CN108754006A

CN108754006A - 与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记

Info

Publication number: CN108754006A
Application number: CN201810544142.2A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 朱华玉; 刘东明; 张肖静; 胡建斌; 侯娟; 孙守如
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: CN108754006B

Abstract

本发明属于甜瓜基因工程技术领域，具体涉及一个与甜瓜（Cucumis melo L.）蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记及其应用专利申请事宜。该分子标记命名为CmSSR17253；由CmSSR17253‑F和CmSSR17253‑R组成。该分子标记可用于识别、定位甜瓜短蔓基因si和正常蔓基因SI，用于分子标记辅助育种。本申请能够较好克服现有常规育种筛选、鉴定方法的时间周期长、工作量大等缺陷，从而大幅加速育种进程；另一方面，由于借助于PCR扩增方法进行检测，具有特异性好、准确度高、鉴定效率高等优点，可在甜瓜幼苗早期即可准确判定甜瓜材料表型，从而有针对性开展后续育种工作。

Description

与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记

技术领域

本发明属于甜瓜基因工程技术领域，具体涉及一个与甜瓜（Cucumis melo L.）蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记及其应用专利申请事宜。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物，具有营养物质含量丰富、适应性广、产量高、易运输等特点，在我国瓜菜周年供应以及出口创汇中占有重要的地位。随着甜瓜产业的迅速发展，现在我国大多地区甜瓜种植多采用日光温室或大棚等设施栽培方式，该类栽培方式以直立式栽培为主。普通甜瓜瓜蔓长度约为2m左右，株型较高，在设施栽培中会影响植株光照利用效率，且高植株的田间管理费时费力，不利于设施栽培管理。因此，理想高度株型的甜瓜种质资源对选育更适于温室、大棚等设施栽培及机械化采收的甜瓜新品种具有十分重要的意义。

发明人的初步研究表明，甜瓜蔓茎长短这一表型性状由SI/si基因控制。甜瓜短蔓基因si是单基因隐性遗传基因，所以用于制备短蔓甜瓜品种时的双亲材料必需同时含有si基因。同时由于si杂合材料表型表现为正常型，无法直接通过外观性状判断其是否含有甜瓜短蔓基因si，故传统育种时需通过对其进行自交、测交等方式鉴定其基因型。这不仅加大了工作量，而且延缓了育种进程。

DNA 分子标记辅助育种技术可以在分子水平上利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记准确鉴定植株的基因型，且不受周围环境和时间的影响，可有效减少工作量，加速育种进程。因此与SI/si紧密连锁的分子标记的获得和利用将对甜瓜短蔓材料的选育提供极大的帮助。

发明内容

本申请目的在于提供一个与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si（short-internode）紧密连锁的分子标记CmSSR17253，该SSR分子标记具有特异性强、稳定性好的特点，可以用于筛选、鉴定甜瓜材料中是否含有短蔓基因si。

本发明的技术方案详述如下。

与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记，该分子标记命名为CmSSR17253；

甜瓜蔓茎长短的表型性状，分为正常蔓茎（长蔓茎）和短蔓茎，正常蔓茎材料中，含有SI基因，为显性控制（基因型为SI/si、或者SI/SI）；短蔓茎材料中，含短蔓基因si，为隐性控制（基因型为si /si）；

所述分子标记CmSSR17253，由一对PCR扩增用的上游引物（CmSSR17253-F）和下游引物（CmSSR17253-R）组成，具体碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，具体如下：

CmSSR17253-F：5'- ACATACCCAAGCCCACTCAG-3'，

CmSSR17253-R：5'-ACAAAAATGGTCCCCAACAA-3'。

利用所述CmSSR17253引物对进行PCR扩增时，如果扩增模板为纯合正常长蔓茎表型甜瓜材料（SI/SI），扩增特征条带为199 bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

ACATACCCAAGCCCACTCAGCAATCTCTCAACATCCTGACAAAATAATAATAATAATAATAATAATAAGGAACCTATTTAGGGGAGTGGGGGGGGTTATTTTCGTCATTCGCCATTCAAAGCAAAAGGACATATCACTCATGATTTAGAGATTCCAGAAAATGATGGCTTTTTGGCCACTTGTTGGGGACCATTTTTGT；

