CN116162727A - 与西瓜黄化性状共分离的InDel标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与西瓜黄化性状共分离的Inde1标记及其应用，属于分子育种领域。本发明可以直接用于西瓜黄化植株的分子标记辅助育种，提高育种的选择效率，加快育种进程；值得注意的是，本发明中黄化材料与常规黄化材料不同。该材料在适宜的生长条件下只有生长周期后期植株产生黄化表型，前期植株颜色与野生型无差异；当材料在任意生长时期受到胁迫时，植株会较早出现黄化表型。可以利用这一特性通过共分离标记将其片段导入已有商品种中，作为一个形态学标记反应自身生长状况。同时，可为最终实现西瓜黄化基因Clyp的定位、叶绿体发育及叶绿素合成调控网络的研究奠定基础，从而提高西瓜光合效率，提高果实品质。

Description

与西瓜黄化性状共分离的InDel标记及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一个与西瓜植株黄化性状共分离的Indel标记及其应用。

背景技术

育种中对于基因型的选择是最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型来进行后续的培育。在传统的育种过程中，选择的依据往往是通过植株的外观表型来判定，这种选择耗时较长且可能因为性状模糊时与要求基因型有偏差，造成选择错误并且效率低下。而利用分子标记辅助育种可以从苗期快速检测到目标基因或与目标性状共分离的位点，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。

Indel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，相对一个亲本而言，另一个亲本的基因组中有一定数量核苷酸的插入或缺失。其本质仍属于长度多态性标记，可利用便捷的电泳平台进行快速基因分型。

中国作为目前世界上西瓜生产和消费第一大国，栽培面积及产量巨大。西瓜是人们夏季消暑解渴的重要水果，其在世界园艺作物中占有非常重要的地位。随着人们生活水平的提高，其对生活中所食用的瓜果的品质的要求也越来越高。

蔬菜、瓜果的品质是决定其商品性的一个重要条件，决定品质的条件主要在两个方面。一方面是由育种家决定的，种植商品种本身品质的好坏；另一方面是栽培者决定的，在其栽培整个生长周期管理的好坏。当其因为品质不好导致栽培者和育种家产生商业纠纷时，往往无法区分是栽培者还是育种家的责任。同时，在蔬菜、瓜果的栽培管理中要比大田作物更加精细。需要栽培栽培者随时根据植株的生长状况补充必要营养物质。那么如果让植物能够自身反馈体内是否缺乏营养物质将对于栽培者的管理提供巨大的方便。

植物中叶绿素合成与代谢途径涉及多个基因，任何相关基因的突变都有可能导致叶绿体发育缺陷，引起叶绿体光合作用降低，叶绿素含量改变，植株表现出各种叶色突变表型，同时影响植株的产量与果实品质。

叶绿素分子的生物合成是从L-谷氨酰-tRNA开始，通过15种酶的参与经历19步反应最终合成叶绿素a和叶绿素b。途径中的基因突变会导致植物黄化(CHL、PORA、CAO1)、坏死病斑(PORB)、生长势弱、早衰等表型，更有甚者会出现突变致死(HEMF)现象。

叶绿素降解途径的基因突变往往使植物体内叶绿素无法降解，产生滞绿的表型。目前已报道突变可导致滞绿的基因有PAO、NYC1、NOL、PPH、SGR等，其中SGR基因的发现是近年来叶绿素降解调控研究中的一个里程碑，SGR基因突变在导致植株长期保持绿色的同时，让植物有更长的时间进行光合作用，增加光合产物从而提高产量和果实品质。另外SGR也报道与植物抗性有关，突变体的抗逆性更强，滞绿性状在农作物增产增收上具有巨大的应用前景。

目前已报道多个光响应转录因子(GLK、HY5等)可直接调控叶绿素途径中基因的表达，在调控植物叶绿体发育和光合作用中发挥着重要的作用。

随着世界人口的持续增长，特别是随着气候干旱和自然灾害的频繁发生，光合效率的提高已经成为作物育种的重要目标。近年来关于西瓜的分子育种相关研究迅速发展，许多优异的性状已经进行了基因定位，开发出的一些与调控性状基因共分离标记的也已经开始用到分子标记辅助育种过程当中。通过对西瓜黄化性状的研究，对所定位到的突变黄化基因研究可提高植物的光合效率、对非生物胁迫的抗性，有效增加产量和果实品质。

