CN104685068B - 鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的检测方法 - Google Patents

鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于特异性检测和任选地定量来自于个体样品的鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium spp.paratuberculosis)(MAP)的方法。为此，根据本发明的方法，通过核酸扩增和特异性寡核苷酸来检测样品中IS900域的存在。另一方面，本文提供了用于通过扩增方法对样品中MAP进行特异性检测的检验试剂盒。最后，公开了适用于特异性检测MAP的特异性寡核苷酸。

Description

鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的检测方法
技术领域
本发明涉及用于特异性检测和任选地定量来自于个体样品的鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium spp.paratuberculosis)(MAP)的方法。为此，根据本发明的方法，通过核酸扩增和特异性寡核苷酸来检测样品中IS900域(IS900region)的存在。另一方面，本文提供了用于通过扩增方法对样品中MAP进行特异性检测的检验试剂盒。最后，公开了适用于特异性检测MAP的特异性寡核苷酸。
现有技术
鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)是一种具有多种宿主的分枝杆菌种(mycobacterium species)。一方面，鸟分枝杆菌可在禽类中引起结核病，另一方面其也是人类和其它哺乳动物中的病原体。鸟分枝杆菌的一个种是鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌(MAP)，其为分枝杆菌属(genus Mycobacterium)的专性(obligate)病原菌。MAP被视为是引起副结核病(Johne’s disease)的原因，特别是在反刍动物身上会出现该疾病。除了反刍动物和人以外，在其它动物物种，特别是野生动物，尤其是野兔、鸟类、野猫、浣熊和老鼠中也可能检测出MAP亚种。此外，关于该病原体在临床上可能涉及人中的“克罗恩病”(“Crohn’sdisease”)存在着讨论。
自19世纪初就已知MAP病原体为副结核病的病原(causative agent)。副结核病是一种慢性肠道疾病，其会在数星期的时间导致持续的体重减轻。在最后的阶段，这种疾病会产生致命的结果。成年的家养反刍动物，如牛、绵羊和山羊，以及野生的反刍动物和动物园动物主要会被感染。通常，病原体的传播主要发生在新生的小牛和最多6个月大的小牛中。此处，感染大多不易察觉地发生并且通过口腔-粪便的途径无法察觉地转移，甚至被感染的奶牛的初乳会含有病原体。在伴随无规律且不可控的病原体分泌(pathogen excretion)的几年时间的潜伏期之后，该疾病通常先在年龄较大的母牛中出现。目前还没有治疗方法。过去，疫苗显示出了令人怀疑的结果，以至于它们目前在德国没有被使用。通常情况下，购买亚临床上表现(subclinically)感染的或被持久性感染的动物造成了畜群中的新感染。恰恰是临床上不显著的携带者和未识别的排菌者(excreters)是造成长期持续的家畜感染的重要原因。正是由于副结核病的广泛分布和经济损失，目前亟需改进的诊断方法和控制程序的开发。在德国，根据动物传染病法§78a 2款(§78a Art.2 of the Infectious AnimalDiseases Law)副结核病须予以具报。
副结核病的诊断是控制和早期识别副结核病的重要元素。已有依赖于例如基于抗体测试的各种测试方法和诊断方法。然而，商业上可获得的测试的一个问题是灵敏度和特异性的不足。此外，由于因这些测试的灵敏度不够而使血清学检测(serologically)阴性的排菌者可以保留在畜群中并因此可进一步传播疾病，基于抗体的测试是不适用的。