所述正常型甜瓜材料，具体例如为正常型甜瓜材料M323；

如果扩增模板为短蔓茎表型（si/si）甜瓜材料，扩增特征条带为202 bp，碱基序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

ACATACCCAAGCCCACTCAGCAATCTCTCAACATCCTGACAAAATAATAATAATAATAATAATAATAATAAGGAACCTATTTAGGGGAGTGGGGGGGGTTATTTTCGTCATTCGCCATTCAAAGCAAAAGGACATATCACTCATGATTTAGAGATTCCAGAAAATGATGGCTTTTTGGCCACTTGTTGGGGACCATTTTTGT；

所述短蔓甜瓜材料，具体例如为短蔓甜瓜材料M406；

如果扩增模板为杂合的正常长蔓茎表型甜瓜材料（SI/si），则扩增特征条带包括上述199bp的SEQ ID NO.3和202 bp的SEQ ID NO.3两个条带。

利用所述与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记CmSSR17253，可制备用于鉴定是否包含短蔓基因si的甜瓜种质资源PCR扩增用试剂盒，该试剂盒中除包含必须的CmSSR17253引物外，还应包括PCR反应和电泳分析所需的试剂。

所述与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记CmSSR17253在甜瓜育种中的应用，用于识别、定位甜瓜短蔓基因si和/或正常蔓基因SI，用于分子标记辅助育种。

利用与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记CmSSR17253鉴别甜瓜种质资源是否含有短蔓基因si基因的筛选方法，具体包括如下步骤：

（1）对筛选鉴定的甜瓜材料的基因组DNA进行提取；

（2）以步骤（1）所提取基因组DNA为模板，利用CmSSR17253引物进行PCR扩增；

10μL扩增反应体系可参考设计如下：

基因组DNA模板，30ng/μL、1μL；

CmSSR17253-F引物，0.5μL、5 μmol/L；

CmSSR17253-R引物，0.5μL、5 μmol/L；

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃、5min；

对PCR扩增产物4℃保存备用，或者直接进行电泳检测；

电泳检测时，具体例如进行8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳时：聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为0.6×TBE，200V恒压电泳1~1.5h，最后银染显色；

（3）依据步骤（2）中的电泳结果进行判定，具体而言：

如果电泳条带包含有202 bp条带，则表明待筛选鉴定甜瓜材料中含有短蔓基因si；如果电泳条带仅有199 bp条带，则表明待筛选鉴定甜瓜材料中不含有短蔓基因si。

总体而言，本申请首次提供了与甜瓜短蔓基因si紧密连锁的分子标记CmSSR17253，及利用该分子标记对si基因进行快速准确筛选的方法，可在甜瓜生长的任意阶段进行筛选、检测和判定，能够较好克服现有常规育种筛选、鉴定方法的时间周期长、工作量大等缺陷，从而大幅加速育种进程；另一方面，由于借助于PCR扩增方法进行检测，具有特异性好、准确度高、鉴定效率高等优点，可在甜瓜幼苗早期即可准确判定甜瓜材料表型（是否含有短蔓基因si），从而有针对性开展后续育种工作。总之，由于分子辅助育种技术的便捷性、高效性等技术优势，使得本申请所提供分子标记及筛选鉴定方法在甜瓜育种中具有很好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为短蔓甜瓜材料M406和正常型甜瓜材料M323；

图2为分子标记CmSSR17253在M323 × M406的F₂群体部分单株中的扩增结果；从左至右泳道1是正常亲本M323，泳道2是短蔓亲本M406，泳道3是F₁，泳道4-63是F₂群体中随机挑选的60植株的PCR扩增结果；下面的条带代表与SI基因连锁，上面的条带代表与si基因连锁；

