CN113667770A - 一种基于mSNP技术检测黄瓜种子纯度的混样检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于mSNP技术检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其利用引物对1F/R～21F/R进行，所述引物对1F/R～21F/R的基因序列见SEQ ID No.1～42；本发明采用mSNP技术，在扩增子不变的情况下，可以检测到更多的SNP变异；采用混样的方法进行检测，在减少扩增工作量的同时降低了测序成本，也加快了检测速度，可在一天时间内最多完成1440粒种子的检测。本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。

Description

一种基于mSNP技术检测黄瓜种子纯度的混样检测方法
技术领域
本发明属于种子纯度检测领域，具体涉及一种基于mSNP技术检测黄瓜种子纯度的混样检测方法。
背景技术
黄瓜是葫芦科黄瓜属一年生蔓生或攀缘草本植物，是世界性蔬菜作物之一，具有重要经济价值。在长期自然选择、驯化改良的过程中根据地理分布区域和生态学特征可以分为不同的生态类型：华北型、华南型、欧洲温室型、欧洲露地型、野生型等不同生态类型。我国黄瓜的种质资源虽然丰富，由于育种家对品种的长期定向改良，使得广泛推广的品种遗传基础日益狭窄。杂交种子与亲本在形态上相似度较高，种子易混淆，使种子纯度下降。而种子纯度是指某一品种一致性程度，是种子质量的一个核心指标，在种子出售之前都要进行纯度检测，达到国家制定的《农作物种子质量标准》。
种子纯度鉴定是一项技术性较强的工作，要求检测过程简便、数据科学、精度高。传统的种子纯度检测是田间种植鉴定法，耗时较长、易受环境条件影响而且对于黄瓜杂交种子与亲本形态上高度相似，很难进行区分。在黄瓜种子纯度鉴定工作中应用较多的是生化鉴定和分子标记鉴定。生化鉴定主要包括同工酶分析标记和蛋白质电泳技术。蛋白质电泳技术进行品种鉴定，因为蛋白质是基因表达的产物，不受环境影响；但是在亲缘关系较近的品种间，蛋白差异不明显，并且可用的蛋白质种类有限，限制了该技术的应用。同工酶具有器官和组织的特异性，谱带中出现的生物型(同一品种的不一致的酶带)对纯度鉴定造成困扰。分子标记鉴定是基因的直接反映，相对于前两种鉴定方法具有不受环境影响、多态性高、共显性、易于自动化操作等优点，在纯度鉴定方面有广阔的前景。不同的DNA分子标记技术又各有优势与不足，RFLP结果可靠但需要用到放射性同位素；AFLP重复性高、分辨率高，但操作较复杂、成本高；RAPD操作方便、标记丰富，但对实验条件要求较高、可重复性相对较差；SSR数量丰富、多态性好、共线性、遗传重复性高，但标记的开发需要对每个标记两端的单拷贝序列才能设计引物，致使开发成本较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于mSNP技术检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其高效、准确、成本低。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
技术方案一：
一种于mSNP技术的黄瓜种子纯度检测的引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R、引物对20F/R、引物对21F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；
所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQ ID No.1所示，R引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQ ID No.3所示，R引物的序列如SEQ ID No.4所示；
所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQ ID No.5所示，R引物的序列如SEQ ID No.6所示；
所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQ ID No.7所示，R引物的序列如SEQ ID No.8所示；
所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQ ID No.9所示，R引物的序列如SEQ ID No.10所示；
所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQ ID No.11所示，R引物的序列如SEQ IDNo.12所示；
所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQ ID No.13所示，R引物的序列如SEQ IDNo.14所示；
所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQ ID No.15所示，R引物的序列如SEQ IDNo.16所示；
所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQ ID No.17所示，R引物的序列如SEQ IDNo.18所示；
所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQ ID No.19所示，R引物的序列如SEQ IDNo.20所示；
所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQ ID No.21所示，R引物的序列如SEQ IDNo.22所示；
所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQ ID No.23所示，R引物的序列如SEQ IDNo.24所示；
所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQ ID No.25所示，R引物的序列如SEQ IDNo.26所示；
所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQ ID No.27所示，R引物的序列如SEQ IDNo.28所示；
所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQ ID No.29所示，R引物的序列如SEQ IDNo.30所示；
所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQ ID No.31所示，R引物的序列如SEQ IDNo.32所示；
所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQ ID No.33所示，R引物的序列如SEQ IDNo.34所示；
所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQ ID No.35所示，R引物的序列如SEQ IDNo.36所示；
所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQ ID No.37所示，R引物的序列如SEQ IDNo.38所示；
所述引物对20F/R中，F引物的序列SEQ ID No.39所示，R引物的序列如SEQ IDNo.40所示；
所述引物对21F/R中，F引物的序列SEQ ID No.41所示，R引物的序列如SEQ IDNo.42所示。进一步的，引物对1F/R～22F/R由mSNP技术获得。