为了能够在将来实施有效的根除计划，可靠的病原体检测方法是必要的。分子生物学，特别是基于核酸扩增的方法已经常性地被讨论。特别地，基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学方法被认为是非常有前途的。PCR是用来确认疑似样品中MAP DNA的快速且可靠的方法。这一方面，插入序列(insertion sequence)IS900以及ISMav2、hspX和F57的域已被确定为MAP基因组中特别合适的域。插入单元IS900特别凸现为适用于(特别是通过PCR方法的)分子诊断的域。IS900是1451bp的片段，其具有参照菌株MAP-K10的基因组中的17个拷贝。由于这一高的拷贝数量，可以实现检测方法中更高的灵敏度并使得IS900成为合适的靶向域。已描述了基于靶向序列IS900的检测MAP用的传统和实时PCR。
由此，DE102007015775A1中包括了适用于特异性检测MAP的寡核苷酸。此外，该文献公开了相应的用于检测MAP的方法和试剂盒。由EP 2 009118 A2已知有基于IS900和F57特异性引物的检测和定量MAP用的方法。
然而，一如既往，上述那些方法仍然存在高特异性时灵敏度不足的弱点。
Bull等人,2007,Plos One,11,e1229描述了用于检测MAP的实时PCR分析法。Münster P.,等人,2011,Vet Microbiol,154(1-2),197-201公开了一种用于检测MAP的半逆转录PCR(semi-rested PCR)(snPCR)。高灵敏度被描述。然而，snPCR需要两个PCR运行的性能。已知snPCR是一种具有高污染风险的方法，因而不适合高样品通量情况下的常规使用。
然而，在高灵敏度和高特异性的情况下检测被感染的个体是必要的，从而能执行适当的消灭程序(eradication program)。特别地，此方法还应当对生物样品，例如粪便、器官、牛奶和组织样品来说是可操作的，并且无需进行大量的需要长达16周的时间或处理步骤的预培养。
此外，该方法应能允许适当的自动化。现有技术中描述的方法则不允许。
发明内容
在一方面，本申请涉及用于在来自个体的样品中特异性检测或定量鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium spp.paratuberculosis)(MAP)的方法。为此，根据本发明的方法包括通过核酸扩增在样品中检测MAP基因组的IS900域(IS900region)的步骤，其中该扩增利用分别由根据Seq.ID No.1和Seq.ID No.2序列的至少15个连续的核苷酸组成的特异性寡核苷酸来进行，并且至少一个MAP基因组的IS900域的检测指示了样品中MAP的存在。
然后发现了如本文所用的特异性寡核苷酸，即分别具有根据Seq.ID No.1和Seq.ID No.2的序列的至少15个连续的核苷酸的寡核苷酸，这在基于一种核酸扩增的诊断方法中实现了针对MAP的出色的特异性和灵敏度。
本文优选的是根据Seq.ID No.1和/或Seq.ID No.2的彼此独立的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有这两个序列的至少16个，例如17个或18个连续的，并且特别是至少19个核苷酸。更优选的是根据Seq.ID No.1和/或Seq.ID No.2的特异性寡核苷酸的至少一种，其具有所述序列的至少11、12、13、14、15个，特别是至少16、17、18、19个或全部核苷酸。清楚的是，还包括其中一种寡核苷酸例如具有根据Seq.ID No.1的序列的至少18个核苷酸以及根据Seq.ID No.2序列的至少19个核苷酸的实施方式。每一种变化均被包括在本发明的范围内。
所述核酸扩增方法优选为聚合酶链式反应(PCR)。其可特别为实时PCR。所述PCR例如为实时PCR的形式，特别为定量PCR。
相对于同样基于PCR的已知方法，使用本发明的寡核苷酸作为引物对(primerpair)，可以在一个扩增循环中获得有意义的结果。此前已知的方法往往依赖于所谓的“巢式”(“nested”)或“半巢式PCR”(“semi-nested PCR”)方法。在这些方法中，扩增发生在两个步骤中，即所述方法需要较长的时间并且比单一步骤的方法更加昂贵。实时PCR的其它优点是MAP DNA的定量的可能性、低污染风险的快速操作以及高灵敏度和特异性的保证。
尤其优选的是，在核酸扩增中，例如PCR，特别是实时PCR，且尤其优选地在定量PCR中，通过核酸探针来实现IS900域的检测。这种核酸探针是通常标记有标签或标记的寡核苷酸，所述标签或标记杂交至MAP基因组的IS900域和/或与MAP基因组的IS900域互补的核酸。
