CZ301112B6

CZ301112B6 - Zpusob detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis polymerázovou retezovou reakcí v reálném case

Info

Publication number: CZ301112B6
Application number: CZ20070295A
Authority: CZ
Inventors: Slaná@Iva; Králík@Petr; Pavlík@Ivo
Original assignee: Výzkumný ústav veterinárního lékarství, v.v.i.
Priority date: 2007-04-23
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2009-11-11
Also published as: EP2009118B1; PL2009118T3; EP2009118A2; CZ2007295A3; DK2009118T3; EP2009118A3; PT2009118E; ES2393016T3

Abstract

Rešení se týká zpusobu detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) duplexní kompetitivní polymerázovou retezovou reakcí (PCR) v reálném case s interní amplifikacní kontrolou, které je charakterizováno tím, že se detekce a kvantifikace MAP ve vzorcích živocišného a rostlinného puvodu provádí primery a hydrolyzacními sondami, které amplifikují dva lokusy specifické pro MAP, tedy IS900 a F57, o následujícím složení primeru pro F57 F57qPCRF GCCCATTTCATCGATACCC F57qPCRR GTACCGAATGTTGTTGTTGTCAC, sondy pro F57 F57qPCRTM FAM-CAATTCTCAGCTGCAACTCGAACACAC-BHQ, primeru pro IS900 IS900qPCRF GATGGCCGAAGGAGATTG IS900qPCRR CACAACCACCTCCGTAACC, sondy pro IS900 IS900qPCRTM FAM-ATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGT-BHQ, pricemž sonda pro interní amplifikacní kontrolu má složení IACqPCRTM Cy5-GGCTCTTCTATGTTCTGACCTTGTTGGA-BHQ.

Description

Způsob detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis polymerázovou řetězovou reakcí v reálném Čase

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) polymerázovou řetězovou reakcí v reálném Čase (reál time PCR). Konkrétně se jedná o dva nezávislé reál time PCR systémy, které detekují dva pro MAP specifické lokusy IS900 a F57.

Dosavadní stav techniky

MAP je intracelulámě parazitující bakterie, která je původcem chronického zánětlivého onemocnění střev přežvýkavců zvaným paratuberkulóza nebo také Johneho choroba. Infikovaná zvířata trpí chronickým průjmem a postupným hubnutím. Charakteristickým projevem paratuberkulózy přežvýkavců je dlouhá inkubační doba a velká individuální variabilita v předklinické a klinické fázi rozvoje onemocnění (Ayele et al., 2001).

MAP je u přežvýkavců vylučováno především v trusu, ve spermatu a v mléce. A právě přítomnost MAP v mléče a v mléčných výrobcích, které mohou být možným mediátorem přenosu MAP na člověka, je významná z hlediska bezpečnosti potravin (Grant, 2006). Mykobakterie jsou relativně odolné vůči teplotě a byly kultivačně prokázány v mléce pasterovaném při 71 až 72 °C (Ayele etal., 2005).

MAP je považováno za jednoho z možných původců Crohnovy choroby u lidí, které se rovněž manifestuje zánětlivým onemocněním střevního traktu (Chamberlin et al., 2001; Bull et al., 2003). Přesná etiologie tohoto onemocnění není známa, ale v současné době je akceptován model autoimunitního onemocnění. Tento model nepředpokládá přítomnost živých MAP v těle pacienta. Toto je možný důvod, proč u řady pacientů s Crohnovou chorobou nebylo kultivačně MAP zachyceno, ale byly prokázány jen níže uvedené specifické lokusy (Baksh et al., 2004). Nejvíce rizikovou skupinou jsou v tomto ohledu děti a irnunokompromitovaní jedinci (Chamberlin et al., 2001; Hruška et al., 2005).

Diagnostika MAP infekcí se v dnešní době provádí řadou mikrobiologických, imunologických i molekulárně biologických metod. Za „zlatý standard“ přímého průkazu původce paratuberkulózy je v současné době považováno kultivační vyšetření. Nevýhodou této relativně spolehlivé metody je dlouhá doba růstu MAP in vitro (minimálně 2 až 3 měsíce). Nepřímé sérologické metody, které jsou založeny na průkazu protilátek proti původci paratuberkulózy především v krvi, jsou specifické a málo senzitivní (Lombard et al., 2006). Často se vyskytují buď falešně negativní výsledky a nebo křížově reagují s protilátkami geneticky příbuzných mykobakterií z prostředí. Tyto výsledky vyžadují ověření přímým průkazem MAP.

Z molekulárně biologických metod se v dnešní době pro přímý průkaz původce paratuberkulózy používá řada systémů založených na konvenční nebo „nested PCR“. Nejčastěji se k detekci používají dva lokusy specifické pro MAP. InzerČní sekvence IS000 (XI6293; Green et al., 1989) se v genomu MAP vyskytuje v 12 až 18 kopiích (Bull et al., 2000) a je považován za „zlatý standard“ v detekci MAP pomocí PCR. Genetický element F57 (X70277) je v genomu MAP přítomen pouze v jedné kopii (Poupart et al., 1993). Nicméně je nutné potvrzení výsledků dosažených PCR, zejména pokud jsou využívány v rutinní diagnostice. Toto většinou představuje použití hybridizace nukleových kyselin se specifickou sondou, což ovšem činí celý proces náročnější a použitelný pouze pro výzkumnou činnost.