技术方案二：
一种根据上述的引物组检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其包括如下步骤：
步骤1、选材：选取1个或多个黄瓜品种；每份份黄瓜样品至少采用96粒种子；
步骤2、对黄瓜基因组DNA进行准确定量；
步骤3、将所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；
步骤4、以黄瓜基因组DNA为模板，用引物混合液分别对黄瓜的基因组DNA进行一轮PCR扩增，获得目标区域；
步骤5、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合；
步骤6、混合后的产物进行片段筛选；
步骤7、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；
步骤8、对消化后的产物进行纯化；
步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮PCR体系；
步骤10、对二轮PCR产物进行纯化，完成测序文库的制备；
步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；
步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；
步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。
进一步的，引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；
每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
进一步的，步骤3中，每个引物对中，合成的10条带有标签的正向引物中的标签序列分别如SEQ ID No.47～56所示；
每个引物对中，合成的10条带有标签的反向引物中的标签序列分别如SEQ IDNo.57～66所示。
进一步的，每对引物对合成的10条带有标签的引物对中，正向引物和反向引物的标签组合方式选自表1中的任意一种或几种。
表1：标签组合方式
Figure BDA0003287364510000031
Figure BDA0003287364510000041
Figure BDA0003287364510000051
进一步的，步骤3中，引物对1F/R～21F/R中的F引物还包括F端通用引物，所述F端通用引物的序列如SEQ ID No.43所示；引物对1F/R～21F/R中的R引物还包括R端通用引物，所述R端通用引物的序列如SEQ ID No.44所示；
步骤9中、二轮PCR所用的Frimer F的序列如SEQ ID No.45所示，
所用的Primer R的序列如SEQ ID No.46所示。
更进一步的，当黄瓜品种为多个时，所述Primer R的序列还包括用于区别黄瓜品种的条形码序列。
进一步的，步骤2中，每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
进一步的，在步骤1中，采用黄瓜种子基因组DNA提取试剂盒对黄瓜种子的基因组DNA进行提取。
进一步的，在步骤4中，所述一轮PCR扩增体系：引物混合液8μl；DNA用量100ng；3*T酶15μl；加水补足45μl；
所述一轮PCR扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
进一步的，在步骤6中，混合后的产物进行片段筛选，具体操作如下：
步骤6.1、加入一轮PCR体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
步骤6.2、加入一轮PCR体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.3、添加一轮PCR体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.4、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
在步骤7中，对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化，具体操作步骤为：
步骤7.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
步骤7.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的EP管中；
步骤7.3、向体系中加入Exo I 2μl，10×Reaction Buffer 2μl；
步骤7.4、消化体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min；
在步骤8中，对消化后的产物进行纯化的具体操作步骤为：
步骤8.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
进一步的，在步骤9中，所述二轮PCR体系：3*T酶10μl；Primer F；Primer R；H2O18μl；
所述二轮PCR程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min；
进一步的，在步骤10中，对二轮PCR产物进行纯化，利用的是0.80倍的磁珠，具体操作如下：
步骤10.1、加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.3、加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
步骤10.4、加入23μl Elution Buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清DNA溶液吸至一新的管中，获得测序文库；所述ElutionBuffer为10mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
mSNP技术：本发明采用mSNP技术，一个扩增子内对应多个SNP，最大限度的利用了每个扩增子片段所获得的的信息，可以在扩增子不变的情况下检测到尽量多的SNP变异。且这些SNP之间可构成单倍型，提高了变异的检测效率。这样不仅可以采用mSNP位点内和位点间的变异，而且还可以采用单倍型和SNP两种方式进行检测，使得遗传变异的检测更加精细，提高了标记鉴定的准确度和灵敏度。本专利中采用了21对引物对，实际检测到的变异信息有近100个，有助于筛选出更多的符合需求的多态性位点用于纯度鉴定分析。与常规SNP检测相比，减少了引物对数的使用，降低了成本。
成本低：采用mSNP技术，扩增子不变的情况下可以检测到更多的SNP变异；采用一轮扩增后至少96个测试样产物混样检测的方案，减少二轮扩增工作量的同时降低了测序成本。
高效：采用混样检测的方案，一轮扩增后至少96个检测样的产物混样进行后续的扩增和测序，可在一天时间内最多可完成1440粒种子的检测。与其他检测方法相比，操作简单，不用田间种植、不需要工作量大、检测难度大的实验操作等，可以快速进行种子纯度的检测工作。
准确：本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。
附图说明
图1是本发明混样检测方法的流程图。
具体实施方式
实施例1：特异性引物的获得方法
本发明特异性引物的获得方法，具体为：
