CN113528697B - 异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因及其应用。本发明通过同源序列搜索和保守结构域分析方法，在异形根孢囊霉基因组中发现了参与营养信号通路的10个基因，包括Cyr1、Pde2、Bcy1、Tpk1、Snf1、Tor2、Tip41、Atg8、Ssa3和Msn2基因。通过实时荧光定量PCR方法，检测到上述基因在共生早期大量表达，表明上述基因可作为共生早期标记基因；且表达量高、灵敏度高，分析所需的样品量较少、工作量较小，不但有利于提前评判常规的菌根植物种苗能否实现菌根化及潜在的菌根化水平，还能在一定程度上提高检测灵敏度并减少工作量，从而为农林业菌根化种苗的规模化生产和推广应用提供便利。

Description

异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因及其应用
技术领域
本发明涉及农林业微生物领域，尤其是涉及丛枝菌根真菌即异形根孢囊霉的菌根共生早期标记基因及其应用。
背景技术
丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)AMF能与72％以上的陆生维管束植物根系形成丛枝菌根(Bonfante et al,2018；)。AMF庞大的根外菌丝网不仅能促进植物对氮、磷、钾、硫、锌、铁、铜等矿质营养元素和水分的吸收和利用，改善菌根化植物的营养状况(Ferrol et al.,2019；Hartmann et al.,2019)，还能分泌球囊霉素、海藻糖等有机物以改良土壤理化性质、固定土壤中的重金属、去除有机污染物、招募有益微生物以及诱导宿主植物合成激素和抗氧化物(Wang et al.,2017；Zhang et al.,2018；Janeeshma etal.,2019；Deja-Sikora et al.,2019)，从而促进植物生长，增加植物生物量并提高植物对干旱、盐碱、病虫害和污染物等的耐受性，在农林业可持续发展和生态环境保护中发挥着十分重要的积极作用(Rasmann et al.,2017；Kaushal et al.,2019；Chandrasekaran etal.,2019；Hao et al.,2019；Begum et al.,2019；陈保冬等,2019)。菌根化的比非菌根化的农林作物在生长状况、产量和品质上有显著的优越性。然而，由于AMF在漫长的进化过程中失去了降解有机物的酶系而无法自养，只能与宿主植物之间形成糖类和脂质-矿物质交换的专性共生体系，其专性营养共生的生活方式，导致人们难以对其进行纯培养，极大地阻碍了相关科学研究与实际生产，相关领域仍存在许多方面有待改善。
在目前的菌根苗生产过程和相关研究中，AMF接种剂量、逆境胁迫程度等都能影响植物的菌根化水平和AMF的植物促生效果，人们通常采用统计侵染率的方法来检测菌根侵染水平和发育状况，以确保菌根植物种苗已实现菌根化并达到良好水平。该方法即在共生体发育成熟后取菌根化根系，进行消化、染色，在显微镜下检测包括以丛枝丰度(Arbusculeabundance,A％)、侵染频度(Frequency of colonization,F％)和菌根化强度(Mycorrhizal intensity,M％)等指标为代表的侵染率，存在耗时较长、流程较繁琐且工作量较大的问题。另外，人们也可采用qRT-PCR方法检测在丛枝细胞内大量表达的AM真菌单糖转运基因Mst2和菌根植物丛枝特异的磷酸盐转运基因PT4的表达水平，来表征和评判丛枝发育状况和菌根侵染情况，该方法相比于检测侵染率的方法较简便，但仍存在耗时较长的问题。采用这两种方法来判断菌根植物种苗能否实现菌根化，都存在耗时较长的局限性，是因为它们都涉及了需要接种后长达数周时间才能达到的丛枝发育成熟的共生时期。而以常规的野生型菌根植物为宿主，AMF完整的生活史必定包括非共生时期的分子对话，共生早期的附着胞/附着足形成，共生时期的根内菌丝延伸、丛枝发育与成熟，共生后期的根外菌丝产生和产孢等过程，通过检测宿主植物根系样品中在共生早期大量表达的基因的表达水平，就能够提前评判菌根植物种苗能否实现菌根化，即把“是否已经形成菌根”的评判标准转化为“是否即将形成菌根”。因此，鉴定AMF在共生早期大量表达的基因尤为重要。而近年来，包括模式AMF异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis DAOM197198)在内的8个AMF的基因组已经被公开释放，这将为揭示相关科学问题和突破相关技术瓶颈提供重要依据。
发明内容
为了克服现有技术中常规镜检统计侵染率方法和qRT-PCR方法检测丛枝特异性基因表达水平来评价菌根植物能否实现菌根化及评价菌根化水平的过程中存在的耗时较长、工作量较大的缺点与不足，本发明的目的在于提供异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因。
本发明的另一目的在于提供一种异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因，包括cAMP合成酶编码基因Cyr1、cAMP水解酶编码基因Pde2、SNF1催化亚基编码基因Snf1、PKA调节亚基编码基因Bcy1、PKA催化亚基编码基因Tpk1、TOR关键基因Tor2、TOR关键基因Tip41、主要营养信号通路下游共同靶标转录因子编码基因Msn2、热激蛋白编码基因Ssa3、自噬相关蛋白编码基因Atg8；
所述基因是通过采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)营养信号通路中10个关键组分的蛋白序列对异形根孢囊霉基因组进行同源序列搜索，并对同源序列进行生物信息学分析和筛选鉴定而获得；通过转录组分析，发现这些蛋白编码基因在异形根孢囊霉孢子和共生时期有不同的表达水平；采用实时荧光定量qPT-PCR方法，检测到这些基因在异形根孢囊霉菌根共生体中的共生早期阶段有较高的表达水平，表明这些营养信号通路关键基因都能够作为异形根孢囊霉菌根共生体中共生早期阶段的标记基因。
