CN116411125B - 一种利用定量pcr法分析黄瓜和小麦根系互作的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法，涉及分子生物学技术领域。所述方法包括利用鉴定黄瓜根系和小麦根系的方法进行根系鉴定，并采用分层分段挖掘法，利用黄瓜根系生物量的定量检测方法和小麦根系生物量的定量检测方法进行根系生物量检测，得到黄瓜和小麦的根系生物量及水平和/或垂直分布情况的步骤。本发明以黄瓜和小麦为供试材料，分别设计出各自的特异性引物，开发了一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法，该方法相较于人工法，更适用于研究多种作物共同生长环境下的根系分布。

Description

一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法。

背景技术

根系研究是农业生产和植物互作等领域的重要研究方向，根系是植物的重要器官，根系在作物吸收水分和养分中承担着重要功能，对植物生长和发育具有重要作用。对影响植物根系分布的因素的理解与我们对基本生态系统功能(生产力)的理解密切相关，因此研究作物生长过程中的根系生物量及根系分布对于理解地下竞争及物种的相互作用有重要意义。在农业生产中，不同作物之间的根系互作现象是不可避免的。根系互作可以直接或间接地影响到作物的生长发育和产量，因此成为了近年来农业研究的热点之一。鉴定根系是研究根系互作的基础，定量根系是研究根系互作的关键。

目前鉴别并定量根系的方法有许多，主要是基于形态学、生理学等特征进行判断，存在局限性和误差，如根系形态法、染色法、近红外光谱识别法、同位素法、生物化学方法等。然而，这些方法均存在着一些缺点。根系形态法在物种种类繁多的情况下，由于有些植物的根系形态相似，很难进行区分；染色法研究的根系仅能在干燥的小型盆栽环境中完全染色，对研究环境有限制；近红外光谱识别法是通过模型的建立来定量估算相应的物质浓度，因此校正样品测量的浓度需要极其精确才能进行，导致了模型建立的困难；同位素技术具有两个明显的缺点：第一，同位素是存在潜在危险；第二，同位素技术无法在现场或大规模研究中使用；生物化学鉴别需要对根系进行化学成分的分析，操作复杂。这就无法满足现代农业对快速、准确检测根系的需求，同时最大的缺陷在于，试验容易因为环境因素改变而导致植物组织的化学物质成分改变，从而降低了准确性。利用分子生物学技术，如PCR和定量PCR扩增，可以通过对根系的基因组DNA进行分析，快速、准确地鉴别并(半)定量根系的种类、性质和生物量；但此方法可能会由于特异性引物不够特异，从而受到污染和干扰，影响结果。因此有必要开发新的高效、准确的根系鉴定及定量方法，以提高根系互作研究的效率和准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的方法可以高效并准确地鉴别并定量黄瓜和小麦根系，提高植物根系互作研究的效率和准确性。

内转录间隔区(Internal Transcribed Space，ITS)是指位于真核生物rRNA基因转录单元内部的一段非编码DNA序列，包括两个ITS(ITS1、ITS2)，中间是5.8S rDNA，其上游是18S rDNA，下游是28S rDNA，其长度和序列在不同物种中具有高度的变异性，因此ITS序列在物种间有较高的特异性。由于ITS序列在物种间具有高度的变异性的特性，因此可以设计特异性引物来放大ITS序列，从而实现对不同物种的特异性检测和鉴定。同时ITS序列长短适中，易于PCR扩增和测序。本发明利用黄瓜和小麦的ITS区设计得到了特异性引物，可以用于检测黄瓜和小麦作物的根系，通过构建黄瓜和小麦已知根生物量与目的基因拷贝数间的回归方程，接着利用定量PCR测量出未知根系的拷贝数，从而计算出未知根系生物量。

基于此，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种鉴定黄瓜根系的ITS分子标记，所述ITS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种鉴定黄瓜根系的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

本发明还提供一种鉴定黄瓜根系的方法，包括以下步骤：

(1)获取待检根系的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用鉴定黄瓜根系的特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行电泳检测，如果出现与上述鉴定黄瓜根系的ITS分子标记相同的扩增条带，则代表所述待检根系为黄瓜根系。

本发明还提供一种黄瓜根系生物量的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)利用鉴定黄瓜根系的特异性引物，对不同生物量的黄瓜根系的DNA进行定量PCR反应，构建回归方程，所述回归方程以黄瓜根系生物量为X轴，以定量PCR获得的基因拷贝数为Y轴；