本文中，杂交被理解为核酸分子诸如核酸探针附着至至少一种另外的核酸分子(此处为经扩增的基因片段)，其中在附着区域两个单独的链实质上完全互补。还可在核酸探针和存在的双链DNA之间形成三螺旋。对于本领域技术人员来说已知有公知的杂交方法。特别地，杂交区域至少70％，例如至少75％，特别是至少80％，优选至少90％，例如至少95％，特别是至少99％互补，例如完全互补。
在一项优选的实施方式中，核酸为具有根据Seq.ID No.3的至少15个连续的核苷酸的寡核苷酸。优选的是，探针为具有根据Seq.ID No.3的至少16、17或18个连续的核苷酸的寡核苷酸，优选具有19个核苷酸，例如具有20个核苷酸的Seq.ID No.3序列本身。
此处，以允许用已知方法来进行简单检测的常规方式标记探针。常规的标签或标记是本领域技术人员已知的，例如荧光染料如FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NID、荧光素、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)(FITC)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(6-carboxy-2’,4’,7’,4,7-hexa-chlorofluorescein)，花青染料(cyanine dyes)如Cy3，Cy5等，若丹明染料(rhodamine dyes)，菲啶染料(phenanthridine dyes)以及本领域技术人员已知的其它染料。特别适用于探针检测的是FAM和黑洞淬灭剂-1(black holequencher-1)(BHQ1)。
对于特定的核酸扩增法，例如PCR、实时PCR以及特别是定量PCR来说，合适的染料与合适的扩增系统的结合是本领域技术人员已知的。
可替代地，在实时PCR中加入非活性的，例如淬灭的荧光染料，其可由DNA产生而激活。可与合成的双链DNA互相插入(intercalate)的常见染料例如为溴化乙锭或SYBR绿。在用于核酸扩增的TaqMan系统的使用中，核酸探针是可通过水解检测的，例如可通过确定相应的荧光来检测。在此基础上的其它合适的系统以及例如LightCycler探针、FRET探针、分子信标(molecular beacons)或蝎形引物(scorpion primers)是本领域技术人员已知的。核酸扩增方法特别优选为使用根据Seq.ID No.1和Seq.ID No.2的引物和根据Seq.ID No.3的核酸探针的定量实时PCR。
在根据本发明的方法和检验试剂盒中，还可存在合适的对照。这些对照包括用于扩增的对照和/或用于纯化的对照。这些对照可以例如存在于样品自身中或者以平行的制备来进行。因此，例如实时PCR中的探针可装配有淬灭的染料，例如FAM。同时，所述探针装配有第二标记，其可在与淬灭的染料不同的区域被检测到，例如在不同的区域发射光并且不是淬灭的。由此可以对PCR进行检查。此外，可在样品中扩增阳性对照(例如β-肌动蛋白)，或将其与样品平行扩增。使用与第一和第二标记不同的标记，例如Cy5染料来实现该对照的检测。由此，可对反应进行检查并且能够提高该方法的有效性(validity)。对于排除临床样品的抑制作用的扩增对照，可集成针对探针的第二荧光染料(例如HEX,在533-580nm处测量)。
此外，对于定量，可以以预定的浓度在平行的制备中使用合适的针对MAP的阳性对照。合适的实验制剂是本领域技术人员已知的。
优选从来自个体的样品中实现核酸扩增。此处，进行核酸扩增的样品可以是由大量的混合的样品组成的样品，从而能够有效检验MAP。通常，混合的样品可以是例如来自不同个体的10至20个个体样品的混合物。
本文中术语个体意指选自反刍动物，特别是牛、绵羊和山羊或野生的反刍动物，如斑马等的个体。本文中其还可以是，例如，动物园动物。人类也落入个体的范围内。因此，该方法可用于，例如，人体中MAP的感染的检验(例如，与克罗恩病的诊断相关联的)。
样品本身可选自粪便、乳汁、血液、精液、组织或器官样品。可替代地，还可以是环境样品，例如基于植物的样品或来自于沼气装置和湖泊/河流的样品。
所述样品优选为来自于反刍动物，特别是牛的粪便或乳汁样品。
