CN114015701B - 一种检测大麦籽粒皱缩性状的分子标记及其应用 - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Abstract
本发明公开了一种检测大麦籽粒皱缩性状的分子标记及其应用，属于分子生物学及作物遗传育种技术领域，该分子标记为显性分子标记，其与大麦籽粒皱缩基因HORVU6Hr 1G037950共定位于大麦6H染色体上，遗传距离为0cM；检测分析表明，该分子标记能准确、快速鉴定大麦籽粒的饱满与皱缩表型，且成功率高。本发明公开的分子标记8FR1与控制大麦籽粒饱满度性状的基因共分离，与同类分子标记技术相比，具有操作简单，不需要酶切等优点；利用本发明设计的分子标记能够准确检测和标记大麦籽粒饱满或皱缩性状的株系，可用于育种鉴定和目标单株的筛选，在大麦分子标记辅助育种中具有重要的应用价值，对提高大麦产量和改善品质具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及作物遗传育种技术领域，特别是涉及一种检测大麦籽粒皱缩性状的分子标记及其应用。
背景技术
作为除小麦，水稻，玉米外的第四大谷类作物，大麦(Hordeum vulgare L.)是人类历史上最早被驯化和利用的粮食作物和饲料作物，在农作物中占据重要地位；因此，提高大麦的产量和改善品质迫在眉睫，选育优质高产新品种是稳定和发展大麦产业的前提。
近年来，大麦的研究主要集中于生长发育、品质分析、品种选育、农艺性状以及抗性等方面，而有关于籽粒性状的研究相对较少，尤其是皱缩籽粒性状的研究。籽粒性状主要包括千粒重、籽粒饱满程度和籽粒的品质等几个方面。其中，籽粒的饱满程度包括籽粒长度、籽粒宽度、籽粒长宽比等，千粒重是构成作物产量的三要素之一，粒型对千粒重的影响显著，且籽粒饱满度直接决定啤酒大麦的等级和市场价值。但是关于大麦籽粒皱缩这一性状的研究较为薄弱。通过对大麦籽粒皱缩性状开展精细定位，开发出与大麦籽粒饱满或皱缩性状紧密连锁的分子标记，对提供方便快捷的大麦育种方法具有重要意义。
目前，DNA分子标记技术已广泛应用于作物育种相关领域。它能够直接反映个体核苷酸分子间多态性。广义的分子标记是指具有特定序列的DNA、RNA或蛋白质序列，而狭义的分子标记指的是DNA标记，是个体基因组间DNA的差异。通过得到与所研究的目的基因紧密连锁的分子标记或共分离标记，从而获得目的基因。相比于其他标记，如形态学标记、细胞学标记和生化标记，DNA分子标记具有多种优点，如标记数量多、多态性高、检测简单、迅速、易操作等。随着分子生物学实验手段的丰富、测序技术的普及与大量重测序数据的公布，从分子层面揭开大麦籽粒皱缩性状形成的机理成为可能。
此前部分学者对籽粒皱缩性状进行了基因定位与分子机制解析，发现与之相关的基因在玉米中广泛存在。然而目前与大麦皱缩性状相关且可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记却未见报道。因此研究获得有关皱缩性状的基因，利用分子生物学技术，开发出与性状紧密连锁的共分离标记，进而加快育种进程，最终达到选育增产大麦新品种的目的，在大麦育种工作中意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测大麦籽粒皱缩性状的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该8FR1分子标记与大麦籽粒皱缩基因HORVU6Hr 1G037950 共分离，用于分子标记辅助选择的准确性高，可显著提高适应不同环境的大麦籽粒饱满或皱缩性状的选择鉴定效率，且成功率高。
基于以上目的，本发明利用籽粒为饱满的大麦品种“Bowman”、“Morex”、“甘啤 4号”、“新啤2号”、“CDC Alamo”和“GSHO 1828”为父本，以大麦籽粒皱缩突变体“sex1”为母本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法获得F2:3家系分离群体。本发明结合前期研究结果，借助简化基因组测序(specific-locus amplified fragmentsequencing，SLAF-Seq)、混池转录组测序(Bulked segregant RNA-Seq，BSR-Seq) 和转录组测序(RNA-Seq)来定位控制大麦籽粒皱缩的基因。对F2及F2:3遗传分离群体籽粒表型鉴定，以提取亲本和分离群体植株DNA，筛选亲本之间多态性SSR标记，遗传作图群体SSR分析，利用JoinMap 4.0构建遗传图谱。以LOD值阈值3构建连锁群，结合群体的籽粒表型数据定位籽粒皱缩基因sex1，计算sex1基因的位置和分子标记之间的遗传距离，发现sex1定位于Bmag0174和GBM5012之间的1.1cM区域 (140.90-241.39Mbp)，在初定位区间内，结合RNA-Seq、SLAF-Seq-BSA和BSR-Seq 的SNP数据，开发竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR，KASP) 标记，进一步缩小区间，扩大群体，构建候选基因区域的精细定位图谱；最终将目标基因锁定在8.62Mbp(187.97-196.59Mbp)的区间内，结合“sex1”和“Bowman”的 RNA-Seq数据，分析发现只有3个差异表达基因在该区间，对该区段内的3个基因分别在野生型“Bowman”、“甘啤4号”和突变体“sex1”进行qRT-PCR分析，并对这3 个基因进行CDS和基因组序列扩增并测序。根据测序分离结果，HORVU6Hr1G037950 不能被扩增出来，据此设计了一个显性标记8FR1，在初定位群体(72株)和精细定位大群体(1458株)里进行验证，发现其为共分离标记。