(2)利用鉴定黄瓜根系的特异性引物，对待检样品的NDA进行定量PCR，获得基因拷贝数，之后根据所述回归方程，计算得出所述待检样品中的黄瓜根系的生物量；

在步骤(2)中，所述定量PCR的反应体系和反应程序与步骤(1)相同。

本发明还提供一种鉴定小麦根系的ITS分子标记，所述ITS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种鉴定小麦根系的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示。

本发明还提供一种鉴定小麦根系的方法，包括以下步骤：

(1)获取待检根系的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用鉴定小麦根系的特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行电泳检测，如果出现与上述鉴定小麦根系的ITS分子标记相同的扩增条带，则代表所述待检根系为小麦根系。

本发明还提供一种小麦根系生物量的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)利用鉴定小麦根系的特异性引物，对不同生物量的小麦根系的DNA进行定量PCR反应，构建回归方程，所述回归方程以小麦根系生物量为X轴，以定量PCR获得的基因拷贝数为Y轴；

(2)利用鉴定小麦根系的特异性引物，对待检样品的DNA进行定量PCR，获得基因拷贝数，之后根据所述回归方程，计算得出所述待检样品中的小麦根系的生物量；

在步骤(2)中，所述定量PCR的反应体系和反应程序与步骤(1)相同。

本发明还提供以下(1)或(2)任一项所述的物质在黄瓜和小麦的互作分析中的应用：

(1)上述鉴定黄瓜根系的ITS分子标记和鉴定小麦根系的ITS分子标记；

(2)上述鉴定黄瓜根系的特异性引物和鉴定小麦根系的特异性引物。

本发明还提供一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法，包括利用上述鉴定黄瓜根系和小麦根系的方法进行根系鉴定，并采用分层分段挖掘法，利用上述的黄瓜根系生物量的定量检测方法和小麦根系生物量的定量检测方法进行根系生物量检测，得到所述黄瓜和所述小麦的根系生物量及水平和/或垂直分布情况的步骤。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以黄瓜和小麦为供试材料，分别设计出各自的特异性引物，利用定量PCR分别建立黄瓜和小麦已知根生物量与目的基因拷贝数间的回归方程；通过比较利用定量PCR法和人工法测定的单作黄瓜根系生物量及根系分布的结果，来证明定量PCR法的可行性，最后比较利用两种方法测定的小麦伴生黄瓜体系中黄瓜和小麦的根系生物量及根系分布的结果，来证明了定量PCR法相较于人工法更适用于研究多种作物共同生长环境下的根系分布。本发明为能够在复杂的土壤环境中准确识别并定量目标作物根系提供了一种有效的工具和方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为黄瓜特异性引物ITSH177-F/ITSH177-R特异性验证的电泳图；其中，M：DL2000DNAMarker，H：黄瓜；X：西瓜；T：甜瓜；F：番茄；L：青椒；Q：茄子；B：大白菜；G：甘蓝；C：菜豆；SD：水稻；YM：玉米；Y：分蘖洋葱；XM：小麦；Ag：芹菜；Ls：生菜；Af：葱；St：马铃薯；Br：油菜；Vv：葡萄；Fa：草莓；Cs：芫荽；Zo：姜；Cm：南瓜；Es：臭菜；At：韭菜；Gm：大豆；Rs：萝卜菜；Tm：蒲公英；Bj：芥菜；At：拟南芥；Vu：豇豆；Ds：胡萝卜；Bh：冬瓜；Ib：番薯；La：丝瓜；So：菠菜；Mc：薄荷；As：蒿；Ac：青蒿；Ea：飞蓬；Sj：鼠尾草；Cj：蓟，Ms：苜蓿；Ds：马唐；Tr：车轴草；Hm：萱草；Ec：稗草；Ps：朝天委陵菜；Aa：铁苋菜；Hs：葎草；Po：马齿苋；Sw：苣荬菜；Pa：车前草；Ei：牛筋草；Sv：狗尾草；Tp：附地菜；Sn：龙葵；Ca：藜；Tri：木霉菌；Asp：曲霉菌；Pen：青霉菌；Mor：被孢霉菌；Cha：毛壳菌；Muc：毛霉菌；Fol：番茄枯萎病菌；Foc：黄瓜枯萎病菌；Fon：西瓜枯萎病菌；Bac：芽孢杆菌；Fla：黄杆菌；Rhi：根瘤菌；Art：节杆菌；Act：放线菌；Ros：纤发菌；Str：链霉菌；Pse：假单胞菌；TD：大田土DNA；N：阴性对照；