所述10个基因分别编码cAMP依赖的蛋白激酶A(cAMP-dependent Protein KinaseA,PKA)通路中的cAMP合成酶Cyr1、cAMP水解酶Pde2、PKA调节亚基Bcy1、PKA催化亚基Tpk1，蔗糖非酵解型蛋白激酶(Sucrose Non-Fermenting1related protein kinase,SNF1)通路中的催化亚基Snf1，雷帕霉素受体(Target of Rapamycin kinase,TOR)通路中的关键蛋白Tor2、Tip41，以及信号通路下游靶标转录因子Msn2、热激蛋白Ssa3和自噬相关蛋白Atg8。
所述基因及其编码蛋白在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的序列登录号如表1所示：
表1基因及其编码蛋白的登录号
Figure BDA0003158472550000031
本发明还提供一种上述基因的应用，即通过检测上述异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因的表达水平，以评价已接种异形根孢囊霉的宿主菌根植物能否实现菌根化或评价其潜在的菌根化水平。
具体包括如下步骤：
在宿主菌根植物接种异形根孢囊霉后的两周及以内，收取菌根组织，将根表杂质清洗干净，于液氮中研磨粉碎，提取总RNA并反转录为cDNA，以上述异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因，设计特异性引物进行PCR扩增并检测基因的表达水平，以评价常规宿主菌根植物种苗是否已实现菌根化或潜在菌根化水平。
任意一个基因的序列片段，设计任意一对特异性引物检测其表达水平以评价植物是否已实现菌根化及潜在的菌根化水平，都在本专利的保护范围内。
优选的，特异性引物的序列如表2所示。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过同源序列搜索和保守结构域分析方法，在异形根孢囊霉基因组中发现了参与营养信号通路的10个基因，包括Cyr1、Pde2、Bcy1、Tpk1、Snf1、Tor2、Tip41、Atg8、Ssa3和Msn2基因。通过实时荧光定量PCR方法，检测到上述基因在共生早期大量表达，表明上述基因可作为共生早期标记基因。对于常规的菌根植物种苗，检测以上任意一个在共生早期大量表达的基因的表达水平，都能够将评判种苗能否实现菌根化的所需时间缩短至接种后的两周及以内，且表达量高、灵敏度高，分析所需的样品量较少、工作量较小，能够克服qRT-PCR检测在共生时期大量表达的植物PT4和真菌Mst2基因表达量较低、灵敏度较低、分析样品数量较多的缺点，不但有利于提前评判常规的菌根植物种苗能否实现菌根化及潜在的菌根化水平，还能在一定程度上提高检测灵敏度并减少工作量，从而为农林业菌根化种苗的规模化生产和推广应用提供便利。
附图说明
图1是采用qRT-PCR方法检测异形根孢囊霉cAMP合成酶编码基因Cyr1、cAMP水解酶编码基因Pde2、SNF1催化亚基编码基因Snf1、PKA调节亚基编码基因Bcy1、PKA催化亚基编码基因Tpk1、TOR关键基因Tor2、TOR关键基因Tip41、主要营养信号通路下游共同靶标转录因子编码基因Msn2、热激蛋白编码基因Ssa3、自噬相关蛋白编码基因Atg8、单糖转运子编码基因Mst2和宿主植物紫云英AsPT4在紫云英菌根中不同共生时期(d为接种后的培养天数)的表达水平；其中，异形根孢囊霉基因的内参基因为RiEF1α，紫云英AsPT4基因的内参基因为AsActin。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1同源序列搜索与保守结构域分析
通过NCBI数据库的BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，用酿酒酵母目标基因的氨基酸序列在异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularisDAOM197198,taxid:747089)的基因组中进行蛋白质同源序列搜索。通过保守结构域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，对匹配度较高的目标序列进行保守结构域分析，舍弃不含关键结构域的序列，进一步确定目标基因同源序列。目标基因及编码蛋白如表1所示。
实施例2菌根样品制备
将已经过表面消毒的紫云英种子(Xie et al.,2013)置于25℃暗培养2-3天等待萌发，移至植物生长室(白天25℃、16h，夜晚18℃、8h)培养10天。将通过三叶草扩繁的异形根孢囊霉菌剂接种至紫云英根部，每株接种约100个孢子，随后每周浇灌一次含30μM KH2PO4的改良Long-Ashton营养液(Hewitt，1966)，分别于接种后的第14、21、28、35、42、56天分批收取菌根样品，每次收取3株置于-80℃储存。
实施例3qRT-PCR检测共生早期标记基因表达水平
将在不同时期收取的菌根样品从-80℃中取出，在液氮中粉碎后，采用植物RNA提取试剂盒Plant RNA Kit(OMEGA，USA)根据操作流程提取菌根总RNA，采用反转录试剂盒
Figure BDA0003158472550000051
III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)Kit(Vazyme,Nanjing,China)根据操作步骤反转录合成cDNA。通过实时定量PCR引物设计工具(https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/)设计目标基因序列的特异性引物，扩增产物长度为70～150bp。以cDNA为模板，采用qRT-PCR试剂ChamQ Univeral SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Nanjing,China)根据操作手册在qRT-PCR仪CFX ConnectTM Real-time PCRDetection System(Bio-Rad,USA)中检测目标基因表达水平。异形根孢囊霉的内参基因为RiEF1α，紫云英的内参基因为AsActin。采用2-ΔΔCt相对定量法计算基因的相对表达量。使用SPSS 22软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析，采用Duncan式进行多重比较，p<0.05，显著性差异以不同字母表示，误差线为±标准差SD。结果如图1所示，结果显示异形根孢囊霉Cyr1、Pde2、Bcy1、Tpk1、Snf1、Tor2、Tip41、Atg8、Ssa3和Msn2共10个基因在接种后的第14天(共生早期)大量表达，而可作为菌根共生时期标记基因的异形根孢囊霉Mst2和宿主植物紫云英AsPT4基因在接种后第56天表达量最高，表明上述异形根孢囊霉的10个基因可作为菌根共生早期标记基因，对其表达水平的检测可将评判已接种异形根孢囊霉的宿主菌根植物能否实现菌根化或评价其潜在的菌根化水平的所需时间缩短至两周及以内。
