CN104372068A

CN104372068A - 一种茄病镰刀菌荧光定量pcr检测技术及其应用

Info

Publication number: CN104372068A
Application number: CN201310348495.2A
Authority: CN
Inventors: 石延霞; 李宝聚; 赵一杰; 谢学文; 柴阿丽
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明涉及一种茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术及应用。专用于检测瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒农作上的茄病镰刀菌。该技术包括如下步骤：样本中DNA提取，特异性引物设计，应用以SYBRGreenI为基础的染料法荧光定量PCR检测技术对茄病镰刀菌的ITS区基因片段进行实时荧光定量PCR检测，构建标准曲线，计算待测样本中的ITS区基因片段拷贝数和茄病镰刀菌的浓度。该检测技术操作简便、快速；特异性强、灵敏度高；检测灵敏度最高可达到40个拷贝数每个反应，并且可以同时进行大批量的土壤、种子样本分析，为病害的早期预测预报提供了良好的基础，因此该方法适于在植物病害诊断检测领域广泛推广应用。

Description

一种茄病镰刀菌荧光定量PCR检测技术及其应用

技术领域

本发明为一种茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术及应用，专用于检测瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒农作上的茄病镰刀菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。

背景技术

茄病镰刀菌[Fusarium solani (Mart.) Sacc. ] 是一类世界性分布重要的植物病原真菌，在真菌分类系统中隶属于无性型真菌(Anamorphic fungi)、丝孢纲(Hyphomycetes)、瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)，马特组（Section Martiella）。有性阶段属于肉座菌科（Hypocreaceae）、丛赤壳属（Nectria）。茄病镰刀菌分布非常广泛，普遍存在于土壤，植物和动物体内等，对人类的生产、生活造成了很大的危害。引起各种粮食作物、园艺作物、中草药等的根腐、茎腐、茎基腐，造成作物萎蔫死亡，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，其寄主范围广泛，仅蔬菜上的寄主就包括5类蔬菜，分别由瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒，是生产上最难防治的重要病害之一（李鹏，2009；林清洪，2007；周黎，2008；薛彩云，2007）。

在病害症状明显表现之前不容易预测和避免茄病镰刀菌的侵染，而且土壤中的病原菌也会随着灌溉水从一个地方的土壤传播到另一个地方，病害表现前是防治的最佳时期，一旦发病症状显现就难以治愈，严重威胁到产量，因此，发展有效且快速的茄病镰刀菌快速检测技术，有效的避免该病的蔓延和传播，对于茄病镰刀菌引起的土传病害的防治具有十分重要的意义。

实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称（RT-PCR））是在常规定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。通常实时荧光定量PCR技术所使用的荧光化学剂包括TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料。该技术作为一种快速，灵敏，特异性高并且可以定量检测病原菌的检测方法现已广泛应用于植物真菌的检测。采用SYBR Green实时定量PCR方法对小麦种传病害进行检测取得了较好效果（McEwan et al., 2000），应用实时定量PCR方法检测不同感染比例小麦种子上的镰刀菌的含量，表明种子感染的程度与种子上镰刀菌的含量的相关性（Glynn et al., 2010）。这为我们检测茄病镰刀菌技术的研究提供了有力基础。

RT-PCR是通过PCR在指数扩增期间连续检测荧光信号的强弱来即时检测特异性产物的量，并据此评估目的基因的起始模板量。与常规PCR相比，具有操作简便、高效快速、敏感性强、可重复性好和特异性高的优点。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的工作原理是在常规PCR的体系中加入荧光染料SYBR GreenⅠ，SYBR GreenⅠ是一种结合于双链DNA小沟中的荧光染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。在PCR反应体系中加入过量的SYBR GreenⅠ荧光染料，荧光染料能够特异性地掺入到DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的荧光染料分子不发射任何荧光信号。从而随着PCR反应的进行，保证荧光信号的增强与PCR产物增加完全同步，信号增强到某一阈值的循环次数（用循环阈值Ct表示）被记录下来，Ct值和PCR体系中起始模板的对数之间有严格的线性关系，利用阳性定量标准品扩增的Ct值和标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确计算出起始模板中某核酸的存在及数量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茄病镰刀菌的荧光定量PCR快速检测的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种荧光定量PCR检测技术在瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒茄病镰刀菌引起的土传病害流行监测预报，土壤带菌以及种子带菌检测方面的应用。