发明内容

本发明的目的之一是提供一对与西瓜黄化性状共分离的InDel标记。

本发明目的之二在于提供上述分子标记在西瓜分子育种的应用。

本发明目的之三在于提供西瓜黄化品种/基因型的判定方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

与西瓜黄化性状基因Clyp共分离的一对分子标记，该分子标记为Indel分子标记，命名为Indel18标记，与西瓜黄化性状共分离多态性分子标记是基于基因Clyp开发的，扩增所述的Indel18标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的另一目的为可通过将上述Indel18标记共分离片段导入商品种中。作为一个形态学上的标记，使植株能够随时反应自身生长状况，使栽培者能够及时提供必要营养。同时当种植出来的果实品质差时，可以明确区分出是栽培者管理问题还是育种家选育种子本身的问题，从而解决一些商业纠纷。

本发明中的黄化材料与常规黄化材料不同。材料在适宜的生长条件下只有生长周期后期植株由根部向上慢慢变黄，其黄化部位包含西瓜植株的叶片、茎以及果实，均会由最初的绿色转变为黄色。前期植株颜色与野生型无差异；然而无论任何生长时期当材料受到胁迫时，植株就会提前出现明显的黄化表型。

本发明还公开了一种西瓜黄化品种/基因型的判定方法，采用PCR扩增的方法进行检测，所述方法包括如下步骤：

(1)提取西瓜组织的DNA；

(2)PCR扩增：利用上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ IDNO.2所示的引物对，对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)中所述的引物对所扩展片段电泳检测或sanger测序；

(4)根据步骤(3)的电泳条带结果进行判定，具体标准为：

如果PCR扩增产物为长度111bp的特征条带，则待测植株为纯合西瓜黄化材料；如果PCR扩增产物为201bp的特征条带，该待测植株为纯合西瓜正常材料，如果PCR扩增产物为两条，长度分别为111bp、201bp的特征条带，该待测植株为杂合西瓜正常材料；

或者，用以下来表述：

如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为111bp的特征条带，则该待测西瓜为纯合西瓜黄化性状的品种/基因型；如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为201bp的特征条带，则待测西瓜为纯合西瓜正常品种/基因型；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为111bp的特征条带，又有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为201bp的特征条带，则该待测西瓜为杂合西瓜正常品种/基因型。

具体地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL、2xPCR Mix 5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、灭菌蒸馏水3μL，总体积10μL。PCR扩增条件为：95℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、50s，共35个循环；72℃、10min；4℃保存。

另外，包含上述引物对的试剂盒，可以用来鉴定西瓜材料是否为西瓜黄化性状，具体应用时，可以选择含有引物对做成试剂盒。

本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还保护含有所述重组载体的重组细胞。

本发明的优点：

一方面，本发明的分子标记可为最终实现对Clyp基因的克隆，进而为西瓜叶绿素合成与降解的分子机制研究奠定基础。上述分子标记可直接用于西瓜植株黄化材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本发明所提供的分子标记在新品种培育中具有较好的应用价值。

另一方面，本发明中的黄化材料相对与常规黄化材料不同，其材料是在其受到非生物胁迫时出现黄化表型。是到目前为止从未见在西瓜中报道的。可通过报道共分离Indel标记将其基因组片段导入已有商品种中。解决一些因责任划分不清产生的商业纠纷，因而本发明中的分子标记对西瓜产业的发展也有一定的应用价值。

本申请对西瓜植株黄化性状相关基因进行了详细研究，利用分子标记和染色体步移法等相关研究方法，最终确定一个与西瓜植株黄化共分离的Indel分子标记。定位结果表明，植株黄化基因Clyp位于两个分子标记Indel4、Inde114之间，物理距离仅88Kb；区间内Inde118分子标记与西瓜黄化性状共分离。这一发现为最终Clyp基因的克隆、分子标记辅助育种体系的建立奠定基础，同时也有助于最终西瓜叶绿素的合成与代谢调控网络的研究奠定基础。另外由于本发明中材料突变的特殊性，对于产业的发展有一定的帮助。总之，由于分子标记对于最终功能基因定位具有十分重要意义，加上分子标记在分子标记育种体系建立中具有简便、快速、高通量的优势，因而使得本申请具有十分重要的应用价值，对于西瓜新品种培育也具有十分重要的保护意义。

