96粒种子；
步骤2、对甘蓝和/或花椰菜基因组DNA进行准确定量；
步骤3、将所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；
步骤4、以甘蓝和/或花椰菜基因组DNA为模板，用引物混合液分别对甘蓝和/或花椰菜的基因组DNA进行一轮PCR扩增，获得目标区域；
步骤5、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合；
步骤6、混合后的产物进行片段筛选；
步骤7、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；
步骤8、对消化后的产物进行纯化；
步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮PCR体系；
步骤10、对二轮PCR产物进行纯化，完成测序文库的制备；
步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；
步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；
步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。
进一步的，引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；
每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
进一步的，步骤3中，每个引物对中，合成的10条带有标签的正向引物中的标签序列分别如SEQIDNo.43～52所示；
每个引物对中，合成的10条带有标签的反向引物中的标签序列分别如SEQIDNo.53～62所示。
进一步的，每对引物对合成的10条带有标签的引物对中，正向引物和反向引物的标签组合方式选自表1中的任意一种或几种。
表1：标签组合方式
进一步的，步骤3中，引物对1F/R～19F/R中的F引物还包括F端通用引物，所述F端通用引物的序列如SEQIDNo.39所示；引物对1F/R～19F/R中的R引物还包括R端通用引物，所述R端通用引物的序列如SEQIDNo.40所示；
步骤9中、二轮PCR所用的Frimer F的序列如SEQIDNo.41所示；二轮PCR所用的Primer R的序列如SEQIDNo.42所示。
更进一步的，当甘蓝和/或花椰菜品种为多个时，所述Primer R的序列还包括用于区别甘蓝和/或花椰菜品种的条形码序列。
进一步的，步骤2中，每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
进一步的，在步骤1中，采用甘蓝和/或花椰菜种子基因组DNA提取试剂盒对甘蓝和/或花椰菜种子的基因组DNA进行提取。
进一步的，在步骤4中，所述一轮PCR扩增体系：引物混合液8μl；DNA用量100ng；3*T酶15μl；加水补足45μl；
所述一轮PCR扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
进一步的，在步骤6中，混合后的产物进行片段筛选，具体操作如下：
步骤6.1、加入一轮PCR体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
步骤6.2、加入一轮PCR体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.3、添加一轮PCR体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.4、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
在步骤7中，对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化，具体操作步骤为：
步骤7.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
步骤7.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的EP管中；
步骤7.3、向体系中加入Exo I 2μl，10×Reaction Buffer 2μl；
步骤7.4、消化体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min；
在步骤8中，对消化后的产物进行纯化的具体操作步骤为：
步骤8.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
进一步的，在步骤9中，所述二轮PCR体系：3*T酶10μl；Primer F；Primer R；H2O18μl；
所述二轮PCR程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min；
进一步的，在步骤10中，对二轮PCR产物进行纯化，利用的是0.80倍的磁珠，具体操作如下：
步骤10.1、加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.3、加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
步骤10.4、加入23μl Elution Buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清DNA溶液吸至一新的管中，获得测序文库；所述ElutionBuffer为10mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
mSNP技术：本发明采用mSNP技术，一个扩增子内对应多个SNP，最大限度的利用了每个扩增子片段所获得的的信息，可以在扩增子不变的情况下检测到尽量多的SNP变异。且这些SNP之间可构成单倍型，提高了变异的检测效率。这样不仅可以采用mSNP位点内和位点间的变异，而且还可以采用单倍型和SNP两种方式进行检测，使得遗传变异的检测更加精细，提高了标记鉴定的准确度和灵敏度。本专利中采用了19对引物对，实际检测到的变异信息有100多个，有助于筛选出更多的符合需求的多态性位点用于纯度鉴定分析。与常规SNP检测相比，减少了引物对数的使用，降低了成本。
成本低：采用mSNP技术，扩增子不变的情况下可以检测到更多的SNP变异；采用一轮扩增后至少96个测试样产物混样检测的方案，减少二轮扩增工作量的同时降低了测序成本。
高效：采用混样检测的方案，一轮扩增后至少96个检测样的产物混样进行后续的扩增和测序，可在一天时间内最多可完成1440粒种子的检测。与其他检测方法相比，操作简单，不用田间种植、不需要工作量大、检测难度大的实验操作等，可以快速进行种子纯度的检测工作。
准确：本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。
附图说明
图1是本发明混样检测方法的流程图。
具体实施方式
实施例1：特异性引物的获得方法
本发明特异性引物的获得方法，具体为：