-1CZ 301112 B6

V poslední době se používá pro detekci a případnou kvantifikaci MAP v biologickém materiálu metoda reál time PCR (Kim et al., 2002; OMahony a Hill, 2002). Je založena na vizualizaci vznikajících PCR produktů pomocí fluorescenčních barviv. Její výhodou je vysoká specifita a senzitivita. V dosud námi známé publikované literatuře se používají dvě strategie fluorescenčního značení: (1) Využití inkorporace dsDNA specifického fluorescenčního barviva SYBR Green do nově vznikajících PCR produktů nebo (2) využití krátkých oligonukleotidů (hybridizačních sond), které jsou značeny fluorescenčními barvivý a leží v oblasti amplifikované primery. Tím zajišťují v reál time PCR, kromě primeru, tzv. „druhou specifitu“.

První přístup umožňuje určit přítomnost MAP v analyzovaném materiálu a určit specifitu PCR produktu pouze podle délky PCR produktu na základě denaturační křivky. Ovšem toto stanovení specifíty není sekvenčně specifické a závisí především na procentuálním zastoupení jednotlivých nukleotidů ve výsledném PCR produktu. (OTvlahony a Hill, 2002; Ravva a Stanker, 2005). Pro ověření sekvenční specifíty je tedy nutné použít dodatečnou hybridizací, kterou není možné při použití tohoto systému aplikovat interní amplifikační kontrolu (IAC). Použití IAC je dnes nutné především pro diagnostické účely, protože představuje jediný nástroj, jak odlišit falešně negativní vzorky od skutečně negativních. Druhý přístup, za předpokladu, že sekvence amplifikovaného úseku je jedinečná pro MAP, umožňuje provádět kvalitativní i kvantitativní analýzu bez nutnosti dalšího ověřování specifíty.

Nejčastěji používanými typy sond pro detekci AÍTPjsou: (1) hydrolyzační sondy nebo (2) FRET (Fluorescence resonance energy transfer) sondy.

Při použití hydrolyzačních sond dochází při amplifikací k rozštěpení sondy exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy, čímž je uvolněn fluorofor. Jejich výhodou je, že jsou použitelné na jakémkoli z dostupných reál time PCR přístrojů. Naproti tomu FRET sondy jsou založeny na současné hybridizací dvou sond, z nichž jedna nese fluorofor ve svém 3^f konci (donor) a druhá je značena na 5' konci jiným fluoroforem (akceptor). Emise energie donoru je zachycena akceptorem, jehož vlnová délka je měřena. Použití FRET sond je omezeno pouze na přístroje of rimy Roche (OMahony a Hill, 2004; Tasara a Stephan, 2005). Využití jakýchkoli sond také umožňuje v jedné reál time PCR reakci koamplifikaci IAC, která je značena jiným fluoroforem než sonda pro cílovou sekvenci (Rodriguez-Lazaro et. al,, 2005; Brey et al., 2006).

Podstata vynálezu

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s interní amplifikační kontrolou, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se detekce a kvantifikace MAP ve vzorcích živočišného a rostlinného původu provádí primery a hydrolyzačními sondami, které amplifikují dva lokusy specifické proA£4P, tedy [S900 aF57,o následujícím složení příměrů pro F57

F57qPCRF

F57qPCRR

GCCCATTTCATCGATACCC

GTACCGAATGTTGTTGTCAC, sondy pro F5 7

F57qPCRTM

FAM - CAATTCTCAGCTGCAACTCGAACACAC - BHQ,

GATGGCCGAAGGAGATTG

CACAACCACCTCCGTAACC,

FAM - ATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGT - BHQ, primerů pro IS900

IS900qPCRF

IS900qPCRR sondy pro 1S900

IS900qPCRTM přičemž sonda pro interní amplifikační kontrolu má složení lACqPCRTM Cy5 - GGCTCTTCTATGTTCTGACCTTGTTGGA - BHQ.

Způsob podle vynálezu je dále charakterizován tím, že se stanovení MAP provádí ve vzorcích jakéhokoli živočišného původu, zejména pocházejících z hospodářských zvířat a v klinických vzorcích pocházejících z humánních pacientů, ve vzorcích rostlinného původu, ve vzorcích prostředí, zejména z hnojiv, prachu, sena, ve vzorcích pocházejících z archeologických nálezů a ve vzorcích potravin a krmiv.

Dále je vynález vyznačen plazmidovými konstrukty, které vznikají při použití primerů a sond podle vynálezu.

Detekční soupravy pro detekci a diagnostiku MAP způsobem podle vynálezu jsou též podstatou vynálezu ajsou charakterizovány tím, že obsahují jeden nebo více oligonukleotidů nebo plazmidových konstruktů, které se používají nebo vznikají pri způsobu podle vynálezu.