附图说明

图1为西瓜正常材料WT2(左)和西瓜黄化材料WM103表型照片(右)；

图2为针对西瓜黄化性状基因定位Clyp精细定位图；

图3为共分离标记Indel18在亲本及F₂代群体中的凝胶电泳图；

图中，M为DL2000 Marker，图中显示的为100bp和250bp条带；P1代表西瓜正常材料WT2，P2代表西瓜黄化材料WM103；

图4为为共分离标记Indel18在亲本及自然材料中的凝胶电泳图；

图中，M为DL2000 Marker，图中显示的为100bp和250bp条带；P1代表西瓜正常材料WT2，P2代表西瓜黄化材料WM103。

具体实施方式

下面结合申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中生物材料、实验试剂及相关实验背景情况简要介绍如下。

生物材料：

西瓜黄化材料WM103(母本)，其生长周期后期整个植株黄化，前期与西瓜正常材料无差异且能够稳定遗传(图1右)；

西瓜材料WT2(父本)是由发明人选育的高代自交系，该材料为西瓜正常材料且能够稳定遗传(图1左)。

上述西瓜材料WT2，与公开号为CN110938706A的中国发明专利“与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用”中采用的正常普通有卷须以及公开号为CN110938706A的中国发明专利“与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记及应用”中采用的网状覆纹西瓜材料WT2是一致的。

以上材料均可以通过商业的途径或者河南农业大学瓜类作物遗传育种课题组提供。

实验过程中，西瓜材料种植于河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程中，催芽后进行穴盘育苗，采用正常的西瓜栽培管理方式，在其定植后45天对相关表型性状进行初步调查统计，在定植后60天对相关表型性状再次调查确认。

PCR扩增用引物及基因测序工作，由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供完成；

实验试剂：

PCR扩增用PCR MagicMix 3.0，购于北京天恩泽基因科技有限公司；

电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、AgNO₃、NaOH和甲醛等试剂，购自北京索莱宝科技有限公司；

实验设备：

PCR仪，珠海黑马医学仪器有限公司Hema9600形基因扩增仪；

JY300HC通用形电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限公司生产；

HT-SCZ04A高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任公司生产。

实施例

本实施例主要介绍一下对于西瓜黄化基因Clyp的精细定位过程，包括遗传分离群体的构建、初步定位、精细定位等过程，在此过程中涉及最终与西瓜黄化性状共分离Indel18分子标记的开发、设计及检验过程，相关实验过程简要介绍如下。

一、遗传分离群体的构建

以西瓜黄化材料WM103(图1右)作为母本，以西瓜正常材料WT2(图1左)作为父本(需要解释的是，实验期间，从材料易得性及操作方便考虑，发明人以WT2作为父本，在采用其他纯合正常材料时，同样可以进行相关实验)，利用这两个亲本配置了杂交组合，结果表明，获得的F₁代正常植株颜色。

从F₁代植株中选择10个单株，自交获得F₂代种子，用于遗传分析与基因定位。对这些F₂代个体的性状表型进行鉴定，并用卡方测验进行验证。

结果表明：

初步定位时，种植包含302株的F₂代小群体，其中正常表型植株216株，西瓜黄化表型植株86株，χ²＝1.8585＜3.84，符合3∶1的分离比。

精细定位时，种植包含1071株F₂代大群体，其中正常表型植株796株，西瓜黄化表型植株275株，χ²＝0.0999＜3.84，同样符合3∶1的分离比。

综合分析可知，西瓜植株黄化性状是由1对隐性基因控制的，将该基因命名为Clyp，正常表型(YP)对黄化表型(yp)为完全显性。

二、基因的初步定位

采用BSA法进行初步定位，具体实验过程为：

(1)首先，制备基因池，具体为：

在上述步骤一的F₂代群体中随机选取20个正常表型单株与20个黄化表型单株，在定植后45天从每个单株上面采集较为幼嫩的叶片，采用CTAB法提取其基因组DNA，并分别混合制成正常基因池和黄化基因池(正常表型与正常表型混合，黄化表型与黄化表型混合)。