此外，根据本发明，可通过适当的方法来处理所述样品。常规的方法包括样品的处理。适当的方法是本领域技术人员已知的。特别地，可通过已知的DNA提取法来实现所述处理。这包括使用已知的基于表面活性剂和盐的试剂盒。此外，包括使用均化器(homogenizers)等的处理的机械的DNA提取方法也是可行的。特别地，包括提取用表面活性剂的使用的方法是合适的。
在另一方面，本发明涉及用于通过扩增方在样品特异性检测MAP的检验试剂盒。该检验试剂盒包括用于扩增MAP IS900域的寡核苷酸，其分别具有根据Seq.ID No.1和2的至少15个连续的核苷酸。该检验试剂盒优选为用于PCR核酸扩增，特别是实时PCR核酸扩增的试剂盒。在一项特别优选的实施方式中，所述检验试剂盒是适用于定量PCR，例如定量实时PCR的试剂盒。在一项实施方式中，所述检验试剂盒进一步包括具有根据Seq.ID No.3的核酸探针的至少15个连续的核苷酸的寡核苷酸。该检验试剂盒特别适用于例如基于TaqManPCR的定量分析。本发明的检验试剂盒可进一步包括用于进行核酸扩增的其它组分，特别是必要的酶、核苷酸和缓冲液。此外，还可优选将阳性的对照包括在内和/或指示本发明方法的实施。
最后，所述检验试剂盒可包括合适的试剂和装置，其适用于例如从样品，特别是粪便、乳汁、血液、精液、器官、组织和环境样品中提取基因组DNA，和/或用于实施PCR，特别是实时PCR的装置。
合适的试剂盒装置时本领域技术人员已知的。
最终，本申请涉及用于在来自个体的样品中特异性检测和任选地定量MAP的寡核苷酸，其中存在Seq.ID No.1序列的至少15个连续的核苷酸和Seq.ID No.2序列的至少15个连续的核苷酸，以及任选的Seq.ID No.3序列的至少15个连续的核苷酸。
这些寡核苷酸特别适用于通过定量实时PCR来特异性检测MAP和任选地用于定量MAP。本发明的寡核苷酸为上文所述的寡核苷酸。
下面将通过实施例来对本发明加以详述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例
为检查根据本发明的引物(MAP523-542f/MAP661-642r)和根据表1的TaqMan探针(MAP617-636p)的特异性，在传统的PCR和实时PCR中对通常出现在农业和环境中的14种分枝杆菌种和14种非分枝杆菌种进行检验并且确定其特异性(表2)。图1显示了根据本发明的引物相对于现有技术中的引物的位置。
表1：在实时PCR中用于检测MAP DNA的引物和TaqMan探针的核酸序列
*根据公布的IS900序列MAP k-10(GenBank：AF416985)，Seq.ID No.4
表2：用于Taq-Man实时PCR的特异性检测的参照菌株
通过QIAmp Blood试剂盒(Quiagen,Hilden,德国)从培养物(cultures)中提取所使用的参照菌株的DNA，并通过(ND-1000分光光度计,peQLabBiotechnologie GmbH,Erlangen)进行分析。将DNA调整至1ng/μg。通过使用已公开的PCR方法的证实了参照菌株的种特异性DNA。使用无菌蒸馏水作为阴性对照。
在所有情况中，在琼脂糖凝胶上均能够清楚地识别从特定的属特异性PCR所预期的PCR产物。
为了阐明它们的特异性，在传统的PCR中检验了两种引物(MAP523-542f/MAP661-642r)与其它菌种的交叉反应性(图2)。为准备PCR，使用了“Ready-To-GoTM”PCR“珠”(AmershamPharmacia Biotech Europe,Freiburg)。PCR的反应制剂和条件如下：
在PCR之前于95℃实施变性步骤4分钟
变性: 95℃,30秒
退火: 58-70℃,30秒
延伸: 72℃,60秒
于72℃延长延伸步骤7分钟以完成PCR。
只有在使用MAP DNA样品(ATCC 19698)的情况下才能在琼脂糖凝胶上清楚地识别预期的139bp PCR产物。针对其它菌种(n＝14)，未观察到139bp域的扩增产物。因此，所使用的引物(MAP523-542f/MAP661-642r)可被视为MAP特异性的。
此外，通过对139bp产物进行测序确认了特异性。为此，将PCR产物克隆到质粒载体(Invitrogen,Groningen,荷兰)中，在大肠杆菌(E.coli)中增殖并使用Plus SV Minipreps Purification System(Promega,Mannheim)来纯化。借助于MegAlign将核苷酸序列与MAP K-10参照菌株(登记号：AE16958)的序列进行了比较。共测序了15个克隆并且在两个方向中进行了评估。扩增产物的IS900序列与所公开的牛MAP K-10序列100％一致。