图2为小麦特异性引物ITSXM168-F/ITS XM168-R特异性验证的电泳图；其中，M：DL2000DNAMarker，XM：小麦；H：黄瓜；X：西瓜；T：甜瓜；F：番茄；L：青椒；Q：茄子；B：大白菜；G：甘蓝；C：菜豆；SD：水稻；YM：玉米；Y：分蘖洋葱；Ag：芹菜；Ls：生菜；Af：葱；St：马铃薯；Br：油菜；Vv：葡萄；Fa：草莓；Cs：芫荽；Zo：姜；Cm：南瓜；Es：臭菜；At：韭菜；Gm：大豆；Rs：萝卜菜；Tm：蒲公英；Bj：芥菜；At：拟南芥；Vu：豇豆；Ds：胡萝卜；Bh：冬瓜；Ib：番薯；La：丝瓜；So：菠菜；Mc：薄荷；As：蒿；Ac：青蒿；Ea：飞蓬；Sj：鼠尾草；Cj：蓟，Ms：苜蓿；Ds：马唐；Tr：车轴草；Hm：萱草；Ec：稗草；Ps：朝天委陵菜；Aa：铁苋菜；Hs：葎草；Po：马齿苋；Sw：苣荬菜；Pa：车前草；Ei：牛筋草；Sv：狗尾草；Tp：附地菜；Sn：龙葵；Ca：藜；Tri：木霉菌；Asp：曲霉菌；Pen：青霉菌；Mor：被孢霉菌；Cha：毛壳菌；Muc：毛霉菌；Fol：番茄枯萎病菌；Foc：黄瓜枯萎病菌；Fon：西瓜枯萎病菌；Bac：芽孢杆菌；Fla：黄杆菌；Rhi：根瘤菌；Art：节杆菌；Act：放线菌；Ros：纤发菌；Str：链霉菌；Pse：假单胞菌；TD：大田土DNA；N：阴性对照；

图3为根盒取样示意图；其中A为黄瓜单作；B为小麦伴生黄瓜；

图4为黄瓜根生物量与目的基因拷贝数之间的线性关系；

图5为小麦根生物量与目的基因拷贝数之间的线性关系。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

在NCBI中获取黄瓜、小麦、35种常见农作物及21种常见田间杂草的ITS序列，利用MEGAX软件进行比对分析找出差异区段，并根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物。然后利用常规PCR分别去扩增目标农作物、35种常见农作物、21种常见田间杂草、8种土壤中常见的细菌和9种真菌以及未含有目标作物的土壤DNA，每式3份。

具体进行如下操作：

1.测序

由于美国国家生物技术信息中心(NCBI)中没有分蘖洋葱ITS区序列，因此需要对分蘖洋葱进行测序。为保证测序结果的准确性，同时对黄瓜(黄瓜ITS序列已知)进行测序。用ITS5m/ITS4通用引物(ITS5m序列(SEQ ID NO.19)：GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG；ITS4序列(SEQ ID NO.20)：TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增黄瓜和分蘖洋葱的ITS序列，对扩增产物进行测序。常规PCR反应体系(总体系：25μL)：2×RapidTaq Master Mix 12.5μL，正反向引物(10μM)各1μL，DNA模板1μL，无菌去离子水(PCR级)9.5μL。常规PCR反应程序：95℃预变形3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃彻底延伸5min。

测序结果见表1。黄瓜样品测序的结果序列在NCBI中进行Blast，与黄瓜ITS区序列相似度达100％，证明通用引物扩增出的是目标作物的ITS区序列；分蘖洋葱样品测序的结果序列在NCBI中进行Blast，与洋葱ITS区序列相似度高达99.84％。

表1黄瓜和分蘖洋葱序列相似性比较及其登录号

2.DNA的提取

2.1植物DNA的提取

(1)试剂盒的方法提取的植物基因组DNA用于PCR验证引物特异性

将采集好农作物或田间杂草的根系用液氮冷冻研磨，采用百泰克生物技术有限公司的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行植物基因组DNA的提取。取3μLDNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的植物基因组DNA。