Způsob podle vynálezu se týká dvou nezávislých reál time PCR systémů pro detekci a kvantifikaci MAP v biologickém materiálu. Jejich podstata spočívá v amplifikaci lokusů specifických pro MAP. První je založen na amplifikaci inzerční sekvence IS900 a druhý na amplifikaci genetického elementu F57. Každý vzorek je analyzován oběma systémy. Výhodou tohoto uspořádání je, že pozitivita každého vzorku je ověřena dvěma nezávislými reakcemi, čímž se vylučuje riziko případné falešné pozitivity. ISP00 reál time PCR je více senzitivnější, ovšem nedovoluje přesné stanovení množství MAP v analyzovaném vzorku. Naproti tomu, genetický element F57je v genomu MAP přítomen pouze v jedné kopii a je proto vhodný pro přesnou kvantifikaci MAP buněk ve vzorku.

Oba reál time PCR systémy jsou založeny na použití hydrolyzačních sond značených FAM (6karboxyfiuorescein) a je tedy možné je použít na všech dostupných reál time PCR přístrojích bez nutnosti dalšího ověřování specifity.

Každý z obou systémů obsahuje vlastní plazmidovou IAC, která je založena na kompetitivní PCR (sekvence primerů pro cílovou sekvenci IS900 nebo F57 jsou identické s příslušnou IAC). Použití pouze jedné sady primerů k amplifikaci dvou PCR produktů v jedné reál time PCR reakci snižuje riziko vzniku nespecifických PCR produktů a tím i snížení efektivity PCR v analyzovaných reálných vzorcích. Vnitřní sekvence obou IAC je identická, což umožňuje používat v obou PCR systémech pouze jednu sondu pro IAC značenou Cy5. Použití pouze jedné sady primerů pro každou reál time PCR reakci a jedné sondy pro IAC snižuje celkově finanční náklady na chemikálie potřebné k analýze.

Protokol pro analýzu je v obou reál time PCR systémech shodný. To je výhodné při zpracování menšího množství vzorků. V jednom experimentu mohou být totiž souběžně analyzovány tytéž vzorky oběma reál time PCR systémy, čímž dochází k významné úspoře finančních nákladů a času potřebných k jedné analýze.

-j

Standardy pro oba reál time PCR systémy byly připraveny nakloňováním PCR produktů pro IS900 a F57 do plazmidového vektoru. Izolovaná plazmidová DNA byla naředěna v rozsahu od 1 * 10⁵ do 1x10° kopií plazmidu na 1 μΙ na reakci. Příslušná ředicí řada byla amplifikována v každém experimentu. Sloužila jednakjako pozitivní kontrola amplifikace a jednakjako zdroj dat pro konstrukci kalibrační křivky a tím i k určení efektivity PCR plazmidového gradientu vypočtené podle regresní rovnice křivky. Kalibrační křivka sloužila k přesné kvantifikaci MAP v neznámých vzorcích.

V článku Herthnek, D. and Bolske, G., New PCR systems to confirm real-time PCR detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. BMC Microbiology, 2006, 6 (1), 87, se sice pojednává o vývoji reál time PCR systémů založených na amplifikaci sekvencí IS900 a F57 ajejich současném zapojení při detekci Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis v trusu, ovšem ve způsobu podle vynálezu jsou použity jiné sady primerů a sond pro amplifikaci reál time PCR a tyto primery a sondy jsou nárokovanou podstatou vynálezu. Primery a sondy podle vynálezu jsou umístěny v jiné oblasti sekvencí IS900 a F57. Navíc má způsob podle vynálezu další výhody, které nejsou v uvedené publikaci zahrnuty (interní amplifikační kontrola, možnost kvantifikace a důkladná optimalizace specificity a sensitivity).

Způsob podle vynálezu, založený na amplifikaci dvou lokusů specifických pro MAP pomocí reál time PCR, je optimalizovaný pro rutinní diagnostiku MAP z různých typů biologického materiálu. Hlavními výhodami je univerzálnost (možnost aplikace v různých laboratořích a na různých přístrojích bez nutnosti další optimalizace), časová nenáročnost a nízké náklady kombinované s vysokou specifitou, citlivostí a reprodukovatelností.

Obecně lze shrnout, že způsob podle vynálezu se týká molekulární detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) pomocí metody reál time PCR, která je založena dvou nezávislých reál time PCR reakcích amplifíkujících dva nezávislé lokusy v genomu MAP: ÍS900 a F57. Oba reál time PCR systémy jsou založeny na strategii hybridizačních sond a každý obsahuje svou vlastní plazmidovou interní amplifikační kontrolu na bázi kompetitivní PCR. Kvantifikace se provádí na základě gradientu plazmidů s nakloňovanými PCR produkty.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoli omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

Provedení způsobu podle vynálezu se skládá z několika kroků:

DNA materiál. K ověření spécifity vyvinutých reál time PCR systémů byly použity DNA templáty ze 17 bakteriálních a 4 savčích druhů (Tabulka 1).