图3为甜瓜短蔓基因si的精细定位示意图；

图4为分子标记CmSSR17253在短蔓材料M406、正常材料M323和20份正常型材料中的扩增结果；从左至右泳道1是Marker，泳道2是短蔓亲本M406，泳道3是正常型亲本M323，泳道4至泳道23是从市场搜集到的20份正常型甜瓜材料，详细信息参见实施例部分的表1。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

短蔓甜瓜材料M406，由美国农业部USDA种质资源中心提供，该材料节间缩短，株型紧凑，主蔓较短（如图1右所示）；

正常型甜瓜材料M323，由美国农业部USDA种质资源中心提供，该材料节间正常，株型正常，主蔓较长（如图1左所示）；

实验过程中，甜瓜材料种植于河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程中，催芽后进行穴盘育苗，采用正常的甜瓜栽培管理方式，在两叶一心时进行定植，在定植后第30天、45天、60天通过目测对表型进行调查，与M406紧凑矮化的表型表现一致的植株为为短蔓，与M323表型表现一致的为长蔓，进行调查统计；

PCR扩增用引物及基因测序工作，由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供完成。

实验试剂：

PCR扩增用PCR MagicMix 3.0，购于北京天恩泽基因科技有限公司；

电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、AgNO₃、NaOH和甲醛等试剂，购自北京索莱宝科技有限公司；

实验设备：

PCR仪，珠海黑马医学仪器有限公司Hema9600型基因扩增仪；

JY300HC通用型电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限公司生产；

HT-SCZ04A高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任公司生产。

实施例1

本实施例主要介绍一下针对甜瓜短蔓基因si的定位及分子标记CmSSR17253的筛选获得过程。该过程包括：以短蔓甜瓜材料M406和正常型甜瓜材料M323为基础所构建的分离群体，以及对于相关分子标记引物的初步筛选、二次筛选，以及对于短蔓基因si的初步定位、精细定位等过程。具体过程简要介绍如下。

（一）分离群体的构建

本实施例以短蔓甜瓜材料M406和正常型甜瓜材料M323为基础进行杂交配制获得F₁，F₁代群体单株全部表现为正常型性状。然后将F₁代植株自交获得F₂代群体，F₂代群体共有1261个单株，鉴定每个单株的株高情况，其中正常型单株931个，短蔓单株330个，经卡方检验符合3:1的分离比例。这一结果表明，甜瓜短蔓性状是由1对隐性单基因控制的，将该基因命名为si，正常蔓（SI）对短蔓（si）为完全显性。

（二）对分子标记的筛选和对短蔓基因si的定位

（1）提取甜瓜基因组DNA

在筛选分子标记前，以甜瓜叶片为材料，采用CTAB法分别提取亲本及F₁、F₂代群体叶片的基因组DNA，具体操作参考如下：

取约1cm²大小的真叶至2 mL离心管，加入750μL CTAB裂解缓冲液后置于打样器打样5分钟， 65℃水浴15分钟，期间每隔5分钟轻微上下颠倒使之充分混匀；

向上述匀浆裂解液中加入750μL氯仿异戊醇(24:1，v/v)，上下颠倒充分混匀，4℃、12000rpm离心15分钟；

吸取上清液500μL至1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于-20℃静置120分钟；

4℃、12000rpm离心15分钟，弃上清，沿离心管壁加入500μL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁后弃去乙醇；

室温干燥沉淀30分钟，加入100μL含RNA酶的TE缓冲液溶解，37℃水浴30分钟；

核酸仪测定DNA浓度后用TE缓冲液稀释终浓度为30ng/μL，-20℃保存备用。

（2）多态性分子标记的初步筛选

分别以双亲M406和M323材料基因组DNA为模板，对前期所设计的多对CmSSR引物进行初步筛选（由于序列较多，且多数序列与本申请关联不大，因此不再详细提供），筛选原则为：在双亲间存在多态性，PCR扩增条带清楚、易于识别、并可以稳定扩增；最终初步获得345条引物序列（由于序列较多，且多数序列与本申请关联不大，因此不再详细提供）。