(2)多态性筛选分析，具体为：

利用发明人前期从西瓜全基因组开发的1256对SSR引物(具体引物序列参考《Genome wide characterization of simple sequence repeats in watermelon genomeand their application in comparative mapping and genetic diversity analysis》，Zhu et al.，BMC Genomics，2016，17：557-573.)，筛选在亲本间具有多态性的标记。其中共有175个标记在亲本间表现出多态性。接着通过在亲本间有多态性的175个标记对步骤(1)中所制备的两个基因池进行第二次多态性筛选，获得了4个在两个基因池间具有多态性的标记。根据SSR标记的信息，4个在双亲及混池间都具有多态性的标记均位于第10号染色体的前端。

进一步，将筛选出的多态性SSR标记对302株F₂群体(步骤一中初步定位时所选择)进行基因型分析，将所获得的与黄化亲本WM103相同带形的记作“1”，获得与正常亲本WT2相同带形的记作“2”，获得杂合带形的记作“3”。

多态性筛选分析过程中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因池样品(基因组DNA，30ng/μL)，1μL(约30ng)；

F、R引物，各0.5μL(引物浓度均为5μmol/L)

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃5min。

需要解释的是，上述PCR扩增体系中的F、R引物分别代表引物中的前引物和后引物；1256对SSR引物，由于这些引物与本申请欲保护主题并不直接关联，文本简明起见，不再详细说明。

对PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为0.6×TBE，200V恒压电泳1～1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：

A、将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动直至指示剂退去颜色，其中固定液的组成为，冰醋酸∶无水乙醇∶蒸馏水的体积比为0.5∶10∶100；

B、用超纯水洗1～3min；

C、将冲洗后的胶板放入染色液中摇动10min，染色液为0.2％硝酸银水溶液；

D、将染色后的胶板放入超纯水中漂洗30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15g NaOH和3mL甲醛混匀得到的；

E、最后放入自来水反复漂洗几次；

F、室温下干燥，然后拍照。

(3)基因初步定位

具体为：结合初步定位群体表型调查数据和步骤(2)中最终SSR标记的分型结果，利用JoinMap4.0软件，对西瓜黄化性状基因进行初步定位，结果获得2个与Clyp基因紧密连锁的SSR分子标记：ClSSR26748和ClSSR26967(相关编码为研究过程中发明人自行编码，并不具有特殊含义)，这两个分子标记位于西瓜黄化基因Clyp基因的两端，两个SSR分子标记的物理距离相距1.39MB(图2)。

三、基因的精细定位

在步骤二初步定位基础上，发明人进一步对与西瓜黄化性状基因Clyp基因进行了精细定位，具体过程简要介绍如下。

(1)作图群体的扩大：

在初步定位的基础上，我们将进一步将F₂代作图群体增加到1071株，然后选用初步定位两端的标记ClSSR26768、ClSSR26748和ClSSR26967进行基因型分析，目的基因仍然定位在C1SSR26748和ClSSR26967之间。

(2)亲本重测序和基因组比对

利用Illumina Hi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度＞30倍；以已公布的以西瓜全基因组序列在SSR标记ClSSR26748和C1SSR26967之间1.39MB的区段的作为参考序列，用网上公开的免费软件包BWA(http：//bio-bwa.sourceforge.net/)分别将两个亲本的重测序序列和候选区段进行比对，找到两个亲本在候选区段的差异位点。

(3)精细定位

由于初定位区间内没有更多的多态性SSR标记，我们比较两亲本基因组在初步定位的候选区段内的序列差异，继续开发Indel标记，将这些标记在亲本间进行了多态性筛选，利用新开发的Indel标记对(1)中扩大的群体进行基因型分析，进一步将区间缩小至Indel3、Indel5之间，两者相距360Kb继续通过开发的Indel分子标记在筛选的重组单株中缩小区间，。最终目的基因确定是定位在Indel4和Indel14之间，两者相距88kb(图2)。

(4)共分离Indel标记的开发

在其88Kb的候选区段中我们发现在突变体材料相对野生型材料中有一个90bp的缺失位点，针对于这90bp的缺失开发出Indel18分子标记。通过在F₂代随机挑选单株验证发现，Indel18分子标记与西瓜黄化性状共分离(图3)。