K ověření izolace DNA a vyvinutých reál time PCR systémů byly použity vzorky mléka od 71 krav ze stáda infikovaného paratuberkulózou. Zdojky od každé krávy (první 3 až 4 odstřiky z každého ze čtyř struků, které se vylévají) byly odebrány do jednoho 200 ml jednorázového sterilního plastového kontejneru. V chladicím boxu byly zdojky transportovány do laboratoře, kde byly uchovány při teplotě 4 °C a do 3 dnů zpracovány. Z každého odběru byly zpracovány 2 na sobě nezávislé vzorky: jeden byl použit na izolaci DNA a druhý sloužil jako záloha pro případ selhání izolace DNA nebo reál time PCR.

Návrh primeru a sond. Primery a sondy pro inzerční sekvenci IS900 (X16293) a fragment F57 (X70277) byly navrženy programem Primer 3: http://frodo.wo.mit.edu/cgi- bin/primer3/primer3_www.cgi, (Tabulka 2).

Příprava plazmidových standardů. Na přípravu plazmidových standardů pro IS900 a F57 reál time PCR, byly PCR produkty IS900 a F57 amplifikovány konvenční PCR za použití HotStar PCR Master Mix Kit (Qiagen, Hilden, Německo), 10 pmol primerú IS900qPCRF a IS900qPCRR nebo F57qPCRF a F57qPCRR a 2 μΐ lyžované MAP suspenze (sbírkový kmen CAPM 6381; Sbírka zvířecích patogenních mikroorganismů - Collection of Animal Pathogenic Microorganisms, Bmo; http://www.vri.cz/labs/patogen/default.htm) v celkovém objemu 20 μί. PCR amplifikace probíhala za následujících podmínek: úvodní denaturace 95 °C po dobu 15 min, následovaná 30 cykly denaturace při 95 °C po dobu 20 s, annealing při 60 °C po dobu 30 s, extenze při 72 °C po dobu 1 min a závěrečná extenze při 75 °C po dobu 5 min. Bez další purifikace byly získané PCR produkty nakloňovány do vektoru pCR 2.1 (Invitogen, Carlsbad, USA) podle návodu výrobce,

Plazmidy obsahující inzerty IS900 (Tuor) a F57 (Beren) byly purifíkovány kítem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Německo), eluovány do 200 μί TE pufru (Amresco, Inc, Solon, USA) a sekvenovány pro potvrzení správnosti sekvence inzertu. Přesná koncentrace plazmidové DNA a čistota byly stanoveny vtrilikátech na spektrofotometru BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg, Německo). Pro následnou práci s plazmidovou DNA byla použita průměrná hodnota koncentrace. Soutěžně s tím byla kvalita plazmidové DNA vizuálně kontrolována pomocí agarózové elektroforézy. Pro zvýšení stability plazmidů v TE pufru během skladování při -20 ^ŮC a snížení jejich ztrát při následných manipulacích bylo přidáno 10 pg DNA z rybích spermií (Serva, Heidelberg, Německo). Výsledná koncentrace DNA z rybích spermií byla 50 ng/μΙ,

Příprava interních amplifíkačních kontrol. IAC pro IS900 a F57 reál time PCR jsou založeny na principu kompetitivní PCR. IS900 a F'57 „forward“ a „reverse“ primery byly na 3' konci fúzovány s krátkými oligonukleotidy (TGTTAGAGAGG a ACTCTAAACCCAA) pocházejícími z genu StTSl {Solanum tuberosum Threhalose synthethase 1; AF483209) brambory. Oba PCR produkty byly připraveny podle výše zmíněného PCR protokolu z DNA brambory stím, že „annealingová“ teplota byla snížena na 50 °C. Následně byly zpracovány stejně jako plazmidové standardy pro IS900 a F57. Plazmidy IAC pro IS900 (Idril) a F57 (Luthien) byly skladovány v TE pufru (Amresco, Solon, USA) při -20 °C do dalšího použití.

Duplexní IS900 a F57 reál time PCR. Podmínky pro reál time PCR IS900 a F57 byly optimalizovány, dokud nebyla stanovena optimální koncentrace příměrů a sond, koncentrace IAC, koncentrace MgCl2 a podmínky PCR protokolu. Optimalizovaná PCR reakční směs pro oba reál time PCR systémy se skládala z lxDyNAmo Probe qPCR Kit (Finnzyme, Espoo, Finsko), 10 pmol primerů IS900qPCRF a IS900qPCRR nebo F57qPCRF a F57qPCRR (finální koncentrace 0,5 μΜ), 1 pmol sond IS900qPCRTM nebo F57qPCRTM značených FAM (finální koncentrace 0,05 μΜ), 4 pmol sondy pro IAC IACqPCRTM značenou Cy5 (finální koncentrace 0,2 μΜ), 0,2 U Uráčil DNA Glykozyláza (Sigma, St. Louis, USA), 50 kopií plazmidů Luthien nebo Idril a 5 μί DNA templátu v celkovém objemu 20 μΙ.