进一步，将筛选出的多态性SSR标记对F₂群体进行基因型分析，将所获得的与短蔓亲本相同带型的记作1，与正常亲本相同带型的记作2，获得杂合带型的记作3。

多态性筛选分析过程中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因组DNA，30ng/μL、1μL（约30ng）；

F、R引物，各0.5μL（引物浓度均为5 μmol/L）

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃5min。

需要解释的是，上述PCR扩增体系中的F、R引物分别代表一对引物中的前引物和后引物。

对PCR扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为0.6×TBE，200V恒压电泳1~1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：

A、将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动直至指示剂退去颜色，其中固定液的组成为，冰醋酸：无水乙醇：蒸馏水的体积比为0.5:10:100；

B、用超纯水洗1~3min；

C、将冲洗后的胶板放入染色液中摇动10 min，染色液为0.2%硝酸银水溶液；

D、将染色后的胶板放入超纯水中漂洗30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15g NaOH和3mL甲醛混匀得到的；

E、最后放入自来水反复漂洗几次；

F、室温下干燥，然后拍照。

（3）短蔓基因si的初步定位及新标记开发

结合F₂群体表型调查数据和步骤（2）中最终SSR标记的分型结果，利用JoinMap4.0软件，对甜瓜短蔓基因进行初步定位，结果获得2个与si基因紧密连锁的SSR分子标记：CmSSR17293和CmSSR17145（相关编码为研究过程中发明人自行编码，并不具有特殊含义），这两个分子标记位于短蔓基因si的两端，分别与si基因相距5.21cM和21.70cM（如图3所示）。

进一步基于已知甜瓜基因组数据库的信息，在短蔓基因si 的初步定位区间内进一步有针对性开发设计新的分子标记。

（4）新标记筛选和短蔓基因si的精细定位

基于性状表现的分离群体分组分析法（BSA）原理，在F₂群体中随机选取10株短蔓单株和10株正常型单株构建短蔓基因池和正常型基因池，分别以短蔓基因池、正常型基因池为模板，对步骤（3）中新开发的引物进行多态性筛选，PCR反应体系及电泳方法参照步骤（2）。

进一步地，利用筛选到的引物在F₂群体单株中进行验证，对短蔓基因si进行精细定位；最终获得一个与甜瓜短蔓基因si紧密连锁的分子标记CmSSR17253，与短蔓基因si紧密连锁，相距0.32cM。

扩增该分子标记时的引物对包括引物CmSSR17253-F 和CmSSR17253-R，具体碱基序列如下所示：

CmSSR17253-F：5'- ACATACCCAAGCCCACTCAG-3'，

CmSSR17253-R：5'-ACAAAAATGGTCCCCAACAA-3'。

利用所述分子标记CmSSR17253进行PCR扩增反应体系及电泳方法参照步骤（2），电泳结果如图2所示。

对扩增产物进行测序分析可知：

利用分子标记CmSSR17253对短蔓甜瓜材料进行PCR扩增时，特征条带长度为202 bp，碱基序列如SEQ ID 1所示；

利用分子标记CmSSR17253对纯合正常甜瓜材料进行PCR扩增时，特征条带长度为199bp，碱基序列如SEQ ID 2所示；

利用分子标记CmSSR17253对自然群体进行PCR扩增时，则可能出现三种电泳结果：

仅出现202 bp特征条带，说明DNA模板对应的甜瓜材料是含有甜瓜短蔓基因si的隐性纯和材料（si/si）；

仅出现199 bp特征条带，说明DNA模板对应的甜瓜材料是包含有正常型基因SI的显性纯和材料（SI/SI）；

同时出现202 bp和199bp两种条带，说明DNA模板对应的甜瓜材料是同时包含有正常型基因SI和短蔓基因si的正常型杂合材料（SI/si）。

实施例2

为检验实施例1所筛选分子标记CmSSR17253在短蔓基因si筛选中的准确性，随机挑选了20份不同遗传背景的甜瓜正常蔓材料，进行了实际验证，相关过程简要介绍如下。