至此完成了本发明，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种大麦籽粒皱缩基因HORVU6Hr 1G037950在调控大麦籽粒饱满或皱缩性状中应用，所述大麦籽粒皱缩基因HORVU6Hr 1G037950位于大麦6H染色体上。
本发明还提供一种与大麦籽粒皱缩基因HORVU6Hr 1G037950共分离的8FR1分子标记，所述8FR1分子标记为显性分子标记，其与大麦籽粒皱缩基因 HORVU6Hr 1G037950共定位于大麦6H染色体上，遗传距离为0cM。
本发明还提供一种用于鉴别大麦籽粒饱满或皱缩性状的共分离标记引物对，包括如SEQ ID No.1所示的正向引物和如SEQ ID No.2所示的反向引物，所述共分离标记引物对用于扩增上述的8FR1分子标记。
本发明还提供一种用于鉴定大麦籽粒饱满或皱缩性状的试剂盒，包括上述的8FR1分子标记和/或上述的共分离标记引物对。
本发明还提供一种上述的8FR1分子标记、上述的共分离标记引物对或上述的试剂盒在作物分子育种、培养转基因大麦或大麦种质资源改良中的应用。
本发明还提供一种上述的8FR1分子标记、上述的共分离标记引物对或上述的试剂盒在培育或鉴定籽粒皱缩或饱满性状的大麦品种或品系中的应用。
本发明还提供一种筛选或鉴定具有籽粒饱满或皱缩性状的大麦株系的方法，包括以下步骤：
以待测大麦的基因组DNA为模板，利用上述的8FR1分子标记进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若含有特征电泳条带，则该待测大麦的籽粒性状为饱满性状，反之没有特征电泳条带，则该待测大麦的籽粒性状为皱缩性状。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系包括：10μL Taq Master Mix、100ng DNA模板、10mol/L共分离标记引物对1μL、双蒸水加至总量为20μL。
进一步地，所述PCR扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min，总共35个循环；72℃延伸15min。
进一步地，所述特征电泳条带为长度640bp的的电泳条带。
本发明公开了以下技术效果：
1、本发明首次公开了控制大麦籽粒皱缩表型的大麦基因HORVU6Hr 1G037950，位于大麦6H染色体上。该基因编码ADP-葡萄糖转运蛋白，在大麦籽粒淀粉合成中具有重要作用。
2、本发明公开了精确鉴定控制大麦籽粒饱满或皱缩表型的基因 HORVU6Hr1G037950的分子标记8FR1，该分子标记既是共分离标记也是显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
3、本发明成功地将共分离标记8FR1应用于辅助选择育种，将会加速大麦籽粒饱满性状新品种的选育进程，提高大麦产量，同时节约种植成本，具有明显的经济效益、生态效益。
4、本发明的分子标记可为大麦籽粒皱缩形成的分子机制研究奠定基础。
5、由于该标记与控制大麦籽粒饱满或皱缩表型的基因HORVU6Hr 1G037950共分离，因此可直接用于大麦材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本发明所提供的分子标记在大麦籽粒饱满或皱缩新品种培育中具有较好的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中大麦籽粒饱满性状“Bowman”和籽粒皱缩材料“sex1”；
图2本发明实施例1中大麦籽粒皱缩基因sex1的精细定位图；
图3为本发明实施例2中不同大麦F2株系植株共分离分子标记8FR1检测的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M代表1Kb Marker，“甘啤四号”(GP4)、“新啤2号”(XP2)、“Bowman”(BM42)、“Morex”(BM41)为饱满籽粒大麦，“sex1”为籽粒皱缩大麦，编号1-32的数字代表从甘啤四号/sex1、新啤2号/sex1、Bowman/sex1、Morex/sex1群体中分别随机抽取的F2单株；PCR扩增产物仅有一条640bp的电泳条带，代表该大麦籽粒为饱满性状，无电泳条带，则该大麦籽粒为皱缩性状。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1与控制大麦籽粒皱缩基因紧密连锁的分子标记的获得