Amplifikace a detekce fluorescence, která byla shodná pro oba reál time PCR systémy, probíhala na přístroji LightCycler 480 Instrument (Roche Molecular Diagnostic, Německo) v 96-jamkových PCR destičkách za následujících podmínek: 37 °C po dobu 10 min, následovala počáteční denaturace při 95 °C po dobu 15 min a 47 cyklů při 95 °C po dobu 5 s a 60 °C po dobu 40 s (snímání fluorescence). Následná analýza probíhala za použití „Fit point analýzy“ v softwaru pro LightCycler 480 (verze 1.2.0.0625).

Specifita IS900 a F57 reál time PCR. K ověření specifity navržených primerů a sond pro ÍS900 aF57 reál time PCR byly provedeny reál time PCR experimenty s lyžovanými bakteriálními suspenzemi a DNA izolované z periferní krve vybraných savců (Tabulka 1). Jedna bakteriální

kolonie byla resuspendována ve 20 μί destilované vody a denaturována na horkém bloku při

100 °C po dobu 20 min. Následně byla vzniklá suspenze centrifugována při 14 000 g po dobu min a supematant sloužil jako DNA templát pro reál time PCR experimenty. Savčí DNA byla izolována z periferní krve za QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) podle doporučení výrobce.

Citlivost a reprodukovatelnost IS900 a F57 reál time PCR. Citlivost reál time PCR systémů IS900 a F57 byla stanovena desítkovými ředěními plazmidů Tuor a Beren. Oba ptazmidové gradienty byly naředěny v rozsahu 10⁵ až 10° kopií/μΙ. Ředění probíhalo v TE pufru (Amresco, lne, Solon, USA) obsahujícím 50 ng/μΙ DNA z rybích spermií (Serva, Heidelberg, Německo) a 10 kopiemi/μΙ plazmidů Luthien a Idril. Připravené plazmidové gradienty sloužily pro kvantitativní stanovení nebo analýzu jako pozitivní kontrola v reál time PCR a pro výpočet efektivity amplifikace plazmidového gradientu v aktuálním PCR experimentu. Z těchto důvodů byl příslušný plazmidový gradient amplifikován v každém reál time PCR experimentu. Reprodukovatelnost byla stanovena z 20 nezávislých opakování s čerstvě připravenými ředěními plazmidového gradientu.

Izolace celkové DNA z mléka. Výchozí množství 50 ml čerstvého mléka bylo centrifugováno při 4211 g (RCF) po dobu 45 min na centrifuze Hermle Z 383 K (Hermle, Gosheim, Německo). Většina supematantu a smetany byla odstraněna. Pelet byl resuspendován ve zbytku supematantu a přenesen do nové 2 ml zkumavky. Následně byly tyto vzorky centrifugovány při 14 000 g (RCF) po dobu 10 min. Objem v každé zkumavce byl upraven na 400 μί. Takto „předzpracované vzorky byly skladovány při -80 °C, dokud nebyly použity. Celková DNA z mléka byla izolována pomocí modifikovaného protokolu z kitu QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo). Po 5 min inkubace byla DNA eluována do 50 μί předehřátého TE pufru (Amresco, lne, Solon, USA). Eluce byla provedena dvakrát. Výsledkem izolace DNA byla 100 μί celkové DNA z mléka v TE pufru s přídavkem „carrier“ DNA z rybích spermií v koncentrací 50 ng/μΙ. Podle parametrů procedury izolace DNA byl přepočet množství MAP buněk na 1 ml výchozího množství mléka proveden následovně: počet kopí F57 získaných z reál time PCR děleno 2 = počet MAP buněk v 1 ml výchozího množství mléka. V případě IS900 reál time PCR byl výpočet totožný s tím, že získané číslo bylo ještě vyděleno osmnácti (1 MAP buňka obsahuje maximálně 18 kopií IS900; Bull et al., 2000).

Opatření k zamezení křížové kontaminace. Vzhledem k tomu, že metodika reál time PCR je vysoce citlivá, bylo nutno dodržovat striktní pravidla pro zamezení křížové kontaminace. Izolace DNA, příprava mixů na reál time PCR a přídavek DNA templátu byly prováděny v oddělených místnostech s přetlakem vzduchu. Všechny nástroje a pipety byly před použitím omyty přípravkem DNA-Exitus (AppliChem, Darmstadt, Německo). Při práci byly použity pouze špičky s filtrem. V každém běhu izolace DNA je zahrnuta i negativní kontrola izolace (voda), která umožňuje monitorování možné kontaminace použitých chemikálií a plastů. Kontaminace chemikálií a plastů pro reál time PCR byla kontrolována pomocí negativní PCR kontroly (voda místo DNA templátu), která byla obsažena v každém reál time PCR experimenty.