在参照菌株(n＝14)的基础上于传统的PCR中对所述引物(MAP523-542f/MAP661-642r)的特异性进行检查之后，应在实时PCR中结合引物确认探针(MAP617-636p)的特异性。无菌蒸馏水被用作阴性对照。在LightCyclerTM480(Roche Diagnostics,Mannheim)上利用TaqMan探针进行的实时PCR的反应制剂和反应条件如下：
图3示出了借助于TaqMan探针(MAP617-636p)的MAP检测。
引物(MAP523-542f/MAP661-642r)和TaqMan探针(MAP617-636p)的MAP特异性可被充分证实。只有在使用参照菌株MAP(ATCC 19698)的情况下信号才是可见的。其它菌种的反应可与阴性对照相比。
为了进一步说明特异性，检验了引物(MAP523-542f/MAP661-642r)和TaqMan探针(MAP617-636p)与其它分枝杆菌菌种(n＝13)的交叉反应性。
从如上所描述的培养物中纯化所使用的分枝杆菌参照菌株的DNA，并借助进行分析。将DNA调整至1ng/μl的浓度。通过使用已公开的“多重”PCR(“multiplex”PCR)方法(Shin等人,2010,Journal of Clinical Microbiology 48(11),4057-4062)来确认参照菌株的种特异性DNA。无菌蒸馏水被用作阴性对照。在该文献中记载了反应制剂和反应条件。
在琼脂糖凝胶上能够清楚地识别来自于特定的分枝杆菌菌种(mycobacteriumspecies)的预期的PCR产物。为了进一步说明引物(MAP523-542f/MAP661-642r)的特异性，在传统的PCR中检验了该引物与其它分枝杆菌菌种的交叉反应性(图4)。
仅MAP DNA(ATCC 19698)的情况下在琼脂糖凝胶上清楚地识别预期的139bp PCR产物。利用其它分枝杆菌菌种(n＝13)未在139bp域中出现扩增产物。因此，相对于其它分枝杆菌菌种，所使用的引物(MAP523-542f/MAP661-642r)可被视为MAP特异的。
在分枝杆菌参照菌株(n＝13)的基础上于传统的PCR中对所述引物(MAP523-542f/MAP661-642r)的特异性进行检查之后，应在实时PCR中结合所述引物确认探针(MAP617-636p)的特异性。无菌蒸馏水被用作阴性对照。上文已经定义了在LightCyclerTM 480(RocheDiagnostics,Mannheim)上利用TaqMan探针进行的实时PCR的反应制剂和反应条件。
对于其它分枝杆菌菌种，引物(MAP523-542f/MAP661-642r)和TaqMan探针(MAP617-636p)的MAP特异性可被充分证实。只有在使用参照菌株MAP(ATCC19698)的情况下才可见信号。其它分枝杆菌菌种的反应与阴性对照相当。
由来自培养物的质粒DNA和MAP DNA(ATCC 19698)的1ng/μl～1fg/μl的滴定系列(titration series)确定了所开发的TaqMan实时PCR的检测极限或灵敏度(图5)。
为制备质粒DNA，如上所述克隆并纯化了PCR产物(139bp)。然后，通过确定了质粒DNA的核酸含量并制备了从1ng/μl至1fg/μl的稀释系列。
在培养物中使用制备的MAP DNA后，获得了10fg/μl的检测极限。MAP的基因组长度为4.7x 106bp(Cocito等人,1994,Clinical Microbiology Reviews 7(3),328-345)。使用阿佛加德罗常数6.022x 1023mol-1和660g x mol-1的一个碱基对的分子量，可计算出5.15fg对应于一个基因组单元(Münster等人,2011,Veterinary Microbiology 154,197-201；Münster等人,2012)。根据所述计算，10fg/μl处的检测极限为约2个基因组单元。
在检查了特异性和灵敏度之后，检验了实时PCR的效率。效率是定量实时PCR的品质特性。通过比较所获得的Cp值和MAP DNA浓度来创建标准曲线。标准曲线规定了各稀释阶段的病原体的经分离的DNA的对数浓度。直线的斜率为-3.42±0.23，误差为0.04±0.02，效率为1.97±0.08(由“二次最大导数”(“2nd derivative maximum”)法评测)。因此，线性的标准曲线被发现适用于TaqMan实时PCR的定量使用。