利用甘蓝/花椰菜的全基因组重测序数据，采用BWA-mem(http://bio-bwa.sourceforge.net/)回贴到甘蓝/花椰菜参考基因组上，利用GATK(https://software.broadinstitute.org/gatk/)进行单核苷酸变异鉴定。
鉴定出的单核苷酸变异位点集，筛选最小等位变异频率＞0.02、杂合率＜15％、缺失率＜20％，将单核苷酸变异位点进行合并，筛选单核苷酸位点数位于6-11的区段，即mSNP(多聚单苷酸多态性)位点，相较于传统的SNP(单核苷酸多态性)位点，mSNP位点可最大限度的利用每个引物对所获得的信息，即在引物对不变的情况下检测到尽可能多的SNP位点，且同一引物对内的所有SNP还可以组合成单倍型，使其多态性更高。例如一个SNP存在A/T两种变异，其可区分的多态为AA、AT、TT共计3种，若检测的为mSNP位点，假如一个引物对内有3个SNP(A/T、G/T、C/A)，则可以存在8种(AGC、AGA、ATA、ATC、TGC、TGA、TTA、TTC)多态。这使得遗传变异的检测更加精细，同时提高了标记鉴定的准确度和灵敏度。本专利筛选多态性比较高的区段共计37个。
对37个目标区段进行引物设计，并对引物特异性进行筛选，共获得染色体特异引物19对，共计129个单核苷酸变异位点。从检测成本和实用角度综合考虑，同样按甘蓝和/或花椰菜样本间5-10％的多样性原则，我们最终选取19对引物混合进行甘蓝和/或花椰菜种子纯度的检测，共计可检测120个左右SNP位点。
在本发明中，共计获得20组特异性引物对，即引物对1F/R～20F/R，引物对1F/R～20F/R的基因序列如SEQIDNo.1～40所示。
实施例2：甘蓝和/或花椰菜种子纯度检测所用引物组
甘蓝和/或花椰菜种子纯度检测所用的引物组，包括引物对1F/R～19F/R，在引物对1F/R～19F/R中，不仅包括如SEQIDNo.1～38所示特异性引物序列，还包括通用引物序列，引物对1F/R～19F/R中的F引物的F端通用引物序列如SEQIDNo.39所示；引物对1F/R～20F/R中的R引物的R端通用引物的序列如SEQIDNo.40所示；
实施例3：引物混合液的获得方法：
获得特异性引物后，设计特异的标签序列，再重新进行引物合成，此时引物合成时会添加上特异的标签序列，本实施例采用96组特异的标签组合，具体为：
依据特定标签组合情况，将每条特异性引物合成10条带有不同目标标签的引物，带有目标标签的引物序列形式如表2所示，将带有目标标签的所有F(正向引物)和所有R(反向引物)，每条引物取10μl，定容至10ml；每条引物的浓度0.1μM，本实施例共计制备出含有96组特异标签组合的引物对，即引物混合液；
表2引物组
| 引物对 | F正向引物(5’～3’) | R反向引物(5’～3’) |
| 1F/R | FFFYYYGGCCAGGTTTGATTTTGAGATTACT | RRRYYYGATTTGACTGCCTCCACTCTAGTAA |
| 2F/R | FFFYYYGATTATTCATATTCCACGAGCGCAA | RRRYYYTTTCAAGCTGTTTTTGTTCGGAAAA |
| 3F/R | FFFYYYAAGGTTTTCAGGAGTTTCTGTAGGA | RRRYYYTTCTTTGGCATTCAAATTAGGGGAG |
| 4F/R | FFFYYYCCATCCTCTTTTAAGATGCGACTTT | RRRYYYAAAAGAAACACAAAAGTCCACGTCA |
| 5F/R | FFFYYYAATAAGAGACGGCCTCCATGAATTA | RRRYYYTGGAGTAGTGAAAAGATGAATGACCT |
| 6F/R | FFFYYYATACCAGATTTATAAATTAAGCTATCCAGA | RRRYYYATGGAAATGTTCTACTAGCCTGGAA |
| 7F/R | FFFYYYAAGCTTAACGAAACAAGACAAGGAG | RRRYYYATTCACCTATACATGACAGCCTCTC |
| 8F/R | FFFYYYATCCTTCACTCGCGACTTTCG | RRRYYYTGCAACTGAACATATGTACGTACTC |
| 9F/R | FFFYYYTAGTTAGAGGAGGTGATGAGGCTAT | RRRYYYTCAATTTACTGCCTTGTTCACAACT |
| 10F/R | FFFYYYACCGACCATCTAATAACAAACTCCT | RRRYYYGCAGTGATGGAGATGAGTAAGAAGA |
| 11F/R | FFFYYYTCAGGATCTCTACGTTAAACTAGCC | RRRYYYGAACCTATGATTCTTCCATGGCTTG |
| 12F/R | FFFYYYTGAACATCAACAAAGCTACCACAAG | RRRYYYCAATAGCCATCATCAGCATCAGAAA |
| 13F/R | FFFYYYATTCTTCCAATTATATTCCCTGCGC | RRRYYYTTCTAACCTCATGAAGCCTTTCTCA |
| 14F/R | FFFYYYTGTATAGTTGTGTCCACACTGTAGG | RRRYYYAGTTTTTCTACTCTCTGCAGGACAT |
| 15F/R | FFFYYYTGGTCGATCAAATCATTACGAAGAT | RRRYYYCCCGGTACATTGATGATCCGTT |
| 16F/R | FFFYYYACTGGAGATCCCTCGATAAATTTGT | RRRYYYGATCAATCTGACAACTCGAAGAAGT |
| 17F/R | FFFYYYACAACCAATGCAAAGATCTTCACTT | RRRYYYGCCGGTGAGTGCGAAACA |
| 18F/R | FFFYYYCCACCAACTGTCCTAGGATAAATCA | RRRYYYCACCTTCTTTCTCAATTCCCAACTC |
| 19F/R | FFFYYYGAGTGAGCTAAGATTCAATGTGACG | RRRYYYTGAAAAGTAAATGCAGTTTGACCAA |
“FFF”为F端通用引物序列，所述F端通用引物序列为AACGACATGGCTACGATCCGACTT，如SEQIDNo.39所示；
“RRR”为R端通用引物序列，所述R端通用引物序列为CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT，如SEQIDNo.40所示。
其中“YYY”为标签序列，
每个引物对中，合成的10条带有标签的正向引物中的标签序列分别为CCTTC、ACCGA、ATGTG、AATGC、TTCGG、AAGGT、CCCAT、ATGGA、ACGAT、CTCTG，即分别如SEQIDNo.43～52所示；
每个引物对中，合成的10条带有标签的反向引物中的标签序列分别为ATCCG、TATCG、ACTCG、TAACC、CTTAC、TCCTA、ACACT、TACGT、TCACG、ACGCA，即分别如SEQIDNo.53～62所示。
每对引物对合成的10条带有标签的引物对中，正向引物和反向引物的标签组合方式选自表2中的任意一种或几种。
实施例4：纯种鉴定
步骤1、材料的选取，选取甘蓝和花椰菜各1份(甘蓝和花椰菜分别选取96粒种子)，分别编号为BR0701和BR0702，提取甘蓝和/或花椰菜种子的基因组DNA，采用石家庄博瑞迪生物技术有限公司生产的甘蓝和/或花椰菜种子基因组DNA提取试剂盒对提取后的DNA进行准确定量。