Statistická analýza. Hodnoty „Crossing pointů“ získané z IS900 a F57 reál time PCR byty přepočteny na skutečné množství kopií podle příslušné kalibrační křivky. Přepočtené hodnoty z gradientů plazmidů Tuor a Beren byly dány do skupin a srovnány mezi sebou pomocí programu InStat (GraphPad, San Diego, USA). Soubory dat byly testovány na normalitu rozložení pomocí testu variability Kolmogorovým a Smimovovým testem a varianci pomocí T-testu. Rozdíly s P < 0,05 byly považovány za statisticky významné. K měření preciznosti izolace DNA a následné reál time PCR byl spočítán i koeficient variability (CV). Pro ilustraci rozptylu jednotlivých přepočtených hodnot byl určen i 95% interval spolehlivosti.

Výsledky

Optimalizace IS900 a F57 reál time PCR. Optimální množství kopií plazmidů Luthien nebo Idril, které zaručuje optimální koamplifikaci s cílovou sekvencí, bylo stanoveno titrací 5 χ 10³,5 ^x 10²5 ^x 10' a 5^χ10° kopie každé IAC na PCR reakci a příslušného plazmidového gradientu. Výsledky byly stejné pro oba reál time PCR systémy. Bylo zjištěno, že 5 χ 10¹ kopií plazmidu Idril nebo Luthien na reakci (hodnoty „Crossing point“ mezi 35 a 36) neovlivňují amplifikací příslušného plazmidového gradientu ani v nejnižších koncentracích a poskytují dostatečně silný signál, který je odlišitelný od pozadí.

V dalším kroku byl sledován vliv přítomnosti nespecifické DNA z rybích spermií v templátu na amplifikací cílové molekuly během reál time PCR. Plazmidy Idril a Luthien (10 kopií/μΙ) byly naředěny v TE pufru s 0, 10, 30, 50, 70, 90, 100 a 200 ng/μΙ DNA z rybích spermií a sloužily jako rozpouštědlo pro přípravu plazmidových gradientů Tuor a Beren. Takto připravené templáty byly analyzovány pomocí F57 nebo IS900 reál time PCR v triplikátech.

Hodnoty „Crossing pointů“ obou gradientů nebyly ovlivněny ani přítomností 100 ng/μΙ (500 ng na PCR reakci) nespecifické DNA. Koncentrace 200 ng/μΙ významně inhibovala oba reál time PCR systémy. Pro další experimenty byla použita koncentrace 50 ng/μΙ.

Specifita IS900 a F57 reál time PCR. Oba reál time PCR systémy byly testovány na schopnost selektivně rozlišit DNA MAP od jiných bakteriálních lyzátů a savčích DNA (Tabulka 1). Žádné bakteriální nebo savčí DNA kromě MAP nebyly amplifikovaný ani F57 ani IS900 reál time PCR a všechny negativní vzorky poskytly jasný signál pro ÍAC. Savčí druhy byly vybrány jako nejpravděpodobnější zdroje DNA pozadí pro vyvinuté reál time PCR systémy.

Citlivost IS900 a F57 reál time PCR. Oběma reál time PCR systémy je možno detekovat jednu kopii plazmidu Beren nebo Tuor na 1 μΐ (5 kopií na reakci) ve všech 20 opakováních (Tabulka 3, Obrázek 1). Srovnání přepočtených datových souborů pro F57 a ÍS900 T-testem neukázalo mezi nimi žádný statisticky významný rozdíl (P < 0,1).

Izolace DNA z terénních vzorků mléka. Oba vyvinuté reál time PCR systémy byly použity na detekci a kvantifikaci MAP ze 71 vzorků mléka ze stáda krav infikovaného paratuberkulózou (Tabulka 4). Shromážděné vzorky mléka byly označeny kódem a podrobeny izolaci DNA a analýze 1S900 a F57 reál time PCR. Vzorky, které byly slabě pozitivní na přítomnosti IS900 a negativní na přítomnost F57, byly považovány za pozitivní. Každý terénní vzorek byl analyzován v duplikátu a za pozitivní se považoval pouze v případě, že byly pozitivní oba duplikáty.

V ostatních případech byla zopakována izolace DNA a obě reál time PCR ze záložního vzorku.

Poměr mezi přepočteným množstvím kopií IS900 a F57 je patrný z Tabulky 4. Všechny vzorky se současně prokázanými IS900 a F57 reál time PCR měly vždy vyšší množství kopií IS900 než F57 a téměř ve všech vzorcích je zachován poměr 12 az 18:1. Všechny vzorky s pouze prokázanou IS900 neměly množství kopií vyšší než 50, což odpovídá přibližně 3 buňkám MAP.

Experimentální limit detekce MAP z mléka. Při přepočtu množství kopií získaných z reál time PCR na počáteční množství mléka byl určen experimentální limit detekce. Pro IS900 reál time PCR na 1 MAP na 2 ml mléka a pro F57 reál time PCR byl stanoven na 2 MAP buňky na 1 ml mléka. Je možno předpokládat, že ve skutečnosti není žádný detekční systém optimální. Během manipulace se vzorkem může navzdory všem opatřením dojít ke ztrátě cílových míst ať už fragmentací DNA během izolace nebo adhezi na plastový spotřební materiál. Proto by se mělo počítat s nižší pravděpodobností detekce v nízkých koncentracích. DNA extrahovaná z tak komplexního materiálu, kteiý je mléko, může obsahovat stopy inhibičních látek. Ty se neodrazí na amplifikací IAC, ale mohou inhibovat nízké koncentrace cílových míst (Herthnek a Bolske, 2006).

