CN101974650B

CN101974650B - 一种检测尖孢镰刀菌的pcr方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101974650B
Application number: CN2010105678075A
Authority: CN
Inventors: 李园; 曹坳程; 郭美霞; 崔瑞; 吴篆芳; 赵海滨
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN101974650A

Abstract

本发明“一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法及试剂盒”，属于农作物病害诊断与防治技术。包括如下步骤：(1)配制PCR反应体系，(2)在配制好的PCR反应体系中加入待测模板，(3)进行PCR扩增反应；其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的序列信息如下：Fo1：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’；Fo2：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。能够提高了检测的准确性，节约了检测时间，试剂盒可以在植物病害诊断与防治领域大规模推广。

Description

一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及农作物病害诊断与防治技术，特别是一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法及试剂盒。

背景技术

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)主要在土壤里越冬(夏)，且在土壤里存活时间较长，一般是通过土壤、肥料、灌溉水等进行传播，以侵染危害植株地下部位的根茎为主，且能侵染植物的维管束，病原物在维管束里繁殖，阻塞其输送营养物质，在短期内致使整株植物枯萎而死亡。

尖孢镰刀菌可严重危害瓜类、茄科类、豆科蔬菜及草莓等经济作物，主要引起根腐、茎腐、果腐等，有的侵染植物维管束组织引起萎蔫症。病原菌以菌丝体、厚垣孢子在土壤中越冬，且在土壤中可以腐生。厚垣孢子在土壤中能生存5～10年。

尤其在保护地农作物种植栽培过程中，尖孢镰刀菌引致的土传病害的发生越来越严重。因其发生具有隐蔽性，大多在结果期才达到发病的高峰期，因此损失巨大。严重影响了保护地的发展与人民的经济收入。

传统鉴定方法通常采用选择性培养基进行病原菌的分离培养，菌落形态观察，显微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察进行分类。传统鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，尤其是对土传病原菌的准确鉴定具有很大局限性。仅菌丝体和孢子等的形态特征也即表型分析来鉴别，有时是不准确的。同一病原菌的菌落往往在形态上、分布、生理性状等方面存在一定差异，难以进行准确鉴定。随着分子生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对土壤中病原菌进行鉴定。分子生物学方法的简便、快速、高效、可靠等特点，是传统的分离培养方法所达不到的。

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物熔解曲线分析可以特异地检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，但在农业植物病原真菌的定性定量检测研究中应用较少，尤其是在尖孢镰刀菌的定性定量研究中。

发明内容

本发明根据上述领域的不足，提供一种采用PCR检测尖孢镰刀菌的方法和试剂盒，能够提高了检测的准确性，节约了检测时间，试剂盒可以在植物病害诊断与防治领域大规模推广。

一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法，包括如下步骤

(1)预制PCR体系，

(2)在预制好的PCR体系中加入模板得到PCR反应体系，

(3)进行PCR扩增反应；

其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的序列信息如下：

Fo1：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

Fo2：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。

所述PCR反应体系为：10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl₂ 0.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶1U，DNA模板1μL，其余为灭菌双蒸水，终体积为20μL。

所述PCR扩增反应的程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

所述PCR方法为荧光定量PCR方法。

所述PCR反应体系为：

反应总体积为20μL，SYBR Green Supermix 10μL，10μM/L的Fo1 1μL，10μM/L的Fo21μL，模板11μL，余量为无菌双蒸水。

所述PCR扩增反应的程序如下：

第一步：95.00℃3分钟，1个循环；

第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分钟，45个循环；

第三步：55.0℃10分钟，95.0℃1分钟，1个循环；

第四步：55.0℃1分钟；

第五步：55.0℃10秒，80个循环。

一种检测尖孢镰刀菌的PCR方法的试剂盒，其特征在于包含有具有如下序列信息的引物：

Fo1：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

Fo2：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。

还包括荧光定量PCR所需的荧光染料。

本发明根据本研究克隆测序的尖孢镰刀菌ITS区序列如Seq ID No.1所示，设计出特异性引物Fo1/Fo2，采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性试验证明，如图1能够将尖孢镰刀菌与其它近缘菌区分开。灵敏性实验结果表明，如图2，可检测尖孢镰刀菌DNA浓度低至0.1ng/mL。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制。本发明的方法，其特有灵敏度和特异性能够实现对发病植物组织中及土壤中的尖孢镰刀菌的快速检测定量，实现防治的目的，操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制。

本发明优选采用实时定量PCR方法，定量检测，能真实反映尖孢镰刀菌定殖和侵染的情况；可同时进行高通量的样本检测。并且对实时定量PCR方法的体系和PCR程序进行了优化，使检测灵敏度和准确性明显提高，对尖孢镰刀菌的精确检测可达到8个孢子，如图3、4、5所示。