该检测技术，在植物病害诊断与防治领域可以大规模推广。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

该方法的实验步骤为：从待测样本提取DNA；将加入标准品及待测样品的荧光定量反应液上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；通过比较待测样品和标准品的循环阈值，根据标准曲线计算出待测样品的起始DNA浓度。

本发明的技术具体包括如下步骤：

1、取田间自然发病土壤、发病植株、蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本；

2、特异性引物设计，为避免由于引物专化性较低，PCR反应中出现假阳性结果或对非目标真菌产生非特异性扩增，本发明在系统分析茄病镰刀菌的ITS区、18SrRNA和5.8SrRNA核酸序列系统发育的基础上，对已经发表在GenBank上的不同国家和地区茄病镰刀菌rDNA-ITS基因的序列进行比较，利用 Primer remier 5.0 软件在茄病镰刀菌基因的rDNA-ITS区设计一对特异性引物FSF1：5’-GCTAACAATCATCTACAGAC-3’；FSR1：5’ -GACGGATGAGAGAGC-3’，扩增片段长度为487 bp（图1）。

Fusarium solani 18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA和ITS2部分序列NCBI登录号为（DQ986152.1）。

3、实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中SYBR Premix Ex Taq(内含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ) 12.5μl，浓度为10μmol/L的正义引物FSF1和反义引物FSR1各0.5μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液2μl，ddH₂O补齐至25μl；

4、PCR反应程序为：PCR采用两步法，95℃预变性3min，接着进行35个循环，每个循环包括95℃ 变性 30s、60 ℃ 退火 30s、72 ℃延伸1.5min；PCR完成后，按0.1℃ s^-1升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；

5、插入ITS区的pMD-18T载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度，按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；

6、取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH₂O，阳性对照采用质粒基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中根肿病菌的浓度。

检测茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术可以转化成商品化的试剂盒，包括标准阳性DNA模板、荧光定量反应液。

标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pGM-T（购自天根公司）载体制备而成。标准品的制备过程为：采用引物ITS1和ITS4扩增根肿病菌的ITS区，PCR产物电泳后切下含有目标片段的凝胶，目标片段用凝胶试剂盒回收纯化后与pGM-T载体16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化产物涂平板培养，挑去白斑，采用引物为FSF1/FSR1进行PCR鉴定。阳性克隆通过序列分析进一步鉴定结果的可靠性。选择PCR和序列分析均为阳性的克隆，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，采用质粒小提试剂盒（购自天根公司）制备质粒DNA。DNA经紫外分光光度计A260定量，经10倍梯度稀释为200ng-200fg/μL，保存于-20℃。

荧光定量反应液由正义引物FSF1、反义引物FSR1、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ组成。

本发明提供的茄病镰刀菌荧光定量PCR检测技术，针对茄病镰刀菌基因组ITS区特异的靶序列设计引物，通过优化反应体系（引物浓度、扩增程序等）的优化，采用定量检测系统（包括ABI Prism系统、PE Applied Bioasystems、Bio-Rad），可用于各种来源的茄病镰刀菌的定量检测。引物对的检测限点为13个细胞每个反应。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1）特异性好、鉴定快速

引物包括茄病镰刀菌的特异性序列，检测特异性高。环境中，特别是蔬菜根际微生物种类繁多，不容易进行分离培养后检测，本发明克服了这一不足之处，并且检测快速。

2）准确定量、灵敏度高

与普通PCR检测相比，本发明可以准确定量，目标DNA在200ng-200fg/μL浓度范围内，都有良好的线性关系；同时检测具有重复性好的特点。

3）实用性好、应用范围广

可以定量检测植物植株、土壤、种子以及水中的茄病镰刀菌，结合蔬菜茄病镰刀菌的田间发病阈值，可以为病害的早期预测预报提供有力参考。

附图说明

图1是引物对FSF1/FSR1特异性检测PCR扩增结果。1的模板为茄病镰刀菌基因组DNA，2-10的模板分别为马铃薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢镰刀菌基因组DNA、串珠镰刀菌基因组DNA、辣椒疫霉菌基因组DNA、瓜果腐霉菌基因组DNA、立枯丝核菌基因组DNA、西瓜壳二孢基因组DNA、核盘菌基因组DNA、西瓜炭疽菌基因组DNA，N为阴性对照，M为250bp DNA Ladder（Takara 公司）；

图2 实施例3荧光定量PCR扩增的标准曲线

纵轴为Ct，横轴为Log CO；标准误为0.9985；

图3实施例3荧光定量PCR阳性标准品的扩增曲线

纵轴为Delta Rn；横轴为 Cycle Number；

曲线1，2，3，4，5和6的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为1.36ng，136pg，13.6pg，1.36pg，136fg，13.6fg；