利用黄瓜的全基因组重测序数据，采用BWA-mem(http://bio-bwa.sourceforge.net/)回贴到黄瓜参考基因组上，利用GATK(https://software.broadinstitute.org/gatk/)进行单核苷酸变异鉴定。
鉴定出的单核苷酸变异位点集，筛选最小等位变异频率>0.02、杂合率＜10％、缺失率＜20％，将单核苷酸变异位点进行合并，筛选单核苷酸位点数位于2-11的区段，即mSNP(多聚单苷酸多态性)位点，相较于传统的SNP(单核苷酸多态性)位点，mSNP位点可最大限度的利用每个引物对所获得的信息，即在引物对不变的情况下检测到尽可能多的SNP位点，且同一引物对内的所有SNP还可以组合成单倍型，使其多态性更高。例如一个SNP存在A/T两种变异，其可区分的多态为AA、AT、TT共计3种，若检测的为mSNP位点，假如一个引物对内有3个SNP(A/T、G/T、C/A)，则可以存在8种(AGC、AGA、ATA、ATC、TGC、TGA、TTA、TTC)多态。这使得遗传变异的检测更加精细，同时提高了标记鉴定的准确度和灵敏度。本专利筛选多态性比较高的区段共计35个。
对35个目标区段进行引物设计，并对引物特异性进行筛选，共获得染色体特异引物21对，共计97个单核苷酸变异位点。从检测成本和实用角度综合考虑，同样按黄瓜样本间5-10％的多样性原则，我们最终选取21对引物混合进行黄瓜种子纯度的检测，共计可检测95个左右SNP位点。
在本发明中，共计获得21组引物对，即引物对1F/R～21F/R，引物对1F/R～21F/R的特异性基因序列如SEQ ID No.1～42所示。
实施例2：黄瓜种子纯度检测所用引物组
黄瓜种子纯度检测所用的引物组，包括引物对1F/R～21F/R，在引物对1F/R～21F/R中，不仅包括如SEQ ID No.1～42所示特异性引物序列，还包括通用引物序列，引物对1F/R～21F/R中的F引物的F端通用引物序列如SEQ ID No.43所示；引物对1F/R～21F/R中的R引物的R端通用引物的序列如SEQ ID No.44所示；
实施例3：引物混合液的获得方法：
获得特异性引物后，设计特异的标签序列，再重新进行引物合成，此时引物合成时会添加上特异的标签序列，本实施例采用96组特异的标签组合，具体为：
依据特定标签组合情况，将每条特异性引物合成10条带有不同目标标签的引物，带有目标标签的引物序列形式如表2所示，将带有目标标签的所有F(正向引物)和所有R(反向引物)，每条引物取10μl，定容至10ml；每条引物的浓度0.1μM，本实施例共计制备出含有96组特异标签组合的引物对，即引物混合液；
表2引物组
引物对 F正向引物(5’～3’) R反向引物(5’～3’)
1F/R FFYYAAAAAGGAGGAAGGAAATCCTAGGTT RRYYAATTTGTAAGGTAGACAAAATATGACCAAAGAAA
2F/R FFYYACTTGAATCCTCCAAACCTTACTCTAAATCC RRYYCCGCAACTATGAATGCTCGAGTAAC
3F/R FFYYCTTTCTTGAACATCTAGTCTTTTGGTTGCA RRYYTGACCAATCTTAACAATGACACCAAGAT
4F/R FFYYGTTGCGAGTTATGAACAACTTTCTCGC RRYYTTAATCTACAGCAAGTTGATCCTTTCATGTT
5F/R FFYYGTTTTTGAGAGAAAAAGGAAGAAAGAGCTTC RRYYCTCAATCTTACCCAATTGTCCACTGTG
6F/R FFYYGGAAAAGATTTTGGTGTTGGGAGTTG RRYYTGTCAATCATTGTTGTTTTGTGTCAAACTA
7F/R FFYYGTGCCAATTGTCTTTCCAGCATG RRYYCAACTTGAAATGCTTGGCAGCTTT
8F/R FFYYAAGAGAGAGAAATGTGTTAGGAGAAGAGAG RRYYTTGTGTTAACCATCCTGCCTATTTTACAT
9F/R FFYYAGCTTAAAGAGTAGGTGATATATGTTGCACC RRYYTGTCACCTTCATCACTTTACCATTCTCA
10F/R FFYYGCTTGGTTTTCAGGGCAGTTTTT RRYYTAGTAGAATGAGAAAGAAGACTGACGAGTC
11F/R FFYYATCAACACAATCGTTTATTATGGTCAACAC RRYYGTACATGATCTTGTACAACATCTAAGCGAT
12F/R FFYYCAAAATCTAGACAGATAAGACGCGTGATA RRYYAAGGTTTTGCCAAAGTTAAGTAAAGAGCA
13F/R FFYYTGTTACCCTTAAAGATCAAATTGAAGAGGTC RRYYTGTTGCCTCAACAAAGTTGTTCCTATG
14F/R FFYYGTTACTTTTGAGAGTGGAAACAGTTCGA RRYYTCATCATGACAACTTTATGTCTCAAACACAT
15F/R FFYYTCCAGTATACACCAAAGAGTACTCGTG RRYYTTCTGGTAATGGGTTTTTCAAGTTCCTT
16F/R FFYYAAGTTTGGCCAAATAAATGTTGTCACAC RRYYAGCTTAATCAGTCCTCAAGATTTCATAGCT
17F/R FFYYTAAGCTCTACTCCAAGCTTCTAGGTTC RRYYTGGTTGAATTCGTTGTGGGTAGATTA
18F/R FFYYCCACGAATCACTTCAAGACTGTATTGT RRYYAATCAAAACAATGTACAAGTTGAGCCAAC
19F/R FFYYCCATTACAGTTTGACTTCCACCTTCTA RRYYTCCTCTCTTTTCTCTGTAACTTTAGAAGGAT
20F/R FFYYCACAACAAATGGATGGGAAAATTGAACTA RRYYAGCTCTTTCTTAAACAAGCTTAAGGGTAGC
21F/R FFYYTGATGGCTACTTTGCAGTAAATGGAG RRYYCTATTGCATTGGTTGCCTTCCATATTATTCA
“FF”为F端通用引物序列，所述F端通用引物序列为AACGACATGGCTACGATCCGACTT，如SEQ ID No.43所示；
“RR”为R端通用引物序列，所述R端通用引物序列为CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT，如SEQ ID No.44所示。
其中“YY”为标签序列，
每个引物对中，合成的10条带有标签的正向引物中的标签序列分别为CCTTC、ACCGA、ATGTG、AATGC、TTCGG、AAGGT、CCCAT、ATGGA、ACGAT、CTCTG，即分别如SEQ ID No.47～56所示；
每个引物对中，合成的10条带有标签的反向引物中的标签序列分别为ATCCG、TATCG、ACTCG、TAACC、CTTAC、TCCTA、ACACT、TACGT、TCACG、ACGCA，即分别如SEQ ID No.57～66所示。
每对引物对合成的10条带有标签的引物对中，正向引物和反向引物的标签组合方式选自表2中的任意一种或几种。
实施例4：纯种鉴定
步骤1、材料的选取，选取2份黄瓜(每份黄瓜分别选取96粒种子)，分别编号为23-14和23-18，提取黄瓜种子的基因组DNA，采用石家庄博瑞迪生物技术有限公司生产的黄瓜种子基因组DNA提取试剂盒对提取后的DNA进行准确定量。
步骤2、以黄瓜种子基因组DNA为模板，用引物混合液进行一轮PCR扩增，获得目标区域；
