CN106957897B - 黄瓜幼叶黄化基因的分子标记方法 - Google Patents

黄瓜幼叶黄化基因的分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了黄瓜幼叶黄化基因连锁的分子标记方法，属于生物技术领域。首次公开了与黄瓜幼叶黄化基因紧密连锁的分子标记SSR63，该标记正反向引物序列分别为：5′GCCTTCATCCTGTGGCGT 3′和5′CCAGTCATGGGTTTGTTGGA 3′。在幼叶黄化与绿叶黄瓜构建的F2中，引物SSR63F/SSR63R在幼叶黄化株系中均能扩增出226bp产物，在绿叶株系中均能扩增出204bp产物或同时含有204bp和226bp两条带的产物，与vyl紧密连锁。本发明公开的与黄瓜幼叶黄化基因vyl紧密连锁分子标记，可用于黄瓜幼叶黄化基因定位或分子标记辅助育种。

Description

黄瓜幼叶黄化基因的分子标记方法
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及黄瓜幼叶黄化基因的分子标记及应用。
二、技术背景
黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝2x＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一，在世界范围内广泛地栽培。
叶色黄化突变体是研究研究植物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控制机理的理想材料。同时，利用此种突变体可延伸至功能基因组学的分析，可用作基因功能组学研究和基因间互作的基础材料。叶色突变在育种上也具有重要的应用价值。叶色突变性状极易识别并且通常在苗期表达，将叶色突变体作为标记性状用于良种繁育和杂交育种，不但可以测定种子纯度还可在苗期剔除受外源花粉污染的种子和假杂种，节约成本和时间[1]。由于某些叶色突变体具有特殊的优良性状，叶色黄化植株可在植物的遗传改良中为作物遗传育种提供优秀的种质资源。
近年来，叶色突变体的利用价值越来越受到关注，在粮食作物中已经有不少关于叶色黄化基因定位及功能研究的报道。目前报道的水稻叶色突变的相关基因已超过80个，Kunneng Zhou等人利用60Co射线得到一个叫做ylc1的幼叶叶绿素缺失突变体，精细定位到22.6kb，进一步研究发现YLC1蛋白参与叶绿素及类胡萝卜素合成以及幼叶的叶绿体发育[2]。Anqi Xing等人利用玉米黄化突变体发现控制幼叶黄化的基因存在一个同源的修饰基因，两个基因互作完成叶色的调控作用[3]。
然而，在黄瓜中虽然有不少叶色黄化突变体的报道，但是目前的研究大部分还停留在叶色黄化的机理研究，关于基因定位及功能研究的报道还不多见。因此，在黄瓜遗传育种中，非常有必要开发一种与幼叶黄化紧密连锁或完全连锁的分子标记，以便为后续的叶色基因功能研究提供基础，同时连锁分子标记可为培育幼叶黄化新材料提供快速筛选的途径。随着生物技术水平的不断发展，克隆目的基因的方法也层出不穷。图位克隆方法利用分离群体的遗传连锁分析获得位于该位点附近的紧密连锁的分子标记的基础上，通过构建高密度的分子连锁图谱，经过染色体步移(跳跃)，开发新的更加紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区间进而 最终克隆该基因的方法。找到与幼叶黄化基因vyl紧密连锁的分子标记，可为进一步克隆黄化基因vyl打下坚实的基础。还可以用黄化突变体作为亲本材料进行杂交，在苗期就可以用上述的分子标记方法测定种子纯度，或者在苗期剔除受外源花粉污染的种子和假杂种，简便又快速。
三、发明内容
(一)技术问题
本发明涉及一个与黄瓜幼叶黄化基因vyl共分离的分子标记，目的是为后续的黄化基因的克隆与功能研究，以及幼叶黄化新材料的创制提供基础，加快黄瓜优良品种选育和基因功能组学的研究进程。
(二)技术方案
本发明提供的与黄瓜幼叶黄化基因紧密连锁的分子标记方法的特征在于：该黄化基因为完全隐性基因，有一个SSR标记与之紧密连锁，所述SSR分子标记引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
SSR63：正向引物：5′GCCTTCATCCTGTGGCGT 3′，
反向引物：5′CCAGTCATGGGTTTGTTGGA 3′。
上述提供的用于检测黄瓜幼叶黄化基因的分子标记方法为：
(1)提取待测黄瓜的基因组DNA。
(2)将所述的分子标记引物SSR63加入PCR反应体系，并对黄瓜基因组的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为：PCR扩增反应的总体系为20μl，包括：10×buffer(含Mg2+)2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH2O，12.75μL。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min 20s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存。
对引物SSR63PCR扩增产物进电泳，
将扩增产物中1.5μl上样于6％非变性聚丙烯酰胺胶；接通电极，在120V恒定电压下电泳1.5小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色。如果只含有226bp条带，则为含黄化基因vyl的纯合体，如果只含有204bp条带，则为含绿色基因 的纯合体，如包204bp和226bp两个条带，则为含绿色基因和黄化基因的杂合体。
(三)有益效果
(1)通过筛选获得与黄瓜幼叶黄化基因vyl紧密连锁的分子标记SSR63，为分子标记辅助育种和克隆vyl基因奠定了基础。利用本发明与黄瓜幼叶黄化基因vyl紧密连锁的分子标记，进行幼叶黄化基因vyl的鉴定，在包含998个单株的样品中选择效率均为100％。
(2)通过本发明分子标记定位的基因位点精确，鉴定方便。由于这个标记与黄瓜幼叶黄化基因vyl的重组率为0，因此，用黄化突变体作为亲本材料进行杂交，在苗期就可以用上述的分子标记方法测定种子纯度，或者在苗期剔除受外源花粉污染的种子和假杂种，有效解决了表型鉴定结果可靠性低、费时、成本高、难度大等问题，简便又快速。
(3)本发明提供的分子标记可广泛应用于分子辅助育种中vyl基因的分子检测，实现基因的产业化分子育种。
四、附图说明
图1：黄化基因vyl初步定位结果。
用引物UW084200和SSR05515之间序列进行引物设计，其中12对引物有多态性，用400个F2群体对12对多态性引物进行进一步筛选，寻找标记基因型与性状表现型的差别，获得标记与黄化基因vyl的交换单株。位于基因两侧的多态性标记向交换单株逐渐减少的方向步移，将目标区段缩小至引物SSR60和SSR113之间，标记SSR60和SSR113之间的SSR63重组株为0。
图2：引物SSR63检测结果。
用双亲(黄化突变体为P1，绿叶亲本Hazerd为P2)、F1、F2群体黄化表型和绿叶表型DNA作为模板，用本发明中的标记引物SSR63F/SSR63R进行PCR扩增，结果显示在黄化亲本(泳道2)和F2群体黄化表型单株(泳道5-14)中扩增出226bp的单条带，而在绿叶亲本(泳道3)和F2群体绿叶纯合个体(泳道15-19)中扩增出204bp的单条带，在F1(泳道4)和F2群体绿叶杂合个体(泳道20-24)中均扩增出204bp和226bp的条带。
注：泳道1：Marker；泳道2：P1；泳道3：P2；泳道4：F1；泳道5-14：F2群体黄化表型个体；泳道15-24：F2群体绿叶表型个体，其中，15-19为绿叶纯合个体，20-24为绿叶杂合个体。
五、具体实施方式
黄瓜幼叶黄化分子标记，是通过以下方法获得的：
(1)F2群体的构建
黄瓜幼叶黄化突变体vyl是由EMS诱变的‘长春密刺’突变体库筛选得到的，表现为幼嫩叶片黄化，随着叶龄的增加叶片逐渐转绿。Hazerd是一种欧洲温室型黄瓜，叶片深绿色。利用这两个亲本配置F1，F1代自交产生F2代。统计998个F2群体的表型，并用卡方分析法进行验证，得出黄瓜幼叶黄化为单基因控制的隐性性状。
(2)黄瓜基因组DNA的提取
按常规方法-CTAB法提取亲本，F1及全部F2分离群体的叶片总DNA。
(3)幼叶黄化和绿叶基因池建立
利用群体分离法(BSA)从F2分离群体中分别随机选取幼叶黄化株和绿叶株个体各10株，建立黄化(vv)和绿叶(V_)黄瓜的基因池。
(4)黄化基因的初步定位
随机挑选已公布的分布在黄瓜7条染色体上的引物对亲本进行多态性筛选，在271对引物中其中84对引物具有多态性。利用建立的黄化和绿叶基因池进行进一步筛选，将幼叶黄化基因初步定位在4号染色体长臂末端。随机挑选90个F2群体对附近连锁的分子标记进行进一步筛选，获得幼叶黄化基因vyl两翼最近的分子标记将UW084200和SSR05515，目标区段缩小至1.7cM。
(5)SSR标记开发
利用实验室生物信息学相关脚本对两个引物间的序列进行提取，用SSR软件对获得的序列进行分析，对获得的184个SSR位点用引物设计软件Primer Premier 5.0进行引物设计，在两个亲本间进行PCR扩增，使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，其中12对引物有多态性。
用400个F2群体对12对多态性引物进行进一步筛选，寻找标记基因型与性 状表现型的差别，获得标记与黄化基因vyl的交换单株。位于基因两侧的多态性标记向交换单株逐渐减少的方向步移，将目标区段缩小至引物SSR60和SSR113之间，标记SSR60和SSR113之间的SSR63重组株为0。用JoinMap 4软件对SSR标记的结果结合植株表型绘图，结果表明黄化基因vyl和标记SSR63共分离。
(6)标记引物SSR63在黄瓜幼叶黄化与绿叶黄瓜构建的F2中的分子检测
利用标记引物SSR63在双亲、F1和F2材料中进行PCR扩增检测(条件和方法同上)。结果表明：对于引物SSR63，在幼叶黄化亲本和幼叶黄化F2中都能扩增出226bp的单条带，而在绿叶亲本扩增出204bp的单条带，在绿叶F2扩增出204bp的单条带或同时含有204bp和226bp的两条带(图2)。
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Figure ISB0000189893060000011