(2)CTAB的方法提取的植物基因组DNA用于定量根系生物

①选择根系作为初始样本，将根系洗净晾干后，放入50mL离心管中，加入液氮充分研磨后放入5mL含2％巯基乙醇的CTAB混匀。

②取出冷却至室温，13000r离心10分钟，吸取4.5mL上清液，加入等体积24：1的氯仿异戊醇，混匀。

③吸取4mL上清液，加入等体积24：1的氯仿异戊醇，混匀(同上一步)，静止10分钟。13000r离心10分钟。取上清液，加入0.6倍体积冰浴的异丙醇，放到-20℃中保存20分钟，13000r离心10分钟，80％无水乙醇清洗两次，超净台吹干。

④加入100μLTE溶解。

2.2真菌基因组DNA的提取

培养好的真菌，使用灭过菌的药匙从PDA培养基上慢慢地将菌丝剔下来，用液氮冷冻研磨，采用百泰克生物技术有限公司的真菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行真菌基因组DNA的提取。取3μLDNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的真菌基因组DNA。

2.3细菌基因组DNA的提取

用灭菌的牙签挑出培养好细菌放入LB液体培养基中，在恒温摇床中以180rpm转速、37℃的条件摇菌，吸取摇好的菌液采用百泰克生物技术有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行细菌基因组DNA的提取。取3μLDNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的细菌基因组DNA。

2.4土壤总DNA的提取

土壤总DNA利用E.Z.N.ARSoil DNA Kit(Omega Bio-Tek，Inc.,GA,USA)提取。取3μLDNA样品在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外成像仪下检测提取的土壤总DNA。

3.特异性引物设计及特异性验证

3.1特异性引物设计

将ITS序列和测序所得结果使用MEGAX和BioEdit软件进行序列分析、校对和比对，选择出目标作物ITS区核酸序列与其他常见农作物和田间杂草中碱基有差异的区段，利用软件Primer Premier 5进行引物设计。

参照选择引物的一般设计原则对引物的要求设计引物，即：

(1)引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；

(2)引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；

(3)引物3’端应避免出现发夹结构；

(4)正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值调整至55～65℃最佳；

(5)引物的GC含量应控制在40％-60％之间；

(6)引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；

(7)避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列，两条引物的3’端避免有3个碱基以上的互补序列；

(8)选择PCR扩增产物长度为100～300bp，这样引物可以同时用于常规PCR和定量PCR。

在尽量符合上述条件的基础上根据引物自身情况将序列做适当的调整。设计的引物在NCBI-BLAST比对进行初步的特异性验证，检查引物3’端是否在目标植物基因组的其它位置以及非目标植物基因组有匹配的情况，确定引物序列均来自于目标植物。最后选择BLAST比对后符合要求的引物。其中，对黄瓜设计出6对引物(见表4)，对小麦设计出2对引物(见表5)。

黄瓜ITS分子标记序列(SEQ ID NO.1)：

GGCGCGTCTAAAACAAAACACCGGCGTAGGTCGCGCCAAGGAACTTGAAATGAACTCGCCCGCCCCTCGTACCGGCCTCGGTGGTGCGGGGGGCGGAGCATTCTAGTCGTATTACTCAGAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGA。

小麦ITS分子标记序列(SEQ ID NO.2)：

AACCACCCTCAACGGGAATCGGGATGCGGCATCTGGTCCCTCGTCTCTCAAGGGA CGGTGGACCGAAGATTGGGCTGCCGGCGTACCGCGCCGGACACAGCGCATGGTGGGC GTCCTCGCTTTATCAATGCAGTGCATCCGGCGCGCAGCTGGCATTATGGCCTTTGA。

3.2特异性验证

以黄瓜、小麦、35种常见农作物、21种田间常见杂草、9种土壤中常见的真菌、8种土壤中常见的细菌以及土壤DNA为模板，进行常规PCR扩增反应，对设计的引物进行特异性应用验证。反应体系及反应程序如表2-3所示：

表2常规PCR反应体系(25μL)