步骤2、以甘蓝/花椰菜种子基因组DNA为模板，用引物混合液进行一轮PCR扩增，获得目标区域；
所述一轮PCR扩增体系：实施例3获得的引物混合液8μl；DNA用量100ng；3*T酶15μl；加水补足45μl。
所述一轮PCR扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
步骤3、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合，只有扩增产物为带有不同组合的特定标签才可进行混合，混合时直接按照体系1:1混合即可。等量混合后，对混合后的产物进行产物纯化即片段筛选，具体步骤为；
步骤3.1、加入一轮PCR体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
步骤3.2、加入一轮PCR体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤3.3添加一轮PCR体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤3.4加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
所述磁珠为：诺唯赞磁珠
步骤4、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；
在步骤3中获得的含磁珠的体系中，进行如下操作：
步骤4.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
步骤4.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的EP管中；
步骤4.3、向上述体系中加入Exo I 2μl，10*Reaction Buffer 2μl。
步骤4.4、上述体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min。
步骤5、对消化后的产物进行纯化：
步骤5.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤5.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤5.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
步骤6、在步骤5获得的体系中配置二轮PCR体系：
在步骤5中获得的含磁珠的体系中，配置二轮PCR体系，进行二轮PCR扩增；
所述二轮PCR体系：3*T酶10μl；Primer F；Primer R；H2O 18μl
所述二轮PCR程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min。
所述Primer F的序列如SEQIDNo.41所示，为GAACGACATGGCTACGATCCGACTT；所述Primer R的序列如SEQIDNo.42所示，为TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；
由于本实施例采用的是2份甘蓝/花椰菜品种，为了对样本进行区分，因此，PrimerR的序列除包括如SEQIDNo.42所示的序列外，还包括唯一条形码序列Barcode；带条形码的Primer R的序列为：
TGTGAGCCAAGGAGTTGxxxxxxxxxxTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；
其中“xxxxxxxx”为用于识别样品的唯一条形码Barcode，以区分样本。
本实施例中2份甘蓝/花椰菜品种样本的Barcode序列分别为CGGCTAAA、TCCCCGTG；即分别如SEQIDNo.63-64所示。
步骤7、利用0.80倍的磁珠对二轮PCR扩增产物进行纯化，完成测序文库的制备；
步骤7.1加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤7.2添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤7.3加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
步骤7.4加入23μl Elution Buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA。将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清DNA溶液吸至一新的管中，获得测序文库(Elution Buffer为10mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5)；
步骤8、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据。
步骤9、识别目标DNA的基因型结果，从96粒种子中分别选取检测合成的种子用于后续纯度的判断依据，通过多态性高的位点基因型情况判定这批种子的纯度，本实施例的检测结果见表3。
表3检测结果
| 样品编号 | 自交种子数 | 种子纯度 | 结论 |
| BR0701 | 1 | 98.94％ | 同常规鉴定结果 |
| BR0702 | 2 | 97.85％ | 同常规鉴定结果 |
种子纯度程序判读原则：
首先对每个位点是杂交/异交还是自交进行判断，判断标准：计算一批种子在每个位点基因型种类所占的比例。如果这个位点的基因型只有一种且纯合，这个位点舍弃，因为无法判断是自交还是杂交。如果一种杂合基因型的占比超过90％，判断为杂交；一个样本在这个位点的基因型是纯合就判断是自交；如果是其他杂合基因型就判断为异交。
然后对样本进行自交、异交和杂交的判定。最后统计这批种子的整体情况。
纯度计算，用一批种子纯度百分率表示：
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 石家庄博瑞迪生物技术有限公司
<120> 一种基于mSNP技术检测甘蓝/花椰菜种子纯度的混样检测方法
<130> 1
<160> 64
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
ggccaggttt gattttgaga ttact 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
gatttgactg cctccactct agtaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
gattattcat attccacgag cgcaa 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
tttcaagctg tttttgttcg gaaaa 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
