CN1702176A - 用于检测梨火疫病菌的一步双重pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明用于检测梨火疫病菌的一步双重PCR方法，适用于检测梨火疫病菌。属于农作物病害防治和植物检疫技术领域。该方法根据梨火疫病菌的pEA29质粒和基因组ams基因序列，设计二对特异性引物，在同一反应体系中同时检测梨火疫病菌，扩增产物大小分别为1.0kb和1.5kb，这两对引物的检测灵敏度达到了3个细菌细胞。是对梨火疫病菌pEA29质粒特异性引物检测方法的补充和改进。对于不含有pEA29质粒的梨火疫病菌菌株也可以进行检测。同时，本方法采用双重PCR技术，二对引物在同一反应体系中同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸大规模推广。
Description
(一)技术领域
本发明“用于检测梨火疫病菌的一步双重PCR方法”，专用于检测梨火疫病菌，属于农作物病害防治和植物检疫技术领域。
(二)背景技术
梨火疫病菌(Erwina amylovora)是梨、苹果及其他蔷薇科植物上的一种毁灭性细菌病害，最早发现预1780年，现主要分布在中北美、大洋州、欧洲、西亚、埃及、日本、韩国等40多个国家或地区。1951-1960的十年间，美国平均每年损失400万美元。我国目前尚未发现有该病害的危害，被列为我国的对外一类检疫对象。
梨火疫病主要危害花、叶、嫩梢、果实等，一般减产25％。
我国果树栽培面积很大，据1998年统计，苹果的栽培面积达284万hm2，梨树面积达94万hm2，与世界各国相比，苹果和梨树栽培面积及总产均居世界首位。随着国际贸易的不断扩大，我国开始从日本和韩国引进优良果树品种的种苗，从美国、澳大利亚等国家进口各种水果，如不严格检疫，则很可能将梨火疫病菌带入我国。该病一旦传入，势必会对我国的果树栽培与生产带来严重危害，同时也将影响我国优质水果的出口创汇。
加强检疫必需建立一套快速而准确的分子检测方法，但国际上已有多种方法：1)半选择性培养基分离培养鉴定；2)血清学检测技术，如ELISA和免疫荧光；3)DNA杂交和PCR技术等。但目前国内对梨火疫病的检测尚无标准的检测方法。
在植物病原细菌检测和鉴定中应用较为广泛的是PCR技术。PCR技术检测是利用特异性的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果。PCR技术检测具有灵敏度高，特异性强，快速和简便等优点。
国外根据梨火疫病菌中pEA29质粒的部分序列，设计一对特异引物来检测梨火疫病菌。但对于不含有pEA29质粒的梨火疫病菌无法进行检测。
(三)发明内容
技术问题 本发明的目的是提供用于检测梨火疫病菌的一步双重PCR方法。该方法根据梨火疫病菌的pEA29质粒和基因组ams基因序列，设计二对特异性引物，在同一反应体系中同时检测梨火疫病菌。是对梨火疫病菌pEA29质粒特异性引物检测方法的补充和改进。对于不含有pEA29质粒的梨火疫病菌菌株也可以进行检测。同时，本方法采用多重PCR技术，两对引物在同一反应体系中同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸大规模推广。
技术方案
用于检测梨火疫病菌的一步双重PCR方法，包括：
1)用于检测梨火疫病菌的样品制备
a)以菌脓做为模板
将-80℃保存的梨火疫病菌活化，首先挑取菌液在NA培养基(牛肉浸膏3克，酵母浸粉0.5克，蛋白胨5克，葡萄糖10克，蒸馏水1000毫升，pH7.0-7.2)上，28℃，培养1-2天，挑取菌脓，直接加到PCR反应体系中。
b)以新鲜培养的菌液做为模板
从NA培养基上挑取菌脓，加到NA液体培养基中，28℃，振荡培养1天，取1μl菌液做为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
2)用于检测梨火疫病菌的特异性引物
primer A/B和primier E/F，其引物序列为：
PrimerA：5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’
PrimerB：5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’
PrimerE：5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’
PrimerF：5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’
其中primer A/B引物序列来自该菌的特有的pEA29质粒，在梨火疫病菌中特异性扩增出1.0kb的产物；primer E/F引物序列来自改菌的染色体，在梨火疫病菌中特异性扩增出1.5kb的产物。
3)PCR扩增的反应体系
primer A/B引物对和primer E/F引物对在同一个反应体系中同时进行双重PCR反应，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl2 10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primer A/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板为新鲜培养的梨火疫病菌1μl或菌脓，以无菌水补足，终体积为50μl。
4)PCR扩增程序
95℃预变性3min，93℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
4)PCR产物的鉴定
取10μl PCR产物用0.1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
