CN114381546A

CN114381546A - 与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记及应用

Info

Publication number: CN114381546A
Application number: CN202210077047.2A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 杨森; 王登科; 孙守如; 豆峻岭; 徐志红
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2022-01-19
Publication date: 2022-04-22

Abstract

本发明公开了与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记及应用，属于生物技术领域。本发明的分子标记可为最终实现对西瓜短下胚轴基因Clsh的克隆，进而为西瓜下胚轴伸长的分子机制的研究奠定基础。另一方面，由于该标记与西瓜短下胚轴Clsh共分离，因此可直接用于西瓜短下胚轴材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本发明所提供的分子标记在西瓜短下胚轴新品种培育及选育中具有较好的应用价值。

Description

与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，具体涉及与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记及应用。

背景技术

西瓜，葫芦科西瓜属，一年生蔓生草本植物，起源于非洲，在我国广泛种植。由于西瓜种植周期短，经济效益好，西瓜产业已发展为多地的特色产业。目前我国的西瓜大多为露地或建议的保护地栽培模式，因此优质种苗是西瓜优质高产的重要基础。其中下胚轴的长度是衡量种苗优劣的重要评判标准，对西瓜后期的生长发育、抗性、果实产量及品质有重要影响。但是下胚轴伸长这一过程容易受多种外界环境影响，容易造成徒长，客观上增加了培育壮苗的难度。因此，从遗传机理及分子水平揭示西瓜下胚轴伸长的分子机制，培育选育短下胚轴品种迫在眉睫。通过对西瓜短下胚轴这一性状开展精细定位，从分子层面揭开西瓜下胚轴的遗传机理及相关分子调控网络，开发出相关分子标记，加速推进短下胚轴品种的培育工作对于解决实际生产中西瓜幼苗易徒长及保证后续的生产具有重要意义。

在双子叶植物中，下胚轴是连接子叶和根的重要器官，是植物地上部、地下部物质运输，信号传递的重要通道。下胚轴的伸长受遗传因素、环境因素和代谢水平的共同调控。在细胞学水平上，下胚轴的伸长主要是由于细胞的纵向伸长，且该过程主要依赖扩展蛋白与木葡聚糖内转糖苷酶等对细胞壁的松弛效应。在下胚轴的伸长过程中，光、温等环境信号会对其产生强烈影响。目前的研究发现植物体内的一些环境感受器及受体能够响应环境信号，并通过调节相关植物激素的信号转导，调控下胚轴的伸长过程。如蓝光受体CRY1能够直接与GID1和DELLA蛋白互作，整合光信号与赤霉素从而控制下胚轴的伸长过程。

赤霉素是一类重要的植物激素，它在打破种子休眠与促进植物下胚轴伸长的过程中均发挥了重要作用。除了能够对细胞壁木葡聚糖内糖转移酶的活性，赤霉素还通过与其受体GID1结合，诱导GID1-DELLA与E3泛素连接酶互作，从而导致DELLA蛋白的泛素化，从而解除DELLA蛋白对PIF4的转录抑制，促进下胚轴伸长。进一步，此外高温和遮阴的环境条件下，COP1影响DELLA蛋白的稳定性，从而改变下胚轴的伸长状态。

近年来，针对葫芦科作物下胚轴在实际生产中容易徒长这一问题，研究者试图从遗传机制上解释其原因，且在黄瓜中取得了一些进展。蔡和序等通过对95份黄瓜核心种质的下胚轴进行调查，结合公布的高通量测序数据，发现有5个位点在不同环境中重复出现。Hu等发现了一个长下胚轴的黄瓜突变体，以此与CCMC构建群体鉴定到了 CsGy1G030000，编码一个植物激素(PΦB)合酶。Zhang等发现了一个对温度敏感的黄瓜短下胚轴突变体，通过构建图谱及序列分析，认为Csa5G171710控制了下胚轴的伸长，其编码一个木葡聚糖半乳糖基转移酶。此外，Liu等也通过RNA-seq发现短下胚轴材料突变体中的CsGA2ox7发生了剪切变异，且其中一个转录本的表达会受到光照强度的诱导，从而改变了下胚轴的伸长的模式。Bo等从半野生西双版纳黄瓜中克隆了短下胚轴基因Cssh1，其编码SMARCA3染色质重塑因子，通过与CsHY5互作，间接调控下胚轴细胞伸长。但是相关研究尚未在西瓜及甜瓜中开展。随着分子生物学实验手段的不断丰富，测序技术的普及以及高质量测序数据的公布，揭开西瓜下胚轴伸长的遗传机理成为可能。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记。