aaggttttca ggagtttctg tagga 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
ttctttggca ttcaaattag gggag 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
ccatcctctt ttaagatgcg acttt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 8
aaaagaaaca caaaagtcca cgtca 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
aataagagac ggcctccatg aatta 25
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
tggagtagtg aaaagatgaa tgacct 26
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
ataccagatt tataaattaa gctatccaga 30
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
atggaaatgt tctactagcc tggaa 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 13
aagcttaacg aaacaagaca aggag 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
attcacctat acatgacagc ctctc 25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
atccttcact cgcgactttc g 21
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
tgcaactgaa catatgtacg tactc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
tagttagagg aggtgatgag gctat 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
tcaatttact gccttgttca caact 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 19
accgaccatc taataacaaa ctcct 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
gcagtgatgg agatgagtaa gaaga 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
tcaggatctc tacgttaaac tagcc 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 22
gaacctatga ttcttccatg gcttg 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 23
tgaacatcaa caaagctacc acaag 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 24
caatagccat catcagcatc agaaa 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 25
attcttccaa ttatattccc tgcgc 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 26
ttctaacctc atgaagcctt tctca 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 27
tgtatagttg tgtccacact gtagg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 28
agtttttcta ctctctgcag gacat 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 29
tggtcgatca aatcattacg aagat 25
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 30
cccggtacat tgatgatccg tt 22
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 31
actggagatc cctcgataaa tttgt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 32
gatcaatctg acaactcgaa gaagt 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 33
acaaccaatg caaagatctt cactt 25
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 34
gccggtgagt gcgaaaca 18
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 35
ccaccaactg tcctaggata aatca 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 36
caccttcttt ctcaattccc aactc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 37
gagtgagcta agattcaatg tgacg 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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tgaaaagtaa atgcagtttg accaa 25
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 39
aacgacatgg ctacgatccg actt 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 40
ctaagaccgc ttggcctccg actt 24
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 41
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 42
tgtgagccaa ggagttgttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 49