本发明还提供一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，可对植物组织及土壤中的尖孢镰刀菌进行快速检测和定量。可对尖孢镰刀菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统鉴定方法，并适于在植物病害诊断及防治领域广泛推广应用，实用性强，可满足植物病害诊断及监测的需要。

附图说明

图1为特异性检测引物对Fo1/Fo2对尖孢镰刀菌及其近缘种、属真菌的PCR扩增结果。

1-9号为引物对Fo1/Fo2扩增8种病原菌结果：

1.无DNA对照2.尖孢镰刀菌(Fusarium oxsporum)3.串珠镰刀菌(Fusarium moniforme)4.禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)5.燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)6.腐皮镰刀菌(Fusarium solani)7.大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)8.辣椒疫霉(Phytophthora capsici)9.番茄灰霉(Botrytis cinerea)M：100bp Marker

图2为尖孢镰刀菌特异引物Fo1/Fo2的灵敏度检测结果。

1-6号为尖孢镰刀菌DNA模板浓度从高至低系列稀释(1μg/mL-10pg/mL)7.无DNA模板对照M.DL 2000Marker。

图3为标准样品和未知样品的尖孢镰刀菌荧光定量PCR扩增曲线图

(y轴：荧光吸收率；x轴：循环数)。

图4为标准样品和未知样品的尖孢镰刀菌荧光定量PCR熔解曲线图，图示熔解温度为88℃。

图5为标准样品和未知样品的尖孢镰刀菌荧光定量PCR标准曲线图。

未知样品：1.病根(有明显症状，2.16×10⁶个孢子)，2.病根(有明显症状，2.12×10⁵个孢子)，3.病茎(有症状，2.04×10³个孢子)，4.茎(无症状，82个孢子)，5.病土(5g土壤，8个孢子)；

标准样品：尖孢镰刀菌孢子数系列稀释(2.16×10⁷-2.16×10³个孢子)。

具体实施方式

本发明所采用的微生物均在现有文献中记载过，本实验室也有保存，可向公众发放用于验证试验。

实施例1 尖孢镰刀菌ITS区的克隆、测序

1)尖孢镰刀菌DNA制备：

采用平板培养尖孢镰刀菌(Fusarium oxsporum)，置于30℃的培养箱内，生长一周左右，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨菌丝体，常规CTAB法提取各菌株DNA。

2)尖孢镰刀菌ITS区的扩增

采用真菌rDNA ITS扩增的通用引物ITS1/ITS4(White，T.J.，Bruns，T.，Lee，S.，et al.，Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenies.Innis MA，Glefand D H，Sninsky JJ，et al.a Guide to Methods and Applications.San Diego：AcademicPress，New York，1990，315～322.)扩增尖孢镰刀菌的ITS区。

PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

总体积	20μL
		10×PCR Buffer	2μL
dNTP(2.5mmol/L)	2μL
		ITS1(10μM/L)	1μL
ITS4(10μM/L)	1μL
		基因组DNA(50ng/μL)	1μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	0.2μL
		ddH₂O	12.8μL

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

3)尖孢镰刀菌ITS区的克隆、测序

在254nm紫外灯下观察橙红色荧光带，切下分离的镰刀菌的电泳条带，按DNA纯化试剂盒说明书回收纯化后，-20℃保存备用。

目的片段与pGEM-T Easy载体的连接体系，见表2。将内容物混匀后置4℃连接过夜或16℃温育4h以上。

表2目的片段与pGEM-T Easy载体的连接体系

总体积	10μL
		10X Ligation buffer	2μL
T4DNA连接酶	1μL
		pGEM-T Easy载体	1μL
目的片段	6μL

重组质粒的转化及提取方法参照《分子克隆》(黄培堂译Sambrook，Russell编著.分子克隆实验指南[M].第3版1北京：科学出版社，2002)。

采用限制性内切酶NotI对提取的质粒进行酶切，酶切体系为20μL，见表3。

表3 限制性内切酶酶切体系

总体积	20μL
		10×H Buffer	2μL
0.1％BSA	2μL
		0.1％Triton X-100	2μL
Not I	1μL
		重组质粒	5μL
ddH₂O	8μL

将酶切混合物离心混匀后，置37℃酶切3h以上。酶切结束后，加入2μL 10X LoadingBuffer并采用2.0％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

经过酶切鉴定的含目标DNA片段的重组质粒委托北京华大基因研究中心进行序列测定，测序结果显示尖孢镰刀菌ITS区全长544bp，见Seq ID No.1。

实施例2

尖孢镰刀菌的特异性引物检测

实验菌：尖孢镰刀菌(Fusarium oxsporum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniforme)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、番茄灰霉(Botrytiscinerea)各菌株均为中国农业科学院植物保护研究所所保藏。

1)各菌株DNA制备：

采用平板培养菌株，置于适合温度的培养箱内，生长一周左右，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨菌丝体，常规CTAB法提取各菌株DNA。

2)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物：

根据根据尖孢镰刀菌ITS区序列信息设计引物并筛选出如下特异性引物：

特异性引物(Fo1)：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

特异性引物(Fo2)：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’