所述一轮PCR扩增体系：实施例3获得的引物混合液8μl；DNA用量100ng；3*T酶15μl；加水补足45μl。
所述一轮PCR扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
步骤3、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合，只有扩增产物为带有不同组合的特定标签才可进行混合，混合时直接按照体系1:1混合即可。等量混合后，对混合后的产物进行产物纯化即片段筛选，具体步骤为；
步骤3.1、加入一轮PCR体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
步骤3.2、加入一轮PCR体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤3.3添加一轮PCR体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤3.4加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
所述磁珠为：诺唯赞磁珠
步骤4、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；
在步骤3中获得的含磁珠的体系中，进行如下操作：
步骤4.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
步骤4.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的EP管中；
步骤4.3、向上述体系中加入Exo I 2μl，10*Reaction Buffer 2μl。
步骤4.4、上述体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min。
步骤5、对消化后的产物进行纯化：
步骤5.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤5.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤5.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
步骤6、在步骤5获得的体系中配置二轮PCR体系：
在步骤5中获得的含磁珠的体系中，配置二轮PCR体系，进行二轮PCR扩增；
所述二轮PCR体系：3*T酶10μl；Primer F；Primer R；H2O 18μl
所述二轮PCR程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min。
所述Primer F的序列如SEQ ID No.45所示，为GAACGACATGGCTACGATCCGACTT；所述Primer R的序列如SEQ ID No.46所示，为TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；
由于本实施例采用的是2份黄瓜品种，为了对样本进行区分，因此，Primer R的序列除包括如SEQ ID No.46所示的序列外，还包括唯一条形码序列Barcode；
带条形码的Primer R的序列为：
TGTGAGCCAAGGAGTTGxxxxxxxxxxTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；
其中“xxxxxxxx”为用于识别样品的唯一条形码Barcode，以区分样本。
本实施例中2份黄瓜品种样本的Barcode序列分别为CGGCTAAA、TCCCCGTG；即分别如SEQ ID No.67-68所示。
步骤7、利用0.80倍的磁珠对二轮PCR扩增产物进行纯化，完成测序文库的制备；
步骤7.1加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤7.2添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤7.3加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
步骤7.4加入23μl Elution Buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA。将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清DNA溶液吸至一新的管中，获得测序文库(Elution Buffer为10mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5)；
步骤8、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据。
步骤9、识别目标DNA的基因型结果，从96粒种子中分别选取检测合成的种子用于后续纯度的判断依据，通过多态性高的位点基因型情况判定这批种子的纯度，本实施例的检测结果见表3。
表3检测结果
样品编号 自交种子数 种子纯度 结论
23-14 2 97.89％ 同常规鉴定结果
23-18 3 96.77％ 同常规鉴定结果
种子纯度程序判读原则：
首先对每个位点是杂交/异交还是自交进行判断，判断标准：计算一批种子在每个位点基因型种类所占的比例。如果这个位点的基因型只有一种且纯合，这个位点舍弃，因为无法判断是自交还是杂交。如果一种杂合基因型的占比超过90％，判断为杂交；一个样本在这个位点的基因型是纯合就判断是自交；如果是其他杂合基因型就判断为异交。
然后对样本进行自交、异交和杂交的判定。最后统计这批种子的整体情况。
纯度计算，用一批种子纯度百分率表示：
Figure BDA0003287364510000111
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 石家庄博瑞迪生物技术有限公司
<120> 一种基于mSNP技术检测黄瓜种子纯度的混样检测方法
<130> 7
<160> 68
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
aaaaaggagg aaggaaatcc taggtt 26
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
aatttgtaag gtagacaaaa tatgaccaaa gaaa 34
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
acttgaatcc tccaaacctt actctaaatc c 31
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
ccgcaactat gaatgctcga gtaac 25
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
ctttcttgaa catctagtct tttggttgca 30
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
tgaccaatct taacaatgac accaagat 28
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
gttgcgagtt atgaacaact ttctcgc 27
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 8