<210> 43
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 43
ccttc 5
<210> 44
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 44
accga 5
<210> 45
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 45
atgtg 5
<210> 46
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 46
aatgc 5
<210> 47
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 47
ttcgg 5
<210> 48
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 48
aaggt 5
<210> 49
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 49
cccat 5
<210> 50
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 50
atgga 5
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<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 51
acgat 5
<210> 52
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 52
ctctg 5
<210> 53
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 53
atccg 5
<210> 54
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 54
tatcg 5
<210> 55
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 55
actcg 5
<210> 56
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 56
taacc 5
<210> 57
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 57
cttac 5
<210> 58
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 58
tccta 5
<210> 59
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 59
acact 5
<210> 60
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 60
tacgt 5
<210> 61
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 61
tcacg 5
<210> 62
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 62
acgca 5
<210> 63
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 63
cggctaaa 8
<210> 64
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 64
tccccgtg 8
Claims (10)
1.一种基于mSNP技术的甘蓝和/或花椰菜种子纯度检测用引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；
所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQ ID No.1所示，R引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQ ID No.3所示，R引物的序列如SEQ ID No.4所示；
所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQ ID No.5所示，R引物的序列如SEQ ID No.6所示；
所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQ ID No.7所示，R引物的序列如SEQ ID No.8所示；
所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQ ID No.9所示，R引物的序列如SEQ ID No.10所示；
所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQ ID No.11所示，R引物的序列如SEQ ID No.12所示；
所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQ ID No.13所示，R引物的序列如SEQ ID No.14所示；
所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQ ID No.15所示，R引物的序列如SEQ ID No.16所示；
所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQ ID No.17所示，R引物的序列如SEQ ID No.18所示；
所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQ ID No.19所示，R引物的序列如SEQ ID No.20所示；
所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQ ID No.21所示，R引物的序列如SEQ ID No.22所示；
所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQ ID No.23所示，R引物的序列如SEQ ID No.24所示；
所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQ ID No.25所示，R引物的序列如SEQ ID No.26所示；
所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQ ID No.27所示，R引物的序列如SEQ ID No.28所示；
所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQ ID No.29所示，R引物的序列如SEQ ID No.30所示；
所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQ ID No.31所示，R引物的序列如SEQ ID No.32所示；