本发明目的之二在于提供一种上述分子标记在西瓜分子育种的应用。

本发明的另一目的在于提供一种西瓜短下胚轴的判定方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记，其中该分子标记为SNP标记，扩增所述分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记在西瓜分子育种的应用，该分子标记与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离，在分子水平上可以辅助鉴定西瓜短下胚轴性状，即，对该分子标记通过进一步的PCR扩增获得的产物片段进行测序，在种子时期、芽期即可判定西瓜下胚轴类型，从而加快相关育种进程。本领域技术人员可以理解，比如通过使用本发明提供的分子标记来辅助判定西瓜下胚轴类型。

本发明还公开了一种西瓜下胚轴性状的判定方法，所述判定方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用上述分子标记的引物对进行 PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序；

(3)根据步骤(2)的测序结果进行判定，具体标准为：

使用Sanger测序技术对PCR产物进行检测，若在扩增产物的第245位碱基为单峰且为G，则待测品种为纯合正常下胚轴西瓜品种；若在扩增产物的第245位碱基为单峰为 A，则待测品种为纯合短下胚轴西瓜品种；若在扩增产物的第245位碱基表现为双峰，则待测品种为杂合正常下胚轴品种。

另外，包含上述引物对的试剂盒，可以用来鉴定西瓜材料的下胚轴类型，具体应用时，可以选择含有上述分子标记引物对的试剂做成试剂盒。

再者，用于检测SNP标记是否存在的试剂在西瓜短下胚轴Clsh定位中的应用，利用本发明的分子标记，可以对西瓜短下胚轴基因Clsh进行定位，上述这些应用均可以按照常规的方法进行。

需要说明的是，本申请中，西瓜正常下胚轴基因ClSH与西瓜短下胚轴基因Clsh为等位基因，其中西瓜正常下胚轴基因ClSH为显性控制(即含有该基因的西瓜表现为正常的下胚轴，也即对应基因对为CSH/ClSH或ClSH/Clsh)，而西瓜短下胚轴Clsh为隐性控制(即，只有纯合基因对Clsh/Clsh时，该西瓜品种的下胚轴表现为短下胚轴。)

还需要说明的是，本申请中，所述的正常西瓜长下胚轴一般为6-8cm，短下胚轴一般为3-5cm。

本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还保护含有所述重组载体的重组细胞。

本发明的优点：

本发明的分子标记可为最终实现对西瓜短下胚轴基因Clsh的克隆，进而为西瓜下胚轴伸长的分子机制的研究奠定基础。另一方面，由于该标记与西瓜短下胚轴Clsh共分离，因此可直接用于西瓜短下胚轴材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本发明所提供的分子标记在西瓜短下胚轴新品种培育及选育中具有较好的应用价值。

在西瓜选择育种过程中，往往要产生大量的分离群体，采用该分子标记，可以在苗期中鉴定出所需要的植株，不仅减少了育种过程中的占地面积，同时也减少植株长大后鉴定所需的人力物力，大大提高育种的效率、缩短选择年限。

附图说明

图1为西瓜正常下胚轴材料WT2和短下胚轴材料WM204；

图2为西瓜短下胚轴基因Clsh精细定位图；

图3A为SNP位点在基因组中的位置；图3B为部分自然材料SNP位点序列差异。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1与西瓜植株短下胚轴基因Clsh紧密连锁的分子标记的获得