Claims (5)

1.一种黄瓜幼叶黄化基因紧密连锁的分子标记SSR63，用于扩增该分子标记的引物序列如下：
正向引物：5′-GCCTTCATCCTGTGGCGT-3′，
反向引物：5′-CCAGTCATGGGTTTGTTGGA-3′。
2.黄瓜幼叶黄化基因分子标记方法，其特征在于，以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求1所述的分子标记SSR63的引物序列进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析；能扩增出226bp特异条带的植株为含有黄瓜幼叶黄化基因vyl的植株。
3.根据权利要求2所述的黄瓜幼叶黄化基因分子标记方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以待鉴定材料的DNA为模板，用权利要求1所述的分子标记SSR63的引物序列进行PCR扩增；PCR扩增反应的总体系为20μl，包括：含Mg2+ 10×buffer 2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，5U·μL-1的Taq酶0.25μL、10ng的DNA 1.0μL，ddH2O，12.75μL，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min20s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存；
PCR产物检测：反应产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；
(2)鉴定SSR63：能扩增出226bp特异条带的植株为含有黄化基因的植株。
4.权利要求1所述的分子标记在黄瓜幼叶黄化表型的分子标记辅助育种中的应用。
5.权利要求1所述的分子标记在黄瓜幼叶黄化基因定位或鉴定中的应用。
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