ttaatctaca gcaagttgat cctttcatgt t 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
gtttttgaga gaaaaaggaa gaaagagctt c 31
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
ctcaatctta cccaattgtc cactgtg 27
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
ggaaaagatt ttggtgttgg gagttg 26
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
tgtcaatcat tgttgttttg tgtcaaacta 30
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 13
gtgccaattg tctttccagc atg 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
caacttgaaa tgcttggcag cttt 24
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
aagagagaga aatgtgttag gagaagagag 30
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
ttgtgttaac catcctgcct attttacat 29
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
agcttaaaga gtaggtgata tatgttgcac c 31
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
tgtcaccttc atcactttac cattctca 28
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 19
gcttggtttt cagggcagtt ttt 23
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
tagtagaatg agaaagaaga ctgacgagtc 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
atcaacacaa tcgtttatta tggtcaacac 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 22
gtacatgatc ttgtacaaca tctaagcgat 30
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 23
caaaatctag acagataaga cgcgtgata 29
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 24
aaggttttgc caaagttaag taaagagca 29
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 25
tgttaccctt aaagatcaaa ttgaagaggt c 31
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 26
tgttgcctca acaaagttgt tcctatg 27
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 27
gttacttttg agagtggaaa cagttcga 28
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 28
tcatcatgac aactttatgt ctcaaacaca t 31
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 29
tccagtatac accaaagagt actcgtg 27
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 30
ttctggtaat gggtttttca agttcctt 28
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 31
aagtttggcc aaataaatgt tgtcacac 28
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 32
agcttaatca gtcctcaaga tttcatagct 30
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 33
taagctctac tccaagcttc taggttc 27
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 34
tggttgaatt cgttgtgggt agatta 26
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 35
ccacgaatca cttcaagact gtattgt 27
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 36
aatcaaaaca atgtacaagt tgagccaac 29
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 37
ccattacagt ttgacttcca ccttcta 27
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 38
tcctctcttt tctctgtaac tttagaagga t 31
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 39
cacaacaaat ggatgggaaa attgaacta 29
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 40
agctctttct taaacaagct taagggtagc 30
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 41
tgatggctac tttgcagtaa atggag 26
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 42
ctattgcatt ggttgccttc catattattc a 31
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 43
aacgacatgg ctacgatccg actt 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 44
ctaagaccgc ttggcctccg actt 24
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 45