图4 实施例2荧光定量PCR 检测威百亩处理后定制黄瓜前土壤中茄病镰刀菌动态变化

纵轴为茄病镰刀菌孢子数量；横轴为处理时间；

图5 实施例2荧光定量PCR 检测威百亩处理后定制黄瓜后土壤中茄病镰刀菌动态变化

纵轴为茄病镰刀菌孢子数量；横轴为处理时间。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐述发明。应当理解，下列实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护范围。应用实例中DNA提取采用的是试剂盒，实际应用中也可以采用改良CTAB等方法。

实施例1：茄病镰刀菌的特异性引物检测

茄病镰刀菌及其他病原菌真菌和细菌菌菌株见表1。病原真菌菌株用PDA（每1000 ml培养基马铃薯200 g，葡萄糖20g，琼脂20 g）或PD液体培养基（每1000 ml培养基马铃薯200 g，葡萄糖20g）培养；土传病原细菌菌株用NA培养基（每1000 ml培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g）或NA液体培养基（每1000 ml培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g）培养。所有菌株先在固体培养基上活化，然后转入液体培养基培养，1周后收集菌丝或菌体提取DNA。DNA的提取采用改良的 CTAB提取法（Sambrook，1989）。

对已经发表在GenBank上的不同国家和地区茄病镰刀菌rDNA-ITS基因的序列进行比较，利用 Primer remier 5.0 软件在茄病镰刀菌基因的rDNA-ITS区设计一对特异性引物FSF1：5’-GCTAACAATCATCTACAGAC-3’；FSR1：5’ -GACGGATGAGAGAGC-3’，扩增片段长度为487bp，引物由上海生工科技有限公司合成。使用时引物用双蒸灭菌水稀释至10μmol·L^-1。

以茄病镰刀菌及其它病原菌真菌及细菌的基因组DNA为模板，利用引物FSF1/FSR1进行普通PCR扩增，以检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如下：总反应体积25μL，10×PCR buffer2.5μL，dNTP（10μmol/L）0.5μL，引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA3.0μL，TapDNA聚合酶1μL，最后以ddH₂O补足至25 μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，共40个循环；72℃延伸7 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测（图1）。

表1 引物特异性检测菌株

特异性检测引物对FSF1/FSR1对茄病镰刀菌及近缘种、属以及其它土传病原菌的PCR扩增结果（图1，2）显示该引物对具有很好的特异性。在52℃退火条件下，只对茄病镰刀菌有487bp的扩增产物，其他菌株均无扩增产物。

实施例2：威百亩熏蒸土壤中茄病镰刀菌数量的动态检测

土样人工接种茄病镰刀菌制成浓度为1.0×10⁷休眠孢子数/g灭菌土的病土，使用威百亩熏蒸处理接种土壤，采用已经构建好的荧光定量PCR体系对土样中的茄病镰刀菌数量进行动态检测。对土样在提取DNA时进行冻干处理，取冻干样本0.2-0.5g，采用（美国MP Biomedicals 公司， FastDNA SPIN Kit for Soil）提取、纯化DNA。DNA溶解于40μl TE缓冲液，取2μl DNA溶液作模板，进行荧光定量PCR检测。

荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中SYBR Premix Ex Taq 12.5μl，10μmol正义引物FSF1和反义引物FSR1各0.5μl，标准品10倍梯度稀释液（2.00ng，200pg，20.0pg，2.00pg，104fg，20.0fg）和待检测样品DNA溶液2μl，余下用ddH₂O补齐。PCR采用 95℃ 3 min；95℃ 30s，60℃ 30 s，72℃ 35 s，在72℃采集荧光，共 40 个循环。

循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果，计算待测样品茄病镰刀菌DNA含量。结果表明标准品具有极好的线性关系，相关系数为0.998；待测样品有明显的荧光信号增加，并且具有很好的动力学曲线。

上述结果表明威百亩高浓度处理对接种的茄病镰刀菌的抑制效果显著。高剂量威百亩处理的土壤在处理时间为3d时茄病镰刀菌的数量下降到接种量的20.83%，并且到15d时基本维持在这个水平。中浓度威百亩处理时间为7d时茄病镰刀菌数量下降到接种量的19.67%，抑制效果显著。低浓度威百亩处理对镰刀菌的抑制效果不明显，在整个处理期茄病镰刀菌的数量基本维持在接种量的80%（图4）。