目标基因序列的特异性引物，如表2所示。
表2目标基因序列的特异性引物
基因 正义链引物(5'→3') 反义链引物(5'→3')
RiCyr1 TCGTGTGCTTGGTCTTATGG ACCTAAAGTATCAGCCATGCC
RiPde2 TCACAACTTTACTCACGCCG TTGCTACTTTTACCCCGTCG
RiBcy1 GGCGGTAGTTTTGGTGAATTG CTAGAGCCCAAAGAACAGAGTC
RiTpk1 AATGGTTTAAGGGAATTGAATGGG CCGTAAGGTTCTCTTTCCTCG
RiSnf1 TAATGGAATACGCTGGAGGTG GGTTTCAAATCTCGGTGTGC
RiTor2 ACTCTTGGTGTGATGCGTTG GTAGCCATTGACTTGCGATTTG
RiTip41 TGACATAAATTGGATAAATTCAAAGTTACC ACTGCAATGACCAATTCAAAGAC
RiAtg8 AGAGAAATCAGACATCGCCAC ATGAAGATCGCTTTCTCAGGG
RiSsa3 AACGTACACTATCGGCATCAG GACAGGTTCCATTGTAGATCGG
RiMsn2 CCCGCATCCACATTGTACA TGGAGTGAAATTACTAAACGTTCTTG
RiEF1α CCAAAGTTAAGGGCAAAACGC TTGAAGTGGAAGACGAAGGG
RiMst2 GGCAGGATATTTGTCTGATAG GCAATAACTCTTCCCGTATAC
AsPT4 CAGAAACAAAGGGAAGATCATTGG CATGTAATTCAGATCCTTCACACTG
AsActin GTTCTTTTCCAGCCTTCTATGA ATGTTTCCGTACAGATCCTTTC
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<223> RiCyr1反义链引物
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<211> 21
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ccaaagttaa gggcaaaacg c 21
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<211> 20
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<223> RiEF1α反义链引物
<400> 22
ttgaagtgga agacgaaggg 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 23
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<223> RiMst2反义链引物
<400> 24
gcaataactc ttcccgtata c 21
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<211> 24
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atgtttccgt acagatcctt tc 22

Claims (6)

1.异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因在评价已接种异形根孢囊霉菌剂的紫云英能否实现菌根化中的应用，其特征在于：所述的标记基因为异形根孢囊霉的cAMP合成酶编码基因RiCyr1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
基因RiCyr1编码的cAMP合成酶的氨基酸序列的NCBI数据库序列登记号为XP_025179329.1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
基因RiCyr1的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM_025316958.1。
4.权利要求1～3任一项所述异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因在制备评价已接种异形根孢囊霉的紫云英能否实现菌根化的试剂中的应用。
5.一对用于检测异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因表达水平的特异性引物，其特征在于：
所述的特异性引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：
在紫云英接种异形根孢囊霉后的第14天，收取菌根组织，将根表杂质清洗干净，研磨粉碎，提取总RNA并反转录为cDNA，根据异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因设计特异性引物进行PCR扩增并检测基因的表达水平，以评价常规紫云英种苗是否已实现菌根化。
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