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 46
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 46
tgtgagccaa ggagttgttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 49
<210> 47
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 47
ccttc 5
<210> 48
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 48
accga 5
<210> 49
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 49
atgtg 5
<210> 50
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 50
aatgc 5
<210> 51
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 51
ttcgg 5
<210> 52
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 52
aaggt 5
<210> 53
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 53
cccat 5
<210> 54
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 54
atgga 5
<210> 55
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 55
acgat 5
<210> 56
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 56
ctctg 5
<210> 57
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 57
atccg 5
<210> 58
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 58
tatcg 5
<210> 59
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 59
actcg 5
<210> 60
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 60
taacc 5
<210> 61
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 61
cttac 5
<210> 62
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 62
tccta 5
<210> 63
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 63
acact 5
<210> 64
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 64
tacgt 5
<210> 65
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 65
tcacg 5
<210> 66
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 66
acgca 5
<210> 67
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 67
cggctaaa 8
<210> 68
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 68
tccccgtg 8

Claims (10)

1.一种基于mSNP技术的黄瓜种子纯度检测用引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R、引物对20F/R、引物对21F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；
所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.1所示，R引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.3所示，R引物的序列如SEQ IDNo.4所示；
所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.5所示，R引物的序列如SEQ IDNo.6所示；
所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.7所示，R引物的序列如SEQ IDNo.8所示；
所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.9所示，R引物的序列如SEQ IDNo.10所示；
所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.11所示，R引物的序列如SEQ IDNo.12所示；
所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.13所示，R引物的序列如SEQ IDNo.14所示；
所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.15所示，R引物的序列如SEQ IDNo.16所示；
所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.17所示，R引物的序列如SEQ IDNo.18所示；
所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.19所示，R引物的序列如SEQ IDNo.20所示；
所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.21所示，R引物的序列如SEQ IDNo.22所示；
所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.23所示，R引物的序列如SEQ IDNo.24所示；
所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.25所示，R引物的序列如SEQ IDNo.26所示；
所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.27所示，R引物的序列如SEQ IDNo.28所示；
所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.29所示，R引物的序列如SEQ IDNo.30所示；
所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.31所示，R引物的序列如SEQ IDNo.32所示；