表3常规PCR反应条件

注：其中变性、退火、延伸反应为35cycles。

实验结果：

利用已设计的6对黄瓜引物(表4)常规PCR扩增黄瓜、小麦、35种常见农作物、21种田间常见杂草、9种土壤中常见真菌、8种土壤中常见细菌和大田土的DNA，结果如表3所示，引物ITSH177-F/ITSH177-R可扩增出黄瓜基因组DNA，且无法扩增其他植物和微生物，说明引物ITSH177-F/ITSH177-R具有良好的特异性。

图1为ITSH177-F/ITSH177-R引物扩增模板DNA的特异性检测电泳图，从图中可以看出，仅黄瓜基因组DNA在177bp的位置扩增出一条清晰且单一的条带，其余均未出现条带。扩增产物回收后测序结果与目标扩增片段序列一致，证实ITSH177-F/ITSH177-R引物确实为黄瓜特异性引物。

利用已设计的2对小麦引物(表5)常规PCR扩增黄瓜、小麦、35种常见农作物、21种田间常见杂草、9种土壤中常见真菌、8种土壤中常见细菌和大田土的DNA，结果如表5所示，引物ITSXM168-F/ITSXM168-R可扩增出小麦基因组DNA，且无法扩增其他植物和微生物，说明引物ITSXM168-F/ITSXM168-R具有良好的特异性。

图2为ITSXM168-F/ITSXM168-R引物扩增模板DNA的特异性检测电泳图，从图中可以看出，仅小麦基因组DNA在168bp的位置扩增出一条清晰且单一的条带，其余均未出现条带。扩增产物回收后测序结果与目标扩增片段序列一致，证实ITSXM168-F/ITSXM168-R引物确实为小麦特异性引物。

表4黄瓜特异性引物设计序列及PCR扩增结果

表5小麦特异性引物设计序列及PCR扩增结果

4.黄瓜和小麦根生物量与目的基因拷贝数间回归方程的建立

4.1特异性引物的定量PCR反应体系(表6)及反应条件(表7)

表6定量PCR反应体系(20μL)

表7定量PCR反应条件

注：其中变性、退火、延伸反应为45cycles。

4.2根系的收集与处理

黄瓜、小麦生长7周后，将直径≤2mm的根小心取出，用蒸馏水清洗干净，吸干表面水分后剪成长度为5mm的小段，用锡纸包裹，分别放-80℃保存备用。

分别取上述-80℃保存备用的黄瓜根系10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg，共7个处理，提取其全部DNA，每个处理提取5次，进行定量PCR。小麦根系10mg、25mg、50mg、75mg、100mg，共5个处理，提取其全部DNA，每个处理提取5次，进行定量PCR。通过稀释的质粒制作标准曲线，对目标模板进行绝对定量，将得到的结果转换为拷贝数，建立黄瓜根生物量与目的基因拷贝数间的回归方程。

4.3定量PCR法和人工法在测定黄瓜和小麦根系生物量及分布方面的比较

(1)单作黄瓜根系生物量及分布

取48个泡沫箱(内尺寸：415×200×305(mm)；外尺寸：455×240×350(mm))进行盆栽试验，每箱装入20kg的大田土与沙子的混合物(大田土：沙子＝3:1)。黄瓜种子在28℃的恒温培养箱内催芽，于两天后播种在育苗盘中，待黄瓜幼苗子叶展平时分苗于营养钵中，两叶一心时选取生长一致的幼苗(两株)定植于泡沫箱中央，最后保留1株长势好的黄瓜。定植40d后取样，随机挑选24箱使用定量PCR方法测定黄瓜植株根系在水平和垂直方向上的根生物量及分布，其余24箱使用人工的方法测定黄瓜植株根系在水平和垂直方向上的根生物量及分布。

(2)小麦伴生黄瓜根系生物量及分布

取80个泡沫箱(内尺寸：415×200×305(mm)；外尺寸：455×240×350(mm))进行盆栽试验，每箱装入20kg的大田土与沙子的混合物(大田土：沙子＝3:1)，其中黄瓜单作20箱、小麦单作20箱、小麦伴生黄瓜40箱。黄瓜种子在28℃的恒温培养箱内催芽，于两天后播种在育苗盘中，待黄瓜幼苗子叶展平时分苗于营养钵中，两叶一心时选取生长一致的幼苗(两株)定植于泡沫箱1/3处，最后保留1株长势好的黄瓜。定植7d后，成簇撒播小麦20粒(最后保留15棵长势好的小麦)在距离黄瓜植株8cm一侧。黄瓜和小麦单作盆栽中的种植位置与以伴生盆栽中黄瓜和小麦的位置相同。定植40d后取样，随机挑选10箱单作黄瓜、10箱单作小麦和20箱小麦伴生黄瓜，使用定量PCR方法测定黄瓜和小麦植株根系在水平和垂直方向上的根生物量及分布，其余40箱使用人工的方法测定黄瓜和小麦植株根系在水平和垂直方向上的根生物量及分布。