(1)分离群体的构建
利用大麦籽粒皱缩突变体“sex1”与籽粒饱满的野生型“Bowman”、“Morex”、“甘啤4号”、“新啤2号”、“CDC Alamo”和“GSHO 1828”正反交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法，获得F2:3家系，用于遗传分析和基因定位，结果表明，获得的F1代植株籽粒全部表现为饱满类型(亲本材料表型如图1所示)。
(2)分离群体籽粒表型鉴定
成熟期对大麦遗传分离群体进行籽粒性状表型鉴定，观察各群体中的饱满籽粒与皱缩籽粒，统计F2及F3家系的籽粒饱满、皱缩家系的分离比，研究大麦籽粒皱缩的遗传规律。
(3)控制籽粒皱缩基因的初步定位
a)构建混池，具体为：将F2群体(新啤2号/sex1和甘啤4号/sex1)纯合的30 个皱缩株系和30个饱满株系等量叶片分别混合，将混池送北京百迈克生物科技有限公司和北京诺禾致源生物信息科技有限公司分别进行SLAF-Seq-BSA和BSR-Seq分析，获得了极端池之间距离目标位点较近的非编码区和编码区上的多态性位点。
b)大麦基因组DNA的提取：用CTAB法提取亲本“Bowman”、“sex1”、“甘啤四号”、“新啤2号”、“Morex”和遗传分离群体植株DNA。
c)多态性筛选分析，具体为：基于SLAF-Seq、BSR-Seq和RNA-Seq的分析结果，利用发明人本实验室已有的覆盖在大麦6H染色体的49对SSR引物，筛选亲本间具有多态性的标记。其中有12个标记在亲本间表现出多态性。接着利用亲本间有多态性的12个标记对制备的两个DNA混池进行第二次多态性筛选，获得了4个(Bmag0174-F/R、 GBM5012-F/R、Bmag0219-F/R、Bmag0173-F/R)在两个亲本池和两个子代混池间都具有多态性的标记(表1)。进一步，将筛选出的4对多态性SSR标记对72株甘啤4号/sex1 的F2群体进行基因型分析。
PCR扩增进行于20μL的反应体系中：1μL100 ng/μL基因组DNA、各0.5μL10 pmol/L上、下引物、8μL无菌ddH2O和10μL 2×Taq Master Mix(Vazyme Biotech Co.， Ltd)。在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物，并通过银染显现，其中籽粒皱缩材料带型为“A”，籽粒饱满材料带型为“B”，杂合型为“H”。
d)连锁图谱的构建：根据SSR标记和表型数据，利用JoinMap 4.0构建遗传图谱，发现sex1与这些多态性标记紧密连锁。
(4)基因精细定位，具体为：为了获取更加精确的定位结果，利用RNA-Seq、 SLAF-Seq和BSR-Seq的SNP分析结果数据共开发了30对KASP标记，最终有13对 KASP标记在甘啤4号和sex1间存在多态性，分别命名为KASP-1、KASP-15、KASP-16、 KASP-17、KASP-20、KASP-21、KASP-22、KASP-23、KASP-24、KASP-25、KASP-28、 KASP-29和KASP-30(表1)。结合多态性标记的物理位置，并且使用了更大的F2群体，以进一步密化遗传图谱，实现对sex1的精细定位。结合定位结果的多态性标记的物理位置，选用侧翼标记KASP-1和KASP-30对296份饱满材料和201份皱缩材料进行重组子筛选，共筛选出11个重组子。为了进一步缩小定位区间，结合区间内开发的KASP 标记，对重组子进行图谱密化，最终将籽粒皱缩基因sex1定位在标记KASP-22和 KASP-24之间，约8.62Mb(图2)。
KASP引物设计参照KASP引物设计说明书(https://www.lgcgroup.com/L GCGroup/media/PDFs/Products/Genotyping/KASP-genotyping-chemistry-User-guid e.pdf)：FAM (5′GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3′)和HEX(5′GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3′)荧光序列被分别添加在具有等位特异性的前引物的5′端；将SNP位点设计为前引物的3′端的最后一个碱基；同时，设计一段通用后引物。
PCR体系为：5μL的1×KASPmaster mixture，50ng gDNA，3.1μL ddH2O和1.4μL 引物混合物(由30μL后引物，两条前引物各12μL和40μL ddH2O)。PCR的反应程序如下：94℃预变性15min；94℃变性20s；60℃退火60(每秒降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，25个循环。
整个反应在荧光定量PCR仪(