所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.33所示，R引物的序列如SEQ IDNo.34所示；
所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.35所示，R引物的序列如SEQ IDNo.36所示；
所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.37所示，R引物的序列如SEQ IDNo.38所示；
所述引物对20F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.39所示，R引物的序列如SEQ IDNo.40所示；
所述引物对21F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.41所示，R引物的序列如SEQ IDNo.42所示。
2.一种根据权利要求1所述的引物组检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤1、选材：选取1个或多个黄瓜品种；每份黄瓜样品至少采用96粒种子；
步骤2、对黄瓜基因组DNA进行准确定量；
步骤3、将权利要求1中所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；
步骤4、以黄瓜基因组DNA为模板，用引物混合液分别对黄瓜的基因组DNA进行一轮PCR扩增，获得目标区域；
步骤5、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合；
步骤6、混合后的产物进行片段筛选；
步骤7、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；
步骤8、对消化后的产物进行纯化；
步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮PCR体系；
步骤10、对二轮PCR产物进行纯化，完成测序文库的制备；
步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；
步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；
步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。
3.根据权利要求2所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
步骤3中，引物对1F/R～21F/R中的F引物还包括F端通用引物，所述F端通用引物的序列如SEQ IDNo.43所示；引物对1F/R～21F/R中的R引物还包括R端通用引物，所述R端通用引物的序列如SEQ IDNo.44所示；
步骤9中，二轮PCR所用的Frimer F的序列如SEQ IDNo.45所示；二轮PCR所用的PrimerR的序列如SEQ IDNo.46所示。
4.根据权利要求3所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
当黄瓜品种为多个时，所述Primer R的序列还包括用于区别黄瓜品种的条形码序列。
5.根据权利要求2所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，步骤2中，每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
6.根据权利要求2所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
在步骤1中，采用黄瓜种子基因组DNA提取试剂盒对黄瓜种子的基因组DNA进行提取。
7.根据权利要求2所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
在步骤4中，所述一轮PCR扩增体系：引物混合液8μl；DNA用量100ng；3*T酶15μl；加水补足45μl；所述一轮PCR扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
8.根据权利要求2所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
在步骤6中，混合后的产物进行片段筛选，具体操作如下：
步骤6.1、加入一轮PCR体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
步骤6.2、加入一轮PCR体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.3、添加一轮PCR体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤6.4、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
在步骤7中，对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化，具体操作步骤为：
步骤7.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
步骤7.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的EP管中；
步骤7.3、向体系中加入Exo I 2μl，10×Reaction Buffer 2μl；
步骤7.4、消化体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min；
在步骤8中，对消化后的产物进行纯化的具体操作步骤为：
步骤8.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤8.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
9.根据权利要求2所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
在步骤9中，所述二轮PCR体系：3*T酶10μl；Primer F；Primer R；H2O 18μl；
所述二轮PCR程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min；
10.根据权利要求2所述一种检测黄瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，
在步骤10中，对二轮PCR产物进行纯化，利用的是0.80倍的磁珠，具体操作如下：
步骤10.1、加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.2、添加等PCR体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
步骤10.3、加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
步骤10.4、加入23μl Elution Buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清DNA溶液吸至一新的管中，获得测序文库；所述ElutionBuffer为10mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5。
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