CZ 301112 Bó

Průmyslová využitelnost

Způsob detekce a kvantifikace MAP je určen především pro rutinní diagnostiku. Je navržen tak, aby bylo možno kvantifikovat MAP v jakémkoli biologickém materiálu. Nutným předpokladem jeho úspěšného použití je izolace vysoce kvalitní DNA z dané matrice. Vyvinuté reál time PCR systémy byly v praxi vyzkoušeny na vzorcích DNA izolované z mléka, které může být hlavním zdrojem přenosu MAP na člověka,

Uvedený způsob obsahuje metodiku reál time PCR s hydrolyzačními sondami a s IAC, která zahrnuje složení PCR mixu a podílu jednotlivých složek, protokol PCR, analýzu výsledků a stanovení množství MAP ve vzorku,

LITERATURA

Ayele, W. Y., Machackova, M., Pavlík, I. (2001): The transmission and impact of paratuberculosis infection in domestic and wild ruminants. Veterinární Medicína, 46, 205-224.

Ayele, W. Y., Svastova, P., Roubal, P., Bartoš, M., Pavlík, I, (2005): Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis cultured from locally and commercially pasteurized cow's milk in the Czech Republic. Appl. Environ. Microbiol., 71, 1210-1214.

Baksh, F. K., Finkelstein, S. D., riyanayagam-Baksh, S. M., Swalsky, P. A., Klein, E. C., Dunn, J. C. (2004): Absence of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in the microdissected granulomasofCrohn'sdisease. Modem Pathology, 17, 1289-1294.

Brey, B. J., Radcliff, R. P., Clark, D. L,, Jr., Ellingson, J. L. (2006): Design and development of an intemal control plasmid for the detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis using real-time PCR. Mol,. Cell Probes, 20, 51-59.

Bull, T. J., Hermon-Taylor, J. Pavlík, I., El Zaatari, F., Tizard, M. (2000): Characterization of IS900 loci in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and development of multiplex PCR typing. Microbiology, 146 (Pt 9), 2185-2197,

Bull, T. J., McMinn, E. J., Sidi-Boumedine, K., Skuli, A., Durkin, D., Neild, P,, Rhodes, G., Pickup, R., Hermon-Taylor, J. (2003): Detection and verification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in fresh ileocolonic mucosal biopsy specimens from individuals with and without Crohn's disease. J. Clin. Microbiol., 41, 2915-2923.

Chamberlin, W,, Graham, D. Y., Hulten, K., El Zimaity, Η. M., Schwartz, M. R., Naser, S., Shafran, I., El Zaatari, F, A. (2001): Review article: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis as one cause of Crohn's disease. Aliment. Pharmacol. Ther., 15, 337-346.

Grant, I, R. (2006): Mycobacterium avium ssp paratuberculosis in foods: current evidence and potential consequences, International Journal of Dairy Technology, 59,112-117.

Green, Ε. P., Tizard, M. L., Moss, Μ. T., Thompson, J., Winterboume, D. J., McFadden, J. J., Hermon-Taylor, J. (25-11-1989): Sequence and characteristics of IS900, an insertion element identified in a human Crohn's disease isolate of Mycobacterium paratuberculosis. Nucleic Acids Res., 17,9063-9073.

Herthnek, D., Bolske, G, (2006); New PCR Systems to confirm real-time PCR detection of

Mycobacterium avium subsp paratuberculosis. Bmc Microbiology, 6.

Hruška, K., Bartoš, M., Králík, P., Pavlík, I. (2005): Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in powdered infant milk: paratuberculosis in cattle - the public health problém to be solved.

Veterinární Medicína, 50, 327-335.

Kim, S. G., Shin, S. J., Jacobson, R. H., Miller, L. J., Harpending, P. R., Stehman, S. M., Rossiter, C. A., Lein, D. A. (2002): Development and application of quantitative polymerase Chain reaction assay based on the ABI7700 systém (TaqMan) for detection and quantification of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 14, 126-131.

Lombard, J. E., Byrem, Τ. M., Wagner, B. A., McCIuskey, B. J. (2006): Comparison of milk and sérum enzyme-linked immunosorbent assays for diagnosis of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection in dairy cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 18, 448-458.

OMahony, J., Hill, C. (2002): A reál time PCR assay for the detection and quantitation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis using SYBR Green and the Light Cycler. J. Microbiol. Methods, 51, 283-293.

OMahony, J., Hill, C. (2004): Rapid real-time PCR assay for detection and quantitation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis DNA in artificially contaminated milk. Appl. Environ. Microbiol., 70,4561-4568.