其中分子标记Indel18，由一对PCR扩增用的上游引物(Indel18-F)和下游引物(Inde118-R)组成，具体而言：

Indel18-F：5’-AGATTGCAAAACTGGAGCAACT-3’(SEQ ID NO.1)；

Indel18-R：5’-AGCATTTGCAGCTTTTATCACA-3’(SEQ ID NO.2)；

该引物在父本(黄化材料)中的扩增产物大小为111bp，在母本(正常材料)中的扩增产物大小为201bp。具体地：

通过PCR扩增获得111bp的特征条带，所述111bp的特征条带的具体碱基序列如下所示：

AGATTGCAAAACTGGAGCAACTACATAAGTAGGATCTGGAGAAAAAAGAAAAGAACAACGACGTAATAAAGTGAACCGGTAAGAGCAGCTGTGATAAAAGCTGCAAATGCT(SEQ ID NO.3)。

通过PCR扩增获得201bp的特征条带，所述201bp的特征条带的具体碱基序列如下所示：

AGATTGCAAAACTGGAGCAACTACATAAGTAGGATCTGGAGAAAAAAGAAAAGAACAACGCTGTCATTAAGATGGAGACTGTCAACCAAATTGTAAACCAAACATTGTCTAAATGATTTGATAGGATATTGACCTTTCGGCGATGCAGCGACGTAATAAAGTGAACCGGTAAGAGCAGCTGTGATAAAAGCTGCAAATGCT(SEQ ID NO.4)。

四、分子标记的应用

(1)DNA提取、PCR扩增及电泳检测

采用常规方法CTAB法进行DNA提取，PCR反应程序和聚丙烯酰胺凝胶电泳流程参考杨会会硕士论文：西瓜少侧枝基因Clbl的精细定位及功能验证，河南农业大学，2021。

利用所述的引物对对待测西瓜样本(亲本和F₂群体)进行PCR扩增，结果发现，如果PCR扩增产物为长度111bp的特征条带，则待测植株为纯合西瓜黄化材料；如果PCA扩增产物为201bp的特征条带，该待测植株为纯合西瓜正常材料，如果PCA扩增产物为两条，长度分别为111bp、201bp的特征条带，该待测植株为杂合西瓜正常材料。

因此，根据扩增的条带情况，可以快速的区分单株的品种/基因型/性状；进一步地，发明人利用Indel18分子标记对自然群体(42份)进行PCR扩增凝胶电泳检测(图4)。结合表型数据，发现自然材料的表型与根据测定结果是一致的，表明本发明的Indel18标记用于西瓜自然群体中的黄化性状分子标记的辅助选择率为100％。基于此结果，表明本发明的分子标记Indel18能够有效地区分西瓜植株是否是黄化材料。

本发明的分子标记为最终Clyp基因的克隆、分子标记辅助育种体系的建立奠定基础，同时也有助于最终西瓜叶绿素的合成与代谢调控网络的研究奠定基础。

Claims (10)

1.与西瓜黄化性状共分离的Indel标记，其特征在于，命名为Indel18标记，扩增Indel18标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的与西瓜黄化性状共分离的Indel标记，其特征在于，所述的Indel18标记位于SEQ ID NO.4第61-150位90bp的插入/缺失。

3.权利要求1所述与西瓜黄化性状共分离的Indel标记在西瓜分子育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Indel标记用于鉴定或辅助鉴定西瓜植株黄化性状/基因型。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过西瓜黄化性状共分离的Indel标记将共分离基因组片段导入已有西瓜商品种中，给西瓜植株提供可反映自身生长状况的形态学标记。

6.一种西瓜黄化品种/基因型的判定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜样品基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对，对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)中的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(4)根据步骤(3)的电泳条带结果进行判定，具体标准为：

如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为111bp的特征条带，则该待测西瓜为纯合西瓜黄化性状的品种/基因型；如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为201bp的特征条带，则待测西瓜为纯合西瓜正常品种/基因型；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为111bp的特征条带，又有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为201bp的特征条带，则该待测西瓜为杂合西瓜正常品种/基因型。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于：用CTAB法提取供试材料的DNA。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL、2×PCRMix 5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、灭菌蒸馏水3μL，总体积10μL；PCR扩增条件为：95℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、50s，共35个循环；72℃、10min；4℃保存。

9.一种用于鉴定西瓜黄化性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的引物对。

10.用于检测Indel8标记是否存在的试剂在西瓜植株黄化基因Clyp定位中的应用，其特征在于，扩增所述标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

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