4.4根系生物量及水平和垂直分布的测定

采用分层分段挖掘法进行测定。植株左右两侧用8cm×7cm×20cm的铁盒进行取样，按照剖面顺序进行序号标记(图3)。将取好的样品倒入0.2mm孔径的筛，将筛浸泡在水中，轻轻摇晃清洗掉根系表面土壤，收集根系，保存至-80℃。

定量PCR法测定根系生物量及分布的方法：提取各土块中根系DNA，进行定量PCR，得到目的基因拷贝数，并通过建立的已知黄瓜和小麦根生物量与目的基因拷贝数之间的回归方程，来计算各土块中根生物量；

垂直方向上0-8cm的根生物量为：L1+L2+L3+R1+R2+R3；8-16cm：L4+L5+L6+R4+R5+R6；16-24cm：L7+L8+L9+R7+R8+R9；黄瓜单作(图3中A)水平方向上的根生物量为0-7cm：L3+R1+L6+R4+L9+R7；7-14cm：L2+R2+L5+R5+L8+R8；14-21cm：L1+R3+L4+R6+L7+R9。小麦伴生黄瓜时(图3中B)，水平方向上的根生物量为0-7cm：L1+L4+L7；7-14cm：L2+L5+L8；14-21cm：L3+L6+L9；21-28cm：R1+R4+R7；28-35cm：R2+R5+R8；28-42cm：R3+R6+R9。

人工法测定根系生物量及分布的方法：黄瓜根系直接在天平上称重以测定生物量。

实验结果：

应用已建立的体系对不同根生物量的黄瓜DNA进行定量PCR反应，以已知的黄瓜根生物量为X轴，以通过定量PCR获得的基因拷贝数为Y轴，建立两者的回归方程(图4)，得出直线回归方程为y＝1.32×10¹⁵x+5.3×10¹⁵，R²＝0.972，p<0.0001。

为了建立根生物量与基因拷贝数的回归方程，首先人为制备已知的不同生物量的黄瓜根系，再利用定量PCR获取不同生物量所对应的基因拷贝数，将已知根生物量与对应的基因拷贝数进行回归比较。结果表现为，建立不同黄瓜根生物量与通过定量PCR获得的目的基因拷贝数之间的回归方程时，R²为0.972，这表明目标物种的植物根生物量与目的基因拷贝数之间存在很强的相关性。

应用已建立的体系对不同根生物量的小麦DNA进行定量PCR反应，以已知的小麦根生物量为X轴，以通过定量PCR获得的基因拷贝数为Y轴，建立两者的回归方程(图5)，得出直线回归方程为y＝1.9×10¹⁴x-3.5×10¹⁴，R²＝0.985，p＝0.0007。

为了建立根生物量与基因拷贝数的回归方程，首先人为制备已知的不同生物量的小麦根系，再利用定量PCR获取不同生物量所对应的基因拷贝数，将已知根生物量与对应的基因拷贝数进行回归比较。结果表现为，建立不同小麦根生物量与通过定量PCR获得的目的基因拷贝数之间的回归方程时，R²为0.98，这表明小麦的植物根生物量与目的基因拷贝数之间存在很强的相关性。

5.定量PCR法和人工法在测定黄瓜和小麦根系生物量及分布方面的比较

5.1垂直分布规律

从表8可以看出：由人工方法测定的黄瓜根系主要分布在土层深度0-8cm范围内，占总根生物量的50.61％，8cm以外根系分布随距离的增大而不断减小，8-16cm、16-24cm的土层深度中，根系生物量分别占根系总生物量的25.38％、24.00％。而由定量PCR方法测定的黄瓜根系主要分布也在土层深度0-8cm范围内,占总根生物量的43.07％，而6-24cm深度的根生物量较8-16cm多，8-16cm、16-24cm的土层深度中，根系生物量分别占根系总生物量的26.72％、30.20％。