所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQ ID No.33所示，R引物的序列如SEQ ID No.34所示；
所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQ ID No.35所示，R引物的序列如SEQ ID No.36所示；
所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQ ID No.37所示，R引物的序列如SEQ ID No.38所示。
2.一种根据权利要求1所述的引物组检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤1、选材：选取1个或多个甘蓝和/或花椰菜品种；每份甘蓝和/或花椰菜样品至少采用96粒种子；
步骤2、对甘蓝和/或花椰菜基因组DNA进行准确定量；
步骤3、将权利要求1中所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；
步骤4、以甘蓝和/或花椰菜基因组DNA为模板，用引物混合液分别对甘蓝和/或花椰菜的基因组DNA进行一轮PCR扩增，获得目标区域；
步骤5、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合；
步骤6、混合后的产物进行片段筛选；
步骤7、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；
步骤8、对消化后的产物进行纯化；
步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮PCR体系；
步骤10、对二轮PCR产物进行纯化，完成测序文库的制备；
步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；
步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；
步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。
3.根据权利要求2所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，步骤3中，引物对1F/R～19F/R中的F引物还包括F端通用引物，所述F端通用引物的序列如SEQ ID No.39所示；引物对1F/R～19F/R中的R引物还包括R端通用引物，所述R端通用引物的序列如SEQ ID No.40所示；
步骤9中，二轮PCR所用的Frimer F的序列如SEQ ID No.41所示；二轮PCR所用的PrimerR的序列如SEQ ID No.42所示。
4.根据权利要求3所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，当甘蓝和/或花椰菜品种为多个时，所述Primer R的序列还包括用于区别甘蓝和/或花椰菜品种的条形码序列。
5.根据权利要求2所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，步骤2中，每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
6.根据权利要求2所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤1中，采用甘蓝和/或花椰菜种子基因组DNA提取试剂盒对甘蓝和/或花椰菜种子的基因组DNA进行提取。
7.根据权利要求2所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤4中，所述一轮PCR扩增体系：引物混合液8μl；DNA用量100ng；3*T酶15μl；加水补足45μl；所述一轮PCR扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
8.根据权利要求2所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
在步骤6中，混合后的产物进行片段筛选，具体操作如下：
步骤6.1、加入一轮PCR体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
步骤6.2、加入一轮PCR体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.3、添加一轮PCR体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.4、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
在步骤7中，对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化，具体操作步骤为：
步骤7.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
步骤7.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的EP管中；
步骤7.3、向体系中加入Exo I 2μl，10×Reaction Buffer 2μl；
步骤7.4、消化体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min；
在步骤8中，对消化后的产物进行纯化的具体操作步骤为：
步骤8.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
9.根据权利要求2所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤9中，所述二轮PCR体系：3*T酶10μl；Primer F；Primer R；H2O 18μl；
所述二轮PCR程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min。
10.根据权利要求2所述一种检测甘蓝和/或花椰菜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤10中，对二轮PCR产物进行纯化，利用的是0.80倍的磁珠，具体操作如下：
步骤10.1、加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.3、加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
步骤10.4、加入23μl Elution Buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清DNA溶液吸至一新的管中，获得测序文库；所述ElutionBuffer为10mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5。
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