委托上海生工公司合成。

3)用于检测尖孢镰刀菌的PCR反应体系：

PCR反应体系，其中10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl₂ 0.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水13.7μL，终体积为20μL。

4)用于检测尖孢镰刀菌的PCR扩增程序：

94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

5)PCR产物的鉴定：

取10μL PCR产物用1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。

实验结果

特异性检测引物对Fo1/Fo2对尖孢镰刀菌及其近缘种、属真菌的PCR扩增结果(图1)显示该对引物具有很好的特异性。在65℃退火条件下，只对尖孢镰刀菌有350bp扩增产物，对其他对照菌株均无扩增产物。

实施例3 尖孢镰刀菌特异性引物的灵敏度检测

1)尖孢镰刀菌DNA模板浓度从高至低系列稀释：

将尖孢镰刀菌DNA模板浓度从高至低10×系列稀释，由高浓度1μg/mL系列稀释至0.1ng/mL。

2)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物：

特异性引物(Fo1)：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

特异性引物(Fo2)：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’

由上海生工公司合成。

3)用于检测尖孢镰刀菌的PCR反应体系：

PCR反应体系，其中10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl₂ 0.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板1μL，，灭菌双蒸水13.7μL，终体积为20μL。

4)用于检测尖孢镰刀菌的PCR扩增程序：

5)PCR产物的鉴定：

取10μL PCR产物用1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判断结果。

实验结果

尖孢镰刀菌特异引物的灵敏度检测结果(见图2)显示该对引物具有很高的灵敏性，可检测尖孢镰刀菌DNA浓度低至0.1ng/mL。

实施实例4荧光定量PCR法检测发病草莓植株及病土中尖孢镰刀菌的数量

1)样品DNA制备：

草莓植株病根、病茎与草莓保护地土样分别收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨各样品，常规CTAB法提取样品DNA。

2)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物：

特异性引物(Fo1)：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

特异性引物(Fo2)：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’

由上海生工公司合成。

3)用于检测尖孢镰刀菌的荧光定量PCR反应体系：

反应总体积为20μL，SYBR Green Supermix(Bio-rad，170-8882)10μL，特异性引物Fo1(10μM/L)1μL，特异性引物Fo2(10μM/L)1μL，DNA模板1μL，余量为无菌双蒸水7μL。

标准阳性模板，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释：尖孢镰刀菌孢子系列稀释(2.16×10⁷～2.16×10³/ml个孢子)。

4)用于检测尖孢镰刀菌的荧光定量PCR反应程序：

第一步：95.00℃3分钟，1个循环；

第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分钟，45个循环；

第三步：55.0℃10分钟，95.0℃1分钟，1个循环

第四步：55.0℃1分钟

第五步：55.0℃10秒，80个循环

实验结果

应用荧光定量PCR法及本发明试剂盒对发病草莓植株及草莓保护地病土中的尖孢镰刀菌的检测结果(见附图3，4，5)，未知样品：1.病根(有明显症状，2.16×10⁶个孢子/g组织)，2.病根(有明显症状，2.12×10⁵个孢子/g组织)，3.病茎(有症状，2.04×10³个孢子/g组织)，4.茎(无症状，82个孢子/g组织)，5.病土(8个孢子/g土壤)。该结果显示该发明试剂盒及检测方法可灵敏精确地检测草莓植株茎及土壤中的尖孢镰刀菌的数量，检测结果可达到5g土壤中可检测出8个尖孢镰刀菌孢子。

Claims

1.一种检测尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的PCR方法，包括如下步骤：

(1)配制PCR反应体系，

(2)在配制好的PCR反应体系中加入待测模板，

(3)进行PCR扩增反应；

其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的序列信息如下：

Fo1：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

Fo2：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。

2.根据权利要求1所述的PCR方法，所述PCR反应体系为：10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl₂0.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶1U，DNA模板1μL，其余为灭菌双蒸水，终体积为20μL。

3.根据权利要求2所述的PCR方法，所述PCR扩增反应的程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的PCR方法，所述PCR为荧光定量PCR。

5.根据权利要求4所述的PCR方法，所述PCR反应体系为：

反应总体积为20μL，SYBR Green Supermix 10μL，10μM/L的Fo1 1μL，10μM/L的Fo21μL，模板1μL，余量为无菌双蒸水。

6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR方法，所述PCR扩增反应的程序如下：

第一步：95.00℃3分钟，1个循环；

第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分钟，45个循环；

第三步：55.0℃10分钟，95.0℃1分钟，1个循环

第四步：55.0℃1分钟

第五步：55.0℃10秒，80个循环

7.一种检测尖孢镰刀菌的PCR试剂盒，其特征在于包含有具有如下序列信息的引物：

Fo1：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

Fo2：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。

8.根据权利要求7所述的PCR试剂盒，还包括荧光定量PCR所需的荧光染料。