在LightCyclerTM 480上重复9次(运行3x 3)来确定实时PCR的可重复性并通过“二次最大导数”法和“拟合点”法(“fit point”)来评测。为了可视化，计算“交叉点”(“crossing points”)(Cp)的相应的平均值和标准偏差，即循环数，于该数值处荧光首次上升至显著高于背景荧光的程度，并将其表示为柱状图(图6和7)。
可显示的是，实时PCR产生了可重复的结果。全部9次重复均产生了Cp值的相似的平均值，而标准偏差是统计学上低的(最大值±0.73)。
借助于“拟合点”法的评测也获得了可重复的结果，为10fg/μl的恒定的灵敏度。
为了检查TaqMan实时PCR的可定量性(quantifiability)并说明经计算的MAP DNA浓度与已知的MAP DNA浓度的一致性(agreement)，而计算所述浓度并在表3中对其进行比较。同时使用“二次最大导数”法和“拟合点”法来计算DAN浓度。在后者中，“噪声频带”(“noise band”)手动设定在6.00并且“阈值”(“treshold”)为3.00。
表3：以9次重复(运行3x 3)为基础，通过TaqMan实时PCR在log10稀释阶段(log10dilution stages)定量来自于培养物的MAP DNA。由“二次最大导数”法和“拟合点”法来评测。
已知的DNA浓度与经计算的浓度的相似值表明了借由TaqMan实时PCR进行的MAPDNA的基本可定量性。即使在由“拟合点”法(“噪声频带”6.00；“阈值”3.00)来评测MAP DNA稀释系列的反应制剂时，灵敏度仍旧保持不变并且所计算出的DNA浓度结果不会被篡改(falsified)。
当从粪便或组织中提取DNA时，在野外环境下PCR的稳定性或灵敏度会受到影响。借由质粒DNA稀释系列(1ng/μl至1fg/μl)排除了可能的抑制作用，所述稀释系列已利用来自阴性粪便的DNA处理过(图8)。
即使当提交含来自于MAP阴性粪便的DNA的质粒DNA的稀释系列的反应制剂时，灵敏度仍旧保持不变并且结果不会被篡改。为了说明经计算的MAP DNA浓度与已知的MAP DNA浓度的一致性，计算所述浓度并在表4中对其进行比较。
表4：经计算的浓度和通过TaqMan实时PCR在log10的稀释阶段(1ng/μl至1fg/μl)所发现的质粒DNA的Cp值
尽管混合了来自MAP阴性粪便的DNA，未辨别出值的显著变化。已知的DNA浓度与经计算的DNA浓度的相似值表明了在不考虑基质粪便(matrix feces)的情况下，用于定量MAPDNA的TaqMan实时PCR的基本可用性。
对于实时PCR在常规诊断和研究方面的广泛的适用性来说，必须保证不同基质中的MAP DNA的检测。为了支持它的普及应用，在LightCyclerTM480中对取自常规诊断存档的并且在“半巢式”PCR(“semi-nested”PCR)中已被检验为阳性的样品进行了两次检验。选择了粪便、乳汁、精液、血液、组织和环境样品(图9)。
在两次运行中所有基质中的MAP DNA均被可靠地检测。两次运行的Cp值和平均值以及标准偏差显示于表5中。
表5：使用TaqMan探针在LightCyclerTM 480中所发现的针对不同基质的Cp值
所检测的粪便、乳汁、精液、血液、组织和环境样品均给出了清楚的荧光信号，其具有在25.07至33.53之间的Cp值。所述结果是可重复的，其具有0.02-0.98的标准偏差。
为了使用检测反刍动物的副结核病的实时PCR，可以使用用于扩增的对照系统(例如HEX通道)或用于提取的对照系统(例如Cy5通道)，所述对照系统通过其它标签或标记可被独立地检测到。同时，例如通过靶向β肌动蛋白的扩增可以顺利地检测核酸的提取。其它的用于扩增或提取的对照系统是本领域技术人员已知的。
用于MAP TaqMan实时PCR的最终方案如下：
关于使用针对FAM通道(465-510nm)中的扩增和提取的对照系统的分析，从存档中提取的样品也给出了清楚的可重复的荧光信号，其具有在23.58至33.29之间的平均Cp值以及0.02至0.98的标准偏差。
使用13只MAP检验呈阳性的牛来评估所描述的检验。为此，从粪便样品中提取DNA并使用所述的实时PCR来进行MAP检验。这种情况下，发现该检验能够检测粪便样品中的MAP。