1.生物材料：

西瓜材料WM204，其表现为短下胚轴性状；

西瓜材料WT2是由发明人选育的高代自交系，表现为正常的下胚轴(需要说明的是目前的西瓜栽培品种为正常下胚轴)。

两份材料由河南农业大学园艺学院瓜类分子育种实验室提供(需要解释的是，采用该材料作为研究基础，仅是实验材料获得的便捷性原因，不应理解为本申请相关技术方案的实现必须依赖于该实验材料)；

上述西瓜材料WT2，与公开号为CN110938706A的中国发明专利“与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用”中采用的正常普通有卷须西瓜材料WT2是一致的。上述西瓜材料WM204，与公开号为CN113322345A的中国发明专利“与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记及应用”中采用的网状覆纹材料是一致的。

以上生物材料在申请人单位的实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验或者公众也可以通过购买的方式获取。

实验过程中，两个亲本及构建的群体均种植于河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程为：催芽后进行穴盘育苗，在播种后第10天对亲本及群体下胚轴长短进行调查。

2.实验试剂和设备：

实验过程中，PCR扩增用PCR Taq-Mix购于南京诺唯赞基因科技有限公司；其它电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸铵等试剂购自北京索莱宝科技有限公司，AgNO₃、NaOH和甲醛等试剂购自上海沪式实验室器材股份有限公司。

实验过程中的PCR扩增用引物(人工合成)及基因测序，由擎科基因组研究中心有限公司提供完成。

PCR仪为珠海黑马医学仪器有限公司Hema9600型基因扩增仪；

电泳仪为JY300HC通用型电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限公司生产；

电泳槽为HT-SCZ04A高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任公司生产。

实施例1西瓜短下胚轴基因Clsh的定位

(一)遗传分离群体的构建

以西瓜正常下胚轴材料WT2为母本，以西瓜短下胚轴材料WM204为父本(需要解释的是，试验期间，从材料易得性及操作方便考虑，发明人以WT2作为母本)，利用这两个亲本配置了杂交组合，结果表明，获得的F₁代植株表现为正常下胚轴类型(亲本材料表型如图1所示。)

从F₁代植株中选取了20个单株，自交收获F₂代种子，用于遗传分析及基因定位。

对这些F₂代个体的下胚轴类型进行鉴定，并用卡方测验进行验证。结果表明：对2020 年秋季种植的168株F₂群体的株高表型调查分析显示：有126株单株表现为正常下胚轴，有42个单株表现为短下胚轴，经过卡方检验符合3∶1的分离比。

对2021年春季种植的1475株F₂群体表型调查显示，正常下胚轴植株有1140株，短下胚轴植株有335株，经过卡方分析，卡方值为4.27。

综合上述结果分析可知，西瓜短下胚轴性状是由1个隐性单基因控制的，将该基因命名为ClSH，正常下胚轴ClSH对短下胚轴Clsh为完全显性。

(二)采用BSA法对Clsh基因进行初步定位

(1)首先，制备基因池，具体为：

在上述步骤(一)的F₂群体中随机选取20个正常下胚轴单株与20个短下胚轴单株，采集它们在子叶期尚未展开的幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取其基因组DNA，并分别将其等量混合制成正常下胚轴基因池和短下胚轴基因池(正常下胚轴与正常下胚轴混合，短下胚轴与短下胚轴混合)

(2)多态性筛选分析，具体为：

利用发明人前期从西瓜全基因组开发的1256对SSR引物，筛选在亲本间具有多态性的标记。其中共有242对SSR标记在亲本间表现为明显的多态性。接着通过在亲本间具有多态性的242对SSR标记对步骤(1)中所制备的两个基因池进行第二次多态性筛选，获得了3对在两个基因池间具有多态性的SSR标记。根据SSR标记的信息，3个在双亲及混池间都具有多态性的标记均位于西瓜第9号染色体的前端。