经过t检验可知，在垂直方向上，两种方法测得的黄瓜根系生物量和占总根量百分比均没有显著差异(p>0.05)(表8)。表明两种方法测得的垂直方向上根系生物量基本一致。并进行Pearson相关性分析，结果可知，在垂直方向上，两种方法测得的根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.656，p＝0.021)，表明两种方法测得的垂直方向上的根系分布较为相似。

表8人工方法和定量PCR方法测得的黄瓜植株根生物量垂直分布表

5.2水平分布规律

从表9可以看出：由人工方法测定的黄瓜根系主要分布在水平距离0-7cm范围内占总根生物量的55.91％，7-14cm、14-21cm的土层中，根系生物量分别占根系总生物量的22.00％、22.09％。同时由定量PCR方法测定的黄瓜根系主要分布在水平距离0-7cm范围内占总根生物量的51.17％，7-14cm、14-21cm的土层中，根系生物量分别占根系总生物量的27.35％、20.47％。

经过t检验可知，在水平方向上，两种方法测得的黄瓜根系生物量和占总根量百分比均没有显著差异(p>0.05)(表9)。表明两种方法测得的水平方向上根系生物量基本一致。并进行Pearson相关性分析，结果可知，在水平方向上，两种方法测得的根系生物量的分布规律呈极显著相关(r＝0.858，p＝0.0001)，表明两种方法测得的水平方向上的根系分布较为相似。

表9人工方法和定量PCR方法测得的黄瓜植株根生物量水平分布表

6定量PCR法和人工法在测定小麦伴生黄瓜体系中黄瓜和小麦的根系生物量及分布方面的比较

6.1垂直分布规律

从表10可以看出：由人工方法和定量PCR方法测定的单作黄瓜和小麦伴生黄瓜体系中黄瓜的根系主要分布在土层深度0-8cm范围内，并随着深度的增加而减少。从表11可以看出：由人工方法和定量PCR方法测定的单作小麦和小麦伴生黄瓜体系中小麦的根系主要分布在土层深度0-8cm范围内，并随着深度的增加，根生物量先减少后增加。

经过t检验可知，在垂直方向上，两种方法测得的单作黄瓜根系生物量均无显著差异(p>0.05)(表10)，同时两种方法测得的小麦伴生黄瓜体系中黄瓜根系生物量均无显著差异(p>0.05)(表10)。两种方法测得的单作小麦根系生物量无显著差异(p>0.05)(表11)，测得的小麦伴生黄瓜体系中小麦根系生物量在0-8cm范围内有显著差异(p<0.05)(表11)，其他范围均无显著差异。进行Pearson相关性分析，结果可知，在垂直方向上，两种方法测得的单作黄瓜根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.809，p＝0.008)，小麦伴生黄瓜体系中黄瓜根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.639，p＝0.025)，单作小麦根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.997，p＝0.047)，小麦伴生黄瓜体系中小麦根系生物量的分布规律未呈显著相关(r<0.3)。

表10人工方法和定量PCR方法测得的单作黄瓜和小麦伴生黄瓜体系中黄瓜根生物量垂直分布表

表11人工方法和定量PCR方法测得的小麦单作和小麦伴生黄瓜中小麦根生物量垂直分布表

注：**表示P<0.01，*表示P<0.05。

6.2水平分布规律

从表12可以看出：由人工方法和定量PCR方法测定的单作黄瓜的根系主要分布在水平距离7-14cm范围内，人工方法测定的小麦伴生黄瓜体系中黄瓜的根系主要分布在水平距离7-14cm范围内，而定量PCR方法测定的小麦伴生黄瓜体系中黄瓜的根系主要分布在水平距离0-7cm范围内。从表11可以看出：由人工方法和定量PCR方法测定的单作小麦根系和人工方法测定的小麦伴生黄瓜体系中小麦的根系主要分布在水平距离28-35cm范围内，定量PCR方法测定的小麦伴生黄瓜体系中小麦的根系主要分布在水平距离21-28cm范围内。