表1，20份不同遗传背景的甜瓜材料信息：

。

对这20份不同遗传背景的甜瓜材料分别提取基因组DNA，利用引物对CmSSR17253-F 和CmSSR17253-R进行PCR扩增和电泳检测（具体操作可参考实施例1）。结果如图4所示。

分析可以看出，条带结果显示与材料表型（短蔓/正常型）的一致性为100%。说明CmSSR17253可快速准确的鉴定和区分si/si、SI/si和SI/SI基因型。

基于这一结果，结合分子标记辅助选择，以甜瓜短蔓突变体材料M406与正常型材料进行杂交，经过多代回交，将M406的短蔓基因si导入到正常型材料中，可大大提高育种效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 1

acatacccaa gcccactcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 2

acaaaaatgg tccccaacaa 20

<210> 3

<211> 202

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 3

acatacccaa gcccactcag caatctctca acatcctgac aaaataataa taataataat 60

aataataata aggaacctat ttaggggagt ggggggggtt attttcgtca ttcgccattc 120

aaagcaaaag gacatatcac tcatgattta gagattccag aaaatgatgg ctttttggcc 180

acttgttggg gaccattttt gt 202

<210> 4

<211> 199

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 4

acatacccaa gcccactcag caatctctca acatcctgac aaaataataa taataataat 60

aataataagg aacctattta ggggagtggg gggggttatt ttcgtcattc gccattcaaa 120

gcaaaaggac atatcactca tgatttagag attccagaaa atgatggctt tttggccact 180

tgttggggac catttttgt 199

Claims

1.与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记，其特征在于，该分子标记命名为CmSSR17253；

所述分子标记CmSSR17253，由一对PCR扩增用的上游引物CmSSR17253-F和下游引物CmSSR17253-R组成，具体碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，具体如下：

CmSSR17253-F：5'- ACATACCCAAGCCCACTCAG-3'，

CmSSR17253-R：5'-ACAAAAATGGTCCCCAACAA-3'。

2.利用权利要求1所述与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记CmSSR17253所制备的用于鉴定是否包含短蔓基因si的甜瓜种质资源PCR扩增用试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含CmSSR17253分子标记，即，包含引物对CmSSR17253-F和CmSSR17253-R。

3.权利要求1所述与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记CmSSR17253在甜瓜育种中的应用，其特征在于，用于识别、定位甜瓜短蔓基因si和正常蔓基因SI，用于分子标记辅助育种。

4.利用权利要求1所述与甜瓜蔓茎长短性状基因SI/si紧密连锁的分子标记CmSSR17253鉴别甜瓜种质资源是否含有短蔓基因si基因的筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）对筛选鉴定的甜瓜材料的基因组DNA进行提取；

（2）以步骤（1）所提取基因组DNA为模板，利用CmSSR17253引物进行PCR扩增；并对扩增产物进行电泳检测；

（3）依据步骤（2）中的电泳结果进行判定，具体而言：

如果电泳条带包含有202 bp条带，则表明待筛选鉴定甜瓜材料中含有短蔓基因si；如果电泳条带仅有199 bp条带，则表明待筛选鉴定甜瓜材料中不含有短蔓基因si；

所述199 bp条带，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

所述202 bp条带，碱基序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

ACATACCCAAGCCCACTCAGCAATCTCTCAACATCCTGACAAAATAATAATAATAATAATAATAATAATAAGGAACCTATTTAGGGGAGTGGGGGGGGTTATTTTCGTCATTCGCCATTCAAAGCAAAAGGACATATCACTCATGATTTAGAGATTCCAGAAAATGATGGCTTTTTGGCCACTTGTTGGGGACCATTTTTGT。

5.如权利要求4所述鉴别甜瓜种质资源是否含有短蔓基因si基因的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，10μL扩增反应体系设计如下：

基因组DNA模板，30ng/μL、1μL；

CmSSR17253-F引物，0.5μL、5 μmol/L；

CmSSR17253-R引物，0.5μL、5 μmol/L；

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃、5min。

6.如权利要求4所述鉴别甜瓜种质资源是否含有短蔓基因si基因的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，电泳检测时，进行8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。