CFX-96)上进行。根据KASP标记在甘啤4号/sex1的F2：3群体中的基因分型数据，利用JoinMap 4.0将KASP标记整合于遗传图谱，使用JoinMap 4.0软件建立标记与目标基因之间的连锁关系，LOD阈值为3.0。使用Mapdraw V2.1软件绘制遗传连锁图谱。
(5)候选基因的预测和共分离标记的开发
结合转录组测序数据，在精细定位区间内共有3个差异表达基因：HORVU6Hr1G037700、HORVU6Hr1G037950和HORVU6Hr1G038320(图2)。为了进一步确定引起突变体籽粒皱缩表型的目的基因，发明人采用qRT-PCR、扩增CDS片段及gDNA方法进行验证。HORVU6Hr1G037950基因在突变体中基本不表达，且在开花后15天的野生型籽粒中表达水平最高，该结果与RNA-Seq的表达结果一致。同时分别扩增出野生型“甘啤4号”和突变体“sex1”在这个区间内的3个候选基因，根据测序分离结果，HORVU6Hr1G037950不能被扩增出来，据此我们设计了一个显性标记 8FR1(表1)，用显性标记8FR1进行群体验证，通过Joinmap 4.0软件计算遗传连锁距离，使用MapDraw V2.1构建遗传连锁图谱。8FR1与sex1的遗传距离为0cM，标记 8FR1为共分离分子标记。为了进一步分析该基因上下游片段是否有差异，对周围序列采用分段扩增的方法进行了分离测序，发现均无差异，在“sex1”中仅有5kb的缺失片段。SMART网站的蛋白结构域预测结果表明HORVU6Hr1G037950蛋白是 Q6E5A5_HORVV(Q6E5A5)蛋白，该蛋白为质膜ADP-葡萄糖转运蛋白，属于线粒体载体蛋白家族，与淀粉合成有关，HORVU6Hr 1G037950很可能为控制籽粒皱缩的候选基因。
表1引物序列
注：下划线部分为FAM标签序列，波浪线部分为HEX标签序列。
实施例2分子标记8FR1在选择控制大麦籽粒饱满或皱缩性状上的应用
(1)利用籽粒为饱满的大麦“甘啤4号”、“Morex”、“Bowman”、“新啤2号”为母本，籽粒为皱缩的“sex1”为父本构建的F2精细定位大群体及F3杂合单株单粒播种群体，在后代株系中随机选择1000个以上的株系。
(2)对所获得的1000多个株系进行8FR1标记检测，具体方法为：在苗期提取 1000多个株系的DNA；以其为底物，以分子标记8FR1的特异性引物对为引物进行PCR 扩增，所述引物为：
上游引物：5’-TACGCCTACGAGACACTG-3’(SEQ ID No.1)
下游引物：5’-ACTGGGGCAAAGTTGAAAG-3’(SEQ ID No.2)
PCR扩增体系：10μL Taq Master Mix(Vazyme Biotech Co.，Ltd)、约100ng的 DNA模板、10mol/L的特异性引物对1μL、双蒸水加至总量为20μL；PCR的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，60℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环， 72℃延伸15min，4℃保存。将得到的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150V，电流180A。
通过电泳结果可以判断，如果PCR扩增产物仅有一条如图3所示的长度为640bp 的特征条带，则该待测大麦植株为籽粒饱满性状的株系；如果PCR扩增产物同“sex1”一样未能扩增出长度为640bp左右的特征条带，则待测植株为籽粒皱缩性状株系，通过对扩增的特征条带进行分析，就可以判断出大麦的籽粒是饱满还是皱缩的性状；进一步地，发明人对比籽粒表型数据发现，株系条带类型与籽粒表型一致(表2)。基于此结果，表明8FR1分子标记能够有效地区分籽粒为饱满的大麦材料以及籽粒皱缩材料。
综上所述，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物进行PCR扩增的片段可以作为检测编码ADP-葡萄糖转运蛋白的基因HORVU6Hr 1G037950是否存在的标记，该标记可以高效地用于育种中亲本及后代材料的籽粒表型是饱满或皱缩的鉴定。本发明中分子标记8FR1能够在大麦生长的早期准确的进行分子标记辅助选择，大大地提高了选择和育种的进程，为大麦优质品质新品种的培育提供了理论支持和技术支持。
表2 8FR1共分离标记验证F2群体部分株系基因型与表型对应结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种检测大麦籽粒皱缩性状的分子标记及其应用
<160> 49
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat ttggtgcccc gtcgcgcgcg gt 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tctgtggctg cccctatggg ta 42
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cttgacgatc aagcttgctt 20