经过t检验可知，在水平方向上，两种方法测得的单作黄瓜根系生物量均无显著差异(p>0.05)(表12)，同时两种方法测得的小麦伴生黄瓜体系中黄瓜根系生物量均无显著差异(p>0.05)(表12)。两种方法测得的单作小麦根系生物量无显著差异(p>0.05)(表13)，测得的小麦伴生黄瓜体系中小麦根系生物量在14-21cm和21-28cm范围内有显著差异(p<0.05)(表13)，其他范围均无显著差异。进行Pearson相关性分析，结果可知，在水平方向上，两种方法测得的单作黄瓜根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.523，p＝0.026)，小麦伴生黄瓜体系中黄瓜根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.982，p＝0.001)，单作小麦根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.992，p＝0.001)，小麦伴生黄瓜体系中小麦根系生物量的分布规律呈显著相关(r＝0.858，p＝0.001)。

表12人工方法和定量PCR方法测得的黄瓜单作和小麦伴生黄瓜中黄瓜根生物量水平分布表

表13人工方法和定量PCR方法测得的小麦单作和小麦伴生黄瓜中小麦根生物量水平分布表

综上所述，本发明采用了人工法与定量PCR的方法分别对土壤中单作黄瓜以及小麦伴生黄瓜体系中黄瓜和小麦的根系生物量及分布进行了测定。经过t检验可知，无论是在水平方向上还是垂直方向上两种方法测得的单作黄瓜根系生物量和占总根量百分比均没有显著差异(p>0.05)，单作小麦根系生物量和小麦伴生黄瓜体系中黄瓜的根系生物量均没有显著差异(p>0.05)。同时进行Pearson相关性分析，发现在水平方向上都呈显著相关。但是在垂直方向上，两种方法测定的小麦伴生黄瓜体系中小麦的根系生物量在0-8cm范围内有显著差异(p<0.05)，在水平方向上，两种方法测定的小麦伴生黄瓜体系中小麦的根系生物量在14-21cm和21-28cm范围内有显著差异(p<0.05)。定量PCR法测得的小麦伴生黄瓜体系中小麦的根系生物量比人工法要多，这个原因可能是人工法在分离黄瓜和小麦根系时，小麦根系较细，夹杂在黄瓜根系中不容易被发现，以及分离冲洗的过程中，小麦根系损失过于严重。而定量PCR法不需要对小麦和黄瓜根系混合物分离，这样大大减少了根冲洗对试验造成的误差。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种鉴定黄瓜根系的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQID NO.5-6所示，所述特异性引物用于鉴定黄瓜根系的ITS分子标记，所述ITS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种鉴定黄瓜根系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取待检根系的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行电泳检测，如果出现与权利要求1所述ITS分子标记相同的扩增条带，则代表所述待检根系为黄瓜根系。

3.一种黄瓜根系生物量的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用权利要求1所述的特异性引物，对不同生物量的黄瓜根系的DNA进行定量PCR反应，构建回归方程，所述回归方程以黄瓜根系生物量为X轴，以定量PCR获得的基因拷贝数为Y轴；

(2)利用权利要求1所述的特异性引物，对待检样品的DNA进行定量PCR，获得基因拷贝数，之后根据所述回归方程，计算得出所述待检样品中的黄瓜根系的生物量；

在步骤(2)中，所述定量PCR的反应体系和反应程序与步骤(1)相同。

4.一种鉴定小麦根系的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQID NO.15-16所示，所述特异性引物用于鉴定小麦根系的ITS分子标记，所述ITS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种鉴定小麦根系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取待检根系的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求4所述的特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行电泳检测，如果出现与权利要求4所述ITS分子标记相同的扩增条带，则代表所述待检根系为小麦根系。

6.一种小麦根系生物量的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用权利要求4所述的特异性引物，对不同生物量的小麦根系的DNA进行定量PCR反应，构建回归方程，所述回归方程以小麦根系生物量为X轴，以定量PCR获得的基因拷贝数为Y轴；

(2)利用权利要求4所述的特异性引物，对待检样品的DNA进行定量PCR，获得基因拷贝数，之后根据所述回归方程，计算得出所述待检样品中的小麦根系的生物量；

在步骤(2)中，所述定量PCR的反应体系和反应程序与步骤(1)相同。

7.权利要求1所述的特异性引物和权利要求4所述的特异性引物在黄瓜和小麦的互作分析中的应用。

8.一种利用定量PCR法分析黄瓜和小麦根系互作的方法，其特征在于，包括利用权利要求2和5所述的方法进行根系鉴定，并采用分层分段挖掘法，利用权利要求3和6所述的方法进行根系生物量检测，得到所述黄瓜和所述小麦的根系生物量及水平和/或垂直分布情况的步骤。