最终，为了确认稳健性(robustness)，对来自于两头奶牛的不同肠道区域的器官样品进行了测试。由以下表格可以看出，本发明的测试适用于MAP的检测。
表7：用于检测组织样品中的MAP的IS900TaqMan实时PCR的定量使用，所述组织样品来自于患有副结核病的两头奶牛。经三次测量的FAM通道(465-510nm)的Cp值如下：
所有样品示出了FAM通道中的扩增曲线，其具有在24.53至34.33之间的Cp值以及0.03至0.69的标准偏差
如上所述，为进行定量评估，计算每克组织的DNA浓度和MAP基因组单元(表8)并将其以图的形式呈现(图10)。
表8：用于检测组织样品中MAP的IS900TaqMan实时PCR的定量使用，所述组织样品来自于患有副结核病的两头奶牛。为了定量组织中的MAP，计算每克组织的DNA浓度和基因组单元的数量。
在验证研究中，在与此处所述的实时PCR进行比较的情况下，对市售的MAP PCR试剂盒Adiavet(Adiavet ParaTM Realtime)、AB-TaqMan(Applied Biosystems公司的Taq-ManMAP)和Vetmax(Applied Biosystems公司的VetMax MAP实时PCR筛选试剂盒)以及在Bull等人(Tim J.Bull等人,2007,Plos One 2007(11),e1229)中公开的PCR分析法进行了检验。使用市售的试剂盒时，根据制造商的说明来执行。半巢式PCR(snPCR)被用作参照(Münster P.等人,Vet Microbiol.2011:154(1-2):197-201)。检测1个基因组单元时，它具有最高的灵敏度并且在灵敏度方面优于所有的“实时”方法。然而，本领域的一般情况是，这样的snPCR因高通量时极高的污染风险而并不适用于常规的应用。
在Roche LightCycler 480中运行所述PCR。在传统的热循环仪(Thermocycler)(Biometra“Trio”)中以标准的方式运行snPCR。
可利用14个由半巢式PCR测试为阴性的粪便样品和35个常规诊断为阳性的样品(n＝49)作为检验样品。
表9总结了检验为阳性的粪便样品的检验结果。对两次检验的Cp值求平均值。如果仅有一次检验的结果是可用的，那么就将其用于进一步的分析。表9中的验证示出了Cp值之间的差。首先，针对所有市售的对比PCR测试TaqMan实时PCR。为此，从相关的“TaqMan PCR样品的Cp值”中减去各自对应的“对比PCR样品Cp值”。相关列中的正数值表明TaqMan PCR Cp值高于被减去的对比值。因此，在灵敏度方面PCR比对比PCR更差，因为根据定义Cp值越低，灵敏度则越高。类似地，在TaqMan PCR和Bull等人公布的PCR之间进行了比较，其中TaqMan实时PCR中的最终体积(end volume)与Bull等人中所述的PCR相匹配(每个50μl而非20μl)。
由比较研究得出的结论是，新开发的PCR优于所有的对比PCR。[传统版的TaqMan实时PCR Plus(5μl模板)击败了所有的对比PCR。其还优于其本身的使用8μl模板的修改版]。
表9：验证研究的结果
上述比较清楚地表明了利用根据本发明的引物的根据本发明的方法在灵敏度方面优于现有技术中的方法和市售的检验试剂盒。
附图简述
图1示出了所使用的引物和针对IS 900的专利的图式。
图2示出了使用非分枝杆菌菌种情况下引物(MAP523-542f/Map661-642r)的特异性的说明。为此，通过凝胶电泳(1.5％琼脂糖凝胶)来分离经扩增的PCR产物。
图3示出了以参照菌株(n＝14)为基础，在LightCyclerTM 480上进行的TaqMan实时PCR的特异性检测。
图4示出了使用其它分枝杆菌菌种情况下引物(MAP523-542f/Map661-642r)的特异性的说明。为此，通过凝胶电泳((1.5％琼脂糖凝胶)来分离经扩增的PCR产物。
图5示出了以ATCC 19698MAP DNA为基础的实时PCR的特异性检测，其中A:1ng/μl、B:100pg/μl、C:10pg/μl、D:1pg/μl、E:100fg/μl、F:10fg/μl、G:1fg/μl、NTC:无菌水。
图6示出了以9个重复(3x 3运行)为基础的TaqMan实时PCR的可重复性(效率＝1.97±0.08；误差＝0.04±0.02)，其中通过“二次最大导数”法来进行评测。