有益效果
本发明用于检测梨火疫病菌的一步双重PCR方法，可用于检测从病斑组织分离的梨火疫菌体，也可用于检测无发病症状的植物材料是否带有梨火疫病菌。与国外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1)检测准确性高。本方法从梨火疫病菌的基因组和pEA29质粒两个方面同时进行检测，对于不含有pEA29质粒梨火疫病菌菌株也能检测到。
2)操作简便快捷。本发明采用多重PCR技术，两对引物在同一反应体系中同时扩增，扩增模板可以为菌脓或新鲜培养的菌液，省去了细菌DNA制备的繁琐过程。整个过程简单、快速、高效。一般整个检测过程可在4个小时内完成。
3)特异性强。本发明设计的两对引物可特异性检测梨火疫病菌，在其近缘种、属细菌中无扩增产物。
因此本方法实用性强，可满足植物检疫及病害监测的需要。
(四)附图说明
图1：引物primer A/B及primer E/F二对引物对梨火疫病菌及其近缘种、属细菌的双重PCR扩增结果
M：分子量标准DGL2000；1，5：梨火疫病菌(Eal)；2，6：梨火疫病菌(Ea3)；3，7：梨火疫病菌(Ea65)；4，8：梨火疫病菌(Ea67)；9：根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens；10：萝卜软腐菌Erwinia carotovora var.carotovora；11：玉米细菌性茎腐病菌Erwinia chrysanthemi；12：玉米细菌性枯萎病菌Erwiniastewartii；13：草生欧文氏菌Erwinia herbicola(非致病菌)；14：丁香假单胞菌Pseudonomas syringae；15：梨梢枯病菌Pseudonomas syringae；16：水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae。
*1，2，3，4以梨火疫病菌的菌脓为模板；5，6，7，8以梨火疫病菌新鲜培养的菌液为模板。
图2：引物primer A/B和引物primer E/F检测梨火疫病菌灵敏度及最小检出菌量的测定
Maker：分子量标准DGL2000；1：梨火疫病菌Eal原菌液；2：稀释10-1；3：稀释10-2；4：稀释10-3；5：稀释10-4；6：稀释10-5；CK：阴性对照(模板为水)
(五)具体实施方式
实施实例1：引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌菌脓做为模板。
1)梨火疫病菌菌脓模板的制备
将-80℃保存的梨火疫病菌活化，首先挑取菌液在NA培养基(牛肉浸膏3克，酵母浸粉0.5克，蛋白胨5克，葡萄糖10克，蒸馏水1000毫升，pH 7.0-7.2)上，28℃，培养1-2天，挑取菌脓，直接加到PCR反应体系中。
2)检测梨火疫病菌的特异性引物的合成
Primer A：5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’；
Primer B：5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’
及
Primer E：5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’
Primer F：5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’由上海生工公司合成。
3)PCR扩增反应
primer A/B引物对和primer E/F引物对在同一个反应体系中同时进行双重PCR反应，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl2 10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primer A/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板为梨火疫病菌的菌脓，以无菌水补足，终体积为50μl。
4)PCR扩增程序
95℃预变性3min，93℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
5)PCR产物的鉴定
取10μl PCR产物用0.1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
利用引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌的菌脓为模板，以梨火疫病菌近缘种、属为对照进行双重PCR扩增。在1-4泳道的梨火疫病菌中扩增出了1.5kb和1.0kb两条目的条带(见附图1的1-4泳道)。在其他8个近缘种、属细菌中均无扩增产物。说明我们所筛选的来自梨火疫病菌质粒及染色体DNA的二对特异性PCR扩增引物的特异性强。
实施实例2：引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌新鲜培养的菌液做为模板。
1)以新鲜培养的菌液做为模板
从NA培养基上挑取菌脓，加到NA液体培养基中，28℃，振荡培养1天，取1μl菌液做为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
2)检测梨火疫病菌的特异性引物的合成
Primer A：5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’；
Primer B：5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’
及