定植黄瓜后各个处理土样中茄病镰刀菌菌量均显著表现为上升的趋势。清水处理的镰刀菌总量明显高于威百亩各处理的带菌量，威百亩两个高剂量处理60g/m²和80g/m²的镰刀菌数量差异不明显，但显著低于清水对照和甲托处理的带菌量。威百亩低浓度处理镰刀菌总量相对于高浓度处理较大，这可能是由于土层中药剂分布较少导致扩散不充分有利于镰刀菌种群的恢复，或是由于威百亩处理后使土壤微生物群落结构发生了变化利于土壤自身对镰刀菌的控制（图5）。

茄病镰刀菌随着蔬菜长期连作栽培，可以在土壤中大量繁殖并且积累，导致病情逐年加重，通过本检测技术对土壤样本的检测，也可以初步确定茄病镰刀菌在田间引起根腐病的大概发病阈值，该方法的建立可以对田间土壤样本中的茄病镰刀菌及时准确的进行定量检测，对我们制定栽培抗病品种以及倒茬轮作等防治手段等方面具有重要的指导意义。

实施例3：污染种子中茄病镰刀菌检测

种子采自于河北省青县、山东省寿光、中国农业科学院蔬菜花卉研究所，其中黄瓜种子5份、南瓜种子5份、甜瓜种子5份，这些种子均为经过商业化的清洗，由当地的农民及研究组提供。采用定量PCR技术检测从种子提取的茄病镰刀菌基因组DNA，评价田间采收的瓜类种子带菌情况。

荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，其中12.5μL PCR Mix（SYBR GreenⅠ，10 mmol·L^-1 dNTPs，0.5 U Taq polymerase，2 μL 10×PCR buffer，含100 mmol·L^-1 KCl，20 mmol/ Tris.HCl，3 mmol·L^-1 MgCl2，0.02%明胶），模板DNA2μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）0.5 μL，补加双蒸水加至25μL。实时荧光定量 PCR反应条件如下： 95℃ 3 min；95℃ 30s，60℃ 30 s，72℃ 35 s，在72℃采集荧光，进行 40 个循环（图2，3）。

表3 荧光定量PCR检测带菌种子结果及CT值

注：“-”代表检测结果为阴性；“+”代表检测结果为阳性

上述结果表明，采用该检测体系可以对田间自然采收的种子进行带菌检测，并且检测结果良好。同时，该实验证明田间采收的瓜类等蔬菜种子具有很高的带菌率并且带菌量较高，这为茄病镰刀菌的传播和蔓延创造了良好的机会，采用该技术对采收及商业化的种子进行检测，可以为病害的防治提供理论依据。

Claims

1.一种茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤：

1）取田间自然发病土壤、发病植株、茄果类蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本；

2）特异性引物设计，对已经发表在GenBank上的不同国家和地区茄病镰刀菌rDNA-ITS基因的序列进行比较，利用 Primer remier 5.0 软件在茄病镰刀菌基因的rDNA-ITS区设计一对特异性引物,根据Genbank中公布的茄病镰刀菌rDNA-ITS区序列设计特异性引物对EF1/EF2：

引物对：正向引物5’-GCTAACAATCATCTACAGAC-3’

反向引物5’ -GACGGATGAGAGAGC-3’

3）实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中SYBR Premix Ex Taq(内含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ) 12.5μl，浓度为10μmol/L的正义引物EF1和反义引物EF2各0.5μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液2μl，ddH₂O补齐至25μl；

4）PCR反应程序为：PCR采用两步法，95℃预变性3min，接着进行35个循环，每个循环包括95℃ 变性 30s、60 ℃ 退火 30s、72 ℃延伸1.5min；PCR完成后，按0.1℃ s^-1升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；

5）插入ITS区的pMD-18T载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成7个浓度梯度，按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；

6）取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH₂O，阳性对照采用茄病镰刀菌菌株基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中茄病镰刀菌的浓度。

2.权利要求书1所述的检测茄病镰刀菌的荧光定量PCR检测技术可以转化成商品化的试剂盒，试剂盒包括：正义引物EF1、反义引物EF2、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ、以及由插入ITS区的pMD-18T载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释。

3.该技术可以应用于对农田环境中，包括对土壤中越冬菌量和发病植株瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒5类蔬菜上茄病镰刀菌进行实时监测，以及检测瓜类、菜豆、豌豆、胡椒、山椒等5类蔬菜种子带菌和田间灌溉水中的茄病镰刀菌。