进一步，将筛选出来的3对多态性标记对168株F₂群体进行基因分型，将所获得的与短下胚轴亲本WM204相同的带型记为2，获得的与正常下胚轴亲本WT2相同的带型记为1，获得的杂合带型记为3。最后使用Joinmap4.0对分型结果进行连锁分析，发现 Clsh与这些多态性紧密连锁。为了获取更加准确的定位结果，我们通过对双亲的重测序数据重新组装，以染色体步移的方式鉴定，开发了8对新的SSR标记，并且使用了更大的F₂群体以实现对Clsh的精细定位。

多态性筛选分析过程中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因池样品(基因组DNA，30ng/μL)，1μL(约30ng)；

F、R引物，各0.5μL(引物浓度均为5μmol/L)

PCR Taq-Mix，5.0μL；

dd H2O，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃、5min。

需要解释的是，上述PCR扩增体系中的F、R引物(1256对SSR引物)分别代表一对引物中的前引物和后引物，且这些引物均以西瓜基因组“97103V1”为参考基因组。由于这些引物与本申请欲保护主题并不直接关联，文本简明起见，不再详细说明。

对PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为1×TBE，200V恒压电泳1～1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：

A、用超纯水洗1～3min；

B、利用脱色摇床将冲洗后的胶片放入染色液中摇动2min，染色液为0.2％硝酸银水溶液；

C、将染色后的胶板放入超纯水中漂30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15g NaOH和15mL甲醛混匀得到的；

D、最后放入ddH2O反复漂洗几次；

E、室温下干燥，然后拍照，用保鲜膜包裹、保存。

(3)基因精细定位，具体为：

结合(2)中的结果，通过开发更多的SSR标记、提高F₂群体单株的数量，我们将西瓜短下胚轴基因Clsh的定位在9号染色体前端C1SSR23715与C1SSR23752之间。接着通过使用新开发的SSR标记，我们将Clsh定位在C1SSR23722和C1SSR23733之间。此外，利用IlluminaHi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度＞30倍；结合亲本重测序的结果，以西瓜全基因组序列在SSR标记ClSSR23722和 C1SSR23733之间的区段作为参考序列，通过生物信息学的方式鉴定存在于亲本间的序列差异(图2)。

实施例2SNP等位性检测及SNP1标记的开发

在实施例1的基础上，发明人进一步对西瓜短下胚轴基因Clsh候选区段进行生物信息学分析，并开发了与之共分离的SNP标记。具体过程如下。

(一)亲本重测序序列分析

实施例1的基础之上，发明人进一步对双亲间西瓜短下胚轴基因Clsh候选区段进行生物信息学分析。我们以ClSSR23722和ClSSR23733之间的基因组序列为参考序列，根据西瓜参考基因组“97103V1”的注释，在候选区间内共存在3个基因，分别为Cla015408，Cla015407与Cla015406。接着，我们将双亲重测序后的原始读长映射在参考序列之上，通过hisat2及samtools等软件进行生物信息学分析。在双亲间共发现了47个SNP。只有 2个SNP位于基因的外显子上，分别位于Cla015406和Cla015408之中，这2个SNP位点被我们开发为2个SNP标记。接着使用这2个SNP标记对重组单株进行分型，且还存在重组单株。故短下胚轴基因Clsh被定位在两个SNP标记之内，且根据基因组注释这2 个SNP标记之间只有1个基因，即Cla015407。该基因全长为1256bp，有2个外显子1 个内含子。经过序列分析，该基因在双亲间存在2个SNP且皆位于内含子，其中一个位于内含子的最后一位碱基。