图7示出了以9个重复(3x 3运行)为基础的TaqMan实时PCR的可重复性(效率＝2.07±0.09；误差＝0.18±0.03)，其中通过“拟合点”法来进行评测。
图8示出了使用TaqMan探针的LightCyclerTM 480中的与H2O混合的(A)和与粪便混合的(B)质粒DNA稀释系列(1ng/μl至1fg/μl)的扩增曲线的图式，其中从左到右的曲线为：1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、无菌水(NTC)。
图9示出了使用TaqMan探针在LightCyclerTM 480上检测来自不同基质的MAP DNA的扩增曲线的图式。
图10示出了用于在组织样品中检测MAP的IS900TaqMan实时PCR的定量使用。比较了动物A和动物B。柱状图代表各组织中计算的MAP浓度的平均值和标准偏差(3次重复)。

Claims (13)

1.分别如Seq.ID No.1、Seq.ID No.2和Seq.ID No.3中所示的寡核苷酸在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于在来自个体的样品中特异性检测鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌，其中所述检测包括步骤：
-通过核酸扩增在来自个体的样品中检测鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌基因组的IS900域，其中通过实时PCR和使用分别如Seq.ID No.1、Seq.ID No.2和Seq.ID No.3中所示的寡核苷酸来实现所述扩增，
其中，所述扩增的实现表明在所述个体中存在鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌。
2.权利要求1所述的用途，其中所述试剂盒还用于在来自个体的样品中定量鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌。
3.权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述样品为粪便、乳汁、血液、精液、组织、器官和环境样品中的一种。
4.权利要求1或2的用途，其特征在于，所述样品来源于反刍动物，或来源于人类。
5.权利要求4的用途，其特征在于所述反刍动物是牛、绵羊和山羊。
6.用于通过实时PCR在样品中特异性检测鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的检验试剂盒，其特征在于，所述检验试剂盒包括用于扩增所述鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌IS900域的寡核苷酸，所述寡核苷酸为分别如Seq.ID No.1、Seq.ID No.2和Seq.ID No.3中所示的寡核苷酸。
7.权利要求6所述的检验试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的装置。
8.权利要求7所述的检验试剂盒，其中所述样品选自粪便、乳汁、血液、精液、器官、组织和环境样品中的一种。
9.权利要求6-8中任一项所述的检验试剂盒，其特征在于，所述检验试剂盒还包括用于实施实时PCR的装置。
10.权利要求6-9中任一项所述的检验试剂盒在制备组合物中的用途，所述组合物用于在个体中的样品中特异性检测来自鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的IS900。
11.权利要求10的用途，其中所述样品选自粪便、乳汁、血液、精液、组织、器官和环境样品中的一种。
12.用于在来自个体的样品中特异性检测鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸是分别如Seq.ID No.1、Seq.ID No.2和Seq.ID No.3中所示的寡核苷酸。
13.根据权利要求12的寡核苷酸，其还用于在来自个体的样品中定量鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌。
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