Primer E：5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’
Primer F：5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’由上海生工公司合成。
3)PCR扩增反应
primer A/B引物对和primer E/F引物对在同一个反应体系中同时进行双重PCR反应，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl2 10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primerA/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板为新鲜培养的梨火疫病菌菌液1μl，以无菌水补足，终体积为50μl。
4)PCR扩增程序
95℃预变性3min，93℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
5)PCR产物的鉴定
取10μl PCR产物用0.1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
利用引物primer A/B和引物primer E/F以梨火疫病菌的菌脓为模板，以梨火疫病菌近缘种、属为对照进行双重PCR扩增。在5-8泳道的梨火疫病菌中扩增出了1.5kb和1.0kb两条目的条带(见附图1的5-8泳道)。在其他8个近缘种、属细菌中均无扩增产物。说明我们所筛选的来自梨火疫病菌质粒及染色体DNA的二对特异性PCR扩增引物的特异性强。
实施实例3：引物primer A/B和引物primer E/F检测梨火疫病菌灵敏度及最小检出菌量的测定
1)以新鲜培养的菌液做为模板
从NA培养基上挑取菌脓，加到NA液体培养基中，28℃，振荡培养1天，分别取原菌液及稀释101-105倍的菌液1μl为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
2)检测梨火疫病菌的特异性引物的合成
Primer A：5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’；
Primer B：5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’
及
Primer E：5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’
Primer F：5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’由上海生工公司合成。
3)PCR扩增反应
primer A/B引物对和primer E/F引物对在同一个反应体系中同时进行双重PCR反应，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl2 10μl，10mM dNTPs 2μl，10mM primerA/B和primer E/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板为新鲜培养的梨火疫病菌菌液1μl，以无菌水补足，终体积为50μl。
4)PCR扩增程序
95℃预变性3min，93℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
5)PCR产物的鉴定
取10μl PCR产物用0.1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
6)铺平板计算最小检出菌量
分别取原菌液及稀释101-105倍的菌液在NA培养基上涂平板，计算各平板上细菌的菌落数。再根据稀释倍数得出PCR扩增所检出的最小菌量。
实施结果
分别以引物PrimerE+F和引物PrimerA+B做最小检出菌量的测定，能检测到的最小菌量为原菌液稀释105倍(见图2)，涂平板计数结果为：Eal原菌液稀释10-1板上有许多菌落长出，稀释10-3有27个菌落，稀释10-4有3个菌落长出，稀释10-5没有菌落长出，计算得出最小检出菌量能达到3个细胞。
Claims (2)
1.包括梨火疫病菌特异性检测引物两对，primerA/B和primier E/F，其引物序列为：
Primer A：5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’
Primer B：5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’
Primer E：5’-AATAAGGTGCCTGGTAATG-3’
Primer F：5’-GGTGGAATGAGACTGGGTA-3’
其中primer A/B引物对在梨火疫病菌中特异性扩增出1.0kb的产物，primer E/F引物对在梨火疫病菌中特异性扩增出1.5kb的产物。
2.权利要求1所述梨火疫病菌特异性检测的用法，包括：
PCR扩增采用50μl反应体系，primerA/B引物对和primer E/F引物对在同一个反应体系中同时进行多重PCR反应，其中10×PCR buffer 5μl，15mM MgCl2 10μl，10mM dNTPs2μl，10mM primerA/B和primerE/F各3μl，Taq酶(5U/μl)1μl，模板为新鲜培养的梨火疫病菌1μl或菌脓，以无菌水补足，终体积为50μl。
PCR扩增程序为：95℃预变性3min，93℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
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