(二)等位性检测

在步骤(1)的基础上，为了进一步锁定该基因且验证其内SNP位点的保守性，我们对2019年公布的414份自然材料的重测序数据从中选取了100份进行分析。所有100 份材料的原始序列由NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载，其登录号为SRP188834。我们以ClSSR23722和ClSSR23733之间的基因组序列为参考序列，将所有100份材料的原始测序读长映射比对至参考基因组“97103V1”之上。其中位于西瓜9号染色体第 1857472bp碱基发生的G到A的突变有很高的保守性(在100份自然材料中只有2份发生了突变，且位于材料WM88中的突变可信度相对较低)。这也暗示了这个SNP影响了西瓜下胚轴的伸长，故此开发了SNP1(见图3)。此外，我们也对候选区间内位于外显子上的两个SNP位点做了等位性检测，分别在37份材料中鉴定到了位于1827186bp处发生的A到C的突变，在48份材料中鉴定到了在1865395bp出发生的G到C的突变。换言之在正常下胚轴材料中，这两个SNP位点相对而言并不保守。所采用的100份材料的名称见表1。

表1 100份材料

序号	名称	序号	名称	序号	名称	序号	名称	序号	名称
										1	WM13	21	WM73	41	WM151	61	WM250	81	WM334
2	WM22	22	WM74	42	WM155	62	WM251	82	WM335
										3	WM24	23	WM75	43	WM169	63	WM253	83	WM344
4	WM31	24	WM81	44	WM175	64	WM254	84	WM346
										5	WM32	25	WM82	45	WM176	65	WM256	85	WM353
6	WM34	26	WM83	46	WM179	66	WM257	86	WM354
										7	WM35	27	WM84	47	WM182	67	WM259	87	WM357
8	WM54	28	WM87	48	WM185	68	WM260	88	WM358
										9	WM55	29	WM88	49	WM188	69	WM261	89	WM359
10	WM56	30	WM89	50	WM189	70	WM262	90	WM360
										11	WM57	31	WM90	51	WM191	71	WM263	91	WM361
12	WM59	32	WM90	52	WM192	72	WM269	92	WM366
										13	WM60	33	WM95	53	WM194	73	WM271	93	WM367
14	WM62	34	WM99	54	WM206	74	WM296	94	WM368
										15	WM64	35	WM100	55	WM208	75	WM299	95	WM373
16	WM65	36	WM102	56	WM216	76	WM303	96	WM378
										17	WM66	37	WM118	57	WM220	77	WM330	97	WM380
18	WM68	38	WM140	58	WM226	78	WM331	98	WM381
										19	WM69	39	WM144	59	WM230	79	WM332	99	WM382
20	WM70	40	WM150	60	WM246	80	WM333	100	WM390

(4)以SNP1区分正常下胚轴和短下胚轴

前期的结果显示，一个SNP的变化在短下胚轴材料WM204中极为保守。基于这个SNP开发了SNP1，其扩增序列在两亲本间在第245位碱基处存在一个突变，在正常下胚轴材料中表现为G，在突变体短下胚轴WM204中表现为A。故该标记可用于识别西瓜正常下胚轴与短下胚轴性状。换言之，利用所述SNP1分子标记进行PCR 扩增时，引物序列设计为：

SNP1-F：5’-TACGGCCTCGTTCGTATCTC-3’(SEQ ID NO.1)，

SNP1-R：5’-GCAAGTCTCCAACTTGAACCA-3’(SEQ ID NO.2)。

具体验证时：

利用分子标记SNP1检测西瓜短下胚轴基因Clsh，通过PCR扩增后，利用Sanger 测序对PCR扩增产物进行测序，检测到580bp的序列，其中第245位碱基为A且为单峰，其具体碱基序列如下(如SEQ ID NO.3所示)：