Poupart, P., Coene, M., Van Heuverswyn, H., Cocito, C. (1993): Preparation of a specific RNA probe for detection of Mycobacterium paratuberculosis and diagnosis of Johne's disease. J. Clin. Microbiol., 31, 1601-1605.

Ravva, S. V., Stanker, L. H. (2005): Real-time quantitative PCR detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and differentiation from other mycobacteria using SYBR Green and TaqMan assays. J. Microbiol. Methods, 63,305-317,

Rodriguez-Lazaro, D., D'Agostino, M., Herrewegh, A., Pia, M., Cook, N., Ikonomopoulos, J. (15-2005): Real-time PCR-based methods for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in water and milk. Int. J. Food Microbiol., 101,93-104.

Tasara, T., Stephan, R. (2005): Development of an F57 sequence-based real-time PCR assay for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk. Appl. Enviton. Microbiol., 71, 5957-5968.

Tabulka 1

Soupis bakteriálních a savčích druhů testovaných IS000 &F57 reál time PCR s příslušnou interní amplifíkační kontrolou.

Druh	Zdroj	IS9O0	F57
M. avium subsp. paratuberculosis	CAPM® 6381	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (medvěd), ČR	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (daněk), ČR	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (fekálie), ČR	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (mufloni ČR	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (skot), CR	+	+
M. avium subsp. avium	CAPM 5889		-
M. avium subsp. avium	terénní vzorek (králík), ČR		-
M. avium subsp. hominisuis	terénní vzorek (prase), ČR		-
M. avium subsp. hominisuis	klinický izolát (člověk), ČR		-
M. gordonae	ATCC® 12478		-
M. cansasii	ATCC 12478		-
M. scrofulaceum	ATCC 19981		-
M. s2ulgai	ATCC 35799		-
M. intraceilulare	CAPM 5827		-
Escherichia coli	kompetentní buňky (Invitrogen)		-
Salmonella enteríca serovar Typhimurium	CAPM 5438		-
Ovce (Ov7s aries)	terénní izolát DNA, ČR		-
Koza (Capra hircus)	terénní izolát DNA, ČR		-
Skot (Bos taurus)	terénní izolát DNA, ČR		-
Člověk (Homo sapiens sapiens)	klinický izolát, ČR		-

^a Sbírka zvířecích patogenních mikroorganismů (Collection of Animal Pathogenic Microorganisms) ^b Sbírka amerických kultur (The American Type Culture Collection) o

_c •Φ o > C o O -g

I

Q.

Έ m

Ό

C (0

O

ΙΕ φ

tú c

Φ r= íc £ Ό 3 — '<D

O □ a. o c

ffi »

ε

Ώ rt

Ť io c

Φ co to l·'T

CN

SX §N o σ> 3 33^ to

I I I

CM CO CO CM (O O M¹ io tn

T- O

I I

M“ oo Φ rt

CM to

Sekvence použitých primerů a sond

a.

ř

O c

•Φ ε

·>»

O φ

S Φ Ό C > C O Φ O LL £ co

Ό Φ i 8 co » © Ό C > C O Φ O LL· DC CO φ

Ό

C

O <0

X X P X X X ooo

XXX σ* cr cr

8S8

Λ O) co co co §

a co

	2	2
LL· X	H	H
X X	X	X
OO	ϋ	ϋ
X X	X	X
σ σ	cr	σ
h-	r*.	O
IO IO	IO
ll ll	X	s
k Ε		<

Všechny primery a sondy byly syntetizovány ve VBC Biotech (Vídeň, Rakousko) e

Oč

O

E5

XD >

’2 .2 0. <D

Ό

O

Q_

C

Ό

O

O.

«

	£
oo	co
τ—	CN
xF	CO’
ffl	ffl

O O O O O O <N CN CN CN CN CN

O O O O O O CN CN CN CN CN CN o o o o o o §§§§§§ ^í Ci CO Cí ^3 O CN CN CN CN CN CN ia o> r* oo co ia co o> co o> co CO Γ*· <D Xf

IA <0 V- 05 O <0 O) CO X“ ffl IA xr o o> ia SOlO lo ia ia

Tf CO CN IO x- co co oo xr to ffl χ- xr Ncpm IO nF XT

0)0 00

CN OO Xt CO CO O T-* io ss® iO co

Tabulka 3

Evaluace gradientů plazmidů Beren a Tuor metodou reál time PCR

O.

O

Jí

-w s

o

Q.

'>%

C »9 .S

Jí ω

«

Q.

O c

.9?

ce

O) £

o £

N

Λ

CL

X»

E χ»

Ε •3 η

fš

Q. (0 5 2 xj0č oo CL O.

CN O CO lA CO _ o o co_ T00 co’ v’ x~ T- co x- τ- CN CN CO CN

O SO) Φ co co ί- xC0 x“ x- xS®^ ιΛ τ- Ν’ 00 Ν’ CO cd * Λ co r*. ιο 55

S- T- S- Τ— τ— ΙΟ N- «