CN103114137A

CN103114137A - 梨火疫病菌荧光pcr快速检测引物及试剂盒

Info

Publication number: CN103114137A
Application number: CN201310027589XA
Authority: CN
Inventors: 郑媛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2013-05-22

Abstract

本发明涉及一种梨火疫病菌的实时荧光PCR快速检测引物及试剂盒，所述的引物包括序列为SEQ IDNO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物。本发明根据梨火疫病菌的ITS基因序列，利用分子生物学分析获得了具有特异性的保守序列，并设计其特异性扩增引物。该保守基因序列为不同梨火疫病菌株系所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的梨火疫病菌的可靠性。另外，本发明的引物采用荧光标记，与普通PCR技术相比，不必用凝胶电泳方法来观察，实现了检测流程一体化封闭检测。

Description

梨火疫病菌荧光PCR快速检测引物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种梨火疫病菌荧光PCR快速检测引物及包含该引物的试剂盒。

背景技术

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)最早于1780年发现于美国纽约州附近的一个果园，以后随美国移民西进，于1902年到达加利福尼亚州，1904年又在加拿大发现，1919年进入新西兰，1957年传入英国，20世纪60年代在欧洲大陆扎根并传入埃及，20世纪80年代传入亚洲。此菌引起的火疫病在世界范围内引起重大损失。如美国加州在一年内因此病的发生梨树由12.5万株减少到1500株，在其南部的Joachimstal，4年内损失约总量94％的梨树，以至于不得不放弃种植梨树。

梨火疫病菌一般采用选择性培养基分离。致病性测定用菌液在梨组织上进行穿刺接种，在27℃需要3d以上的时间才能观察到有效症状。在利用ELISA检测该种病菌时，检测限约为5×10³cfu/Ml，但值得注意的是，单克隆抗体法无法检测该种细菌的全部菌系。

现代检测技术越来越倾向于聚合酶链式反应法(PCR法)等分子检测手段，梨火疫病菌荧光PCR是一种建立在高分辨率熔解曲线分析基础上的高精度核酸检测手段，该种技术无需后期图像处理，所有检测信息全部由荧光PCR仪自动采集完成，无需使用荧光探针即可完成基因、单碱基筛查，对于植物病原细菌一类病原微生物是一种理想的分子生物学检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供梨火疫病菌荧光PCR快速检测，即一种能够通过检测梨火疫病菌特异性片段来判断检测样品中是否存在梨火疫病菌的荧光引物。

本发明的荧光引物，包括：

1)序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物；

2)对1)中的引物对通过转换、插入、缺失或5’添加基所形成的引物对，且引物对扩增的产物在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；

3)在1)或2)所描述的扩增片段上设计得到的引物对

本发明的梨火疫病菌的荧光PCR快速检测试剂盒，包括如下组分

1)2倍浓度的PCR体系预混合物；

2)上游引物和下游引物，浓度分别为10μmol/L；

3)20倍浓度的荧光染料；

4)DNA样品/报告质粒，10μg/μL；

5)双蒸水。

本发明根据梨火疫病菌保守基因序列，通过分子生物学分析获得了特异性引物，该保守基因序列为不同梨火疫病菌菌系所共有，以保证从种的水平上检测不同来源菌株的可靠性。另外，本发明的引物采用荧光标记，与普通PCR技术相比，不必用凝胶电泳方法来观察，实现了检测流程一体化封闭检测。

具体实施方式

本发明根据梨火疫病菌保守基因序列，通过分子生物学分析获得了特异性引物，该引物包括：

3)在1)或2)所描述的扩增片段上设计得到的引物对

对于2)中描述的引物，包括在引物的5’添加了内切酶识别标识片段所形成的长度不同引物，以及碱基替换、插入、删除所形成的变异引物。这些由序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物所衍生出的引物也能用来检测梨火疫病菌，即2)中所描述的衍生引物所扩增出的核苷酸片段能够在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；所述的严谨条件参照Roche公司的DIG高效DNA标记及检测Starter Kit1手册中的杂交条件。

本发明的引物用于荧光PCR检测梨火疫病菌，PCR反应体系中各组分构成比例如下：

PCR反应程序：

(1)94℃预变性3min；

(2)94℃变性25s；53℃退火，30s，72℃延伸30s，循环40次。

(3)最后加做熔解曲线(95℃15sec，60℃15sec，95℃，15sec)

本发明的引物用于检测梨火疫病菌，检测过程如下：

1、设计并合成特异性寡核苷酸引物用于荧光染料嵌合荧光PCR检测；

构建可以使用上游引物和下游引物扩增的报告质粒，作为阳性对照质粒，防止出现假阴性结果。

本发明所用的报告质粒可以选用人工合成的梨火疫病菌ITS基因(GenBank：GQ181062.1)的部分片段，其序列为SEQ ID NO：3，将该扩增片段插入PMC-T载体得到本发明所应用的报告质粒。

2、以本发明的荧光引物作为引物，以待测样品总DNA为模板，进行目的基因的特异性扩增；

扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR反应结束后测定所合成DNA片段的熔解温度，将数据传输至电脑通过荧光PCR仪配套软件进行分析，可以观察到对保守基因序列进行特异性扩增产生的荧光，并得到扩增产生的特异性片段所持有的熔解曲线(主峰84±0.5)，则证明待测样品中存在梨火疫病菌；如仅观测到荧光信号，而熔解曲线不符合梨火疫病菌特有的熔解曲线，且可以观察到阳性对照报告质粒荧光信号及其产生的熔解曲线，则证明待测样品中不存在梨火疫病菌；如出现其他结果则表明此次检验失败，不能确定是否存在梨火疫病菌，需重新检验。

实施例1：本发明的效果检测

本发明特异性引物通过荧光嵌合PCR报告荧光信号对梨火疫病菌标准菌株进行检测，扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR反应结束后测定所合成DNA片段的熔解温度，将数据传输至电脑通过荧光PCR仪配套软件进行分析，可以观察到对梨火疫病菌进行特异性扩增产生的荧光，并得到对梨火疫病菌进行扩增产生的特异性片段所持有的熔解曲线(主峰84±0.5)。结果表明，本发明的引物和试剂盒可以准确地检测出携带梨火疫病菌的阳性样品，不会产生假阴性。

实施例2：阴性对照

用本发明的引物和试剂盒，按本发明的检测步骤对玉米细菌性枯萎病菌(Erwinia stewartii)、白菜软腐病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)、木薯细菌性萎蔫病菌(Xanthomonas axonopodispv.manihotis)、番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、豌豆细菌性萎蔫病菌(Pseudomonas syringae pv.pisi)等5种阴性对照菌株进行荧光检测，扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR反应结束后测定所合成DNA片段的熔解温度，将数据传输至电脑通过荧光PCR仪配套软件进行分析，没有检测到与梨火疫病菌扩增所得到的相近熔解曲线(主峰84±0.5)，且可以观察到阳性对照报告质粒荧光信号及其产生的熔解曲线。从而证明对非梨火疫病菌的阴性对照病原细菌进行检测时，不会出现假阳性结果。

Claims

1.一种梨火疫病菌的实时荧光PCR快速检测引物，其特征在于，所述的引物包括序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物。

2.梨火疫病菌的荧光PCR快速检测试剂盒，包括如下组分：

1)2倍浓度的PCR体系预混合物；

2)上游引物和下游引物，浓度分别为10μmol/L；

3)20倍浓度的荧光染料；

4)DNA样品/报告质粒，10μg/μL

5)双蒸水。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于上述的DNA样品/报告质粒中包括序列为SEQ ID NO：3的片段。