TACGGCCTCGTTCGTATCTCCTCCTTCTTCCCTAAACGTATGTGGTCCGAAGGCT TCACCATCGTTGGCTCCCCTCTCGAACACTTTCAGAAACTCTGGCCTCACGACTACG TTCAATACTGGTAGTGTGACAATCACATTGAATAATTTACTTTTTTTTTTTTAATTATT TTTTTAATATAAAGGCACATTGGCTTCTTATATTAAACTAGTTAATTAACATTATTATAT TATTAAATTTTTAATGATATTATGGAGGAATATGACCGAGAGATGAAGAGTCTATGTG GAAGGCTGATGTGGCTTGCGTTGGGGGAATTAGGCATAACACGAGAGGATGTGAAT TGGGCTGGGCCGAATGGGGATTTCAAGACAAGTAATGCAGCGACCCAATTGAACTC TTACCCGGTTTGCCCGGACCCGGACCGGGCCATGGGACTTGGGGCTCATACCGACA CCAGCCTCTTAACCATTGTAIACCAAAACAACACGAGAGGGTTACAAGTTTTGAGA GAAGGGAACCGGTGGGTGACGGTGGAGCCGGTACCCGGTGCACTGGTGGTTCAAG TTGGAGACTTGC。

利用分子标记SNP1检测西瓜正常下胚轴基因ClSH时，通过PCR扩增后，利用Sanger测序对PCR产物进行检测，检测到580bp的序列，其中第245位碱基为G且为单峰，其具体碱基序列如下(如SEQ ID NO.4所示)：

TACGGCCTCGTTCGTATCTCCTCCTTCTTCCCTAAACGTATGTGGTCCGAAGGCT TCACCATCGTTGGCTCCCCTCTCGAACACTTTCAGAAACTCTGGCCTCACGACTACG TTCAATACTGGTAGTGTGACAATCACATTGAATAATTTACTTTTTTTTTTTTAATTATT TTTTTAATATAAAGGCACATTGGCTTCTTATATTAAACTAGTTAATTAACATTATTATAT TATTAAATTTTTAGTGATATTATGGAGGAATATGACCGAGAGATGAAGAGTCTATGTG GAAGGCTGATGTGGCTTGCGTTGGGGGAATTAGGCATAACACGAGAGGATGTGAAT TGGGCTGGGCCGAATGGGGATTTCAAGACAAGTAATGCAGCGACCCAATTGAACTC TTACCCGGTTTGCCCGGACCCGGACCGGGCCATGGGACTTGGGGCTCATACCGACA CCAGCCTCTTAACCATTGTATACCAAAACAACACGAGAGGGTTACAAGTTTTGAGA GAAGGGAACCGGTGGGTGACGGTGGAGCCGGTACCCGGTGCACTGGTGGTTCAAG TTGGAGACTTGC。

若正常下胚轴基因型为C1SH/Clsh，利用分子标记SNP1进行PCR扩增，接着使用Sanger测序对PCR产物进行检测，检测到580bp的序列，其中第245位碱基为双峰。

综上，根据PCR扩增产物序列的改变，可有效区分ClSH/ClSH，ClSH/Clsh，Clsh/Clsh 三种基因型。

也就说，利用设计的引物对(SNP1-F：5’-TACGGCCTCGTTCGTATCTC-3’(SEQ IDNO.1)，SNP1-R：5’-GCAAGTCTCCAACTTGAACCA-3’(SEQ ID NO.2))对模板进行 PCR扩增，使用Sanger测序对PCR扩增产物进行检测，其产物全长为580bp，若扩增产物的第245位碱基表现为单峰且为G，则说明待测西瓜为纯合正常下胚轴材料；若扩增产物的第245位碱基表现为单峰且为A，则说明待测西瓜为纯合短下胚轴材料；若扩增产物的第245位碱基表现为双峰，则说明待测西瓜为杂合正常下胚轴材料，利用本发明的分子标记可以有效的判断西瓜的下胚轴性状。

综上所述，结合生物信息学对自然群体重测序序列的分析，本发明所述的分子标记 SNP1在自然群体中具有极高的保守性，其能够在西瓜的种子时期及芽期较为准确的进行分子标记辅助选择，极大地提高了选择和育种的过程。为西瓜短下胚轴品种的培育提供了理论支持和技术支持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记及应用