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gaaggtcgga gtcaacggat ttcccggagc gccatgttct g 41
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tgcgcgtcac cggccgccgt 20
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ctacttccca gcagaatc 18
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<212> DNA
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ctcagacgcg cgctcctgat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tagagactac actggttagg c 41
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ttgaggggct caggcgccac 20
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gaaggtcgga gtcaacggat tggcaacatg cttctcaaat t 41
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ctgtcacagc agctgttctc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc ttcgagagga aatttgtagc a 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat ttcgagagga aatttgtagc g 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttccgagtat catatgctc 19
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<211> 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tcgctgcgcg tggcggctct t 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
agccattcat tgaagttagc 20
Claims (9)
1.一种8FR1分子标记，其特征在于，所述8FR1分子标记为显性分子标记，所述8FR1分子标记通过如SEQ ID No. 1-2所示的共分离标记引物对扩增得到。
2.一种用于鉴别大麦籽粒饱满或皱缩性状的共分离标记引物对，其特征在于，包括如SEQ ID No.1所示的正向引物和如SEQ ID No.2所示的反向引物，所述共分离标记引物对用于扩增权利要求1所述的8FR1分子标记。
3.一种用于鉴定大麦籽粒饱满或皱缩性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的8FR1分子标记和/或权利要求2所述的共分离标记引物对。
4.一种权利要求1所述的8FR1分子标记、权利要求2所述的共分离标记引物对或权利要求3所述的试剂盒在作物分子育种、培养转基因大麦或大麦种质资源改良中的应用。
5.一种权利要求1所述的8FR1分子标记、权利要求2所述的共分离标记引物对或权利要求3所述的试剂盒在培育或鉴定籽粒皱缩或饱满性状的大麦品种或品系中的应用。
6.一种筛选或鉴定具有籽粒饱满或皱缩性状的大麦株系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测大麦的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的共分离标记引物对进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若含有特征电泳条带，则该待测大麦的籽粒性状为饱满性状，反之没有特征电泳条带，则该待测大麦的籽粒性状为皱缩性状。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：10 µL TaqMaster Mix、100 ng DNA模板、10 mol/L共分离标记引物对1µL、双蒸水加至总量为20µL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min，总共35个循环；72℃延伸15min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述特征电泳条带为长度640bp的电泳条带。
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