<130> 2021

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

tacggcctcg ttcgtatctc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 2

gcaagtctcc aacttgaacc a 21

<210> 3

<211> 580

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 3

tacggcctcg ttcgtatctc ctccttcttc cctaaacgta tgtggtccga aggcttcacc 60

atcgttggct cccctctcga acactttcag aaactctggc ctcacgacta cgttcaatac 120

tggtagtgtg acaatcacat tgaataattt actttttttt ttttaattat ttttttaata 180

taaaggcaca ttggcttctt atattaaact agttaattaa cattattata ttattaaatt 240

tttaatgata ttatggagga atatgaccga gagatgaaga gtctatgtgg aaggctgatg 300

tggcttgcgt tgggggaatt aggcataaca cgagaggatg tgaattgggc tgggccgaat 360

ggggatttca agacaagtaa tgcagcgacc caattgaact cttacccggt ttgcccggac 420

ccggaccggg ccatgggact tggggctcat accgacacca gcctcttaac cattgtatac 480

caaaacaaca cgagagggtt acaagttttg agagaaggga accggtgggt gacggtggag 540

ccggtacccg gtgcactggt ggttcaagtt ggagacttgc 580

<210> 4

<211> 580

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 4

tacggcctcg ttcgtatctc ctccttcttc cctaaacgta tgtggtccga aggcttcacc 60

atcgttggct cccctctcga acactttcag aaactctggc ctcacgacta cgttcaatac 120

tggtagtgtg acaatcacat tgaataattt actttttttt ttttaattat ttttttaata 180

taaaggcaca ttggcttctt atattaaact agttaattaa cattattata ttattaaatt 240

tttagtgata ttatggagga atatgaccga gagatgaaga gtctatgtgg aaggctgatg 300

tggcttgcgt tgggggaatt aggcataaca cgagaggatg tgaattgggc tgggccgaat 360

ggggatttca agacaagtaa tgcagcgacc caattgaact cttacccggt ttgcccggac 420

ccggaccggg ccatgggact tggggctcat accgacacca gcctcttaac cattgtatac 480

caaaacaaca cgagagggtt acaagttttg agagaaggga accggtgggt gacggtggag 540

ccggtacccg gtgcactggt ggttcaagtt ggagacttgc 580

Claims

1.与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记，其特征在于，扩增所述分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SNP标记。

3.权利要求1所述与西瓜短下胚轴基因共分离Clsh的分子标记在西瓜分子育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分子标记用于鉴定或辅助鉴定西瓜短下胚轴性状。

5.一种西瓜短下胚轴性状的判定方法，其特征在于，所述判定方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的分子标记引物对对模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序；

(3)根据步骤(2)的测序结果进行判定，具体标准为：

使用Sanger测序对PCR扩增产物进行检测，产物全长为580bp，若扩增产物的第245位碱基表现为单峰且为G，则说明待测西瓜为纯合正常下胚轴材料；若扩增产物的第245位碱基表现为单峰且为A，则说明待测西瓜为纯合短下胚轴材料；若扩增产物的第245位碱基表现为双峰，则说明待测西瓜为杂合正常下胚轴材料。

6.一种判断西瓜下胚轴基因型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜基因组DNA；

(3)根据步骤(2)的测序结果进行判定，具体标准为：

使用Sanger测序对PCR扩增产物进行检测，产物全长为580bp，若扩增产物的第245位碱基表现为单峰且为G，则说明待测西瓜的基因型为ClSH/ClSH；若扩增产物的第245位碱基表现为单峰且为A，则说明待测西瓜的基因型为Clsh/Clsh；若扩增产物的第245位碱基表现为双峰，则说明待测西瓜的基因型为ClSH/Clsh。

7.一种用于鉴定西瓜短下胚轴性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的引物对。

8.用于检测SNP标记是否存在的试剂在西瓜短下胚轴基因Clsh定位中的应用，其特征在于，扩增所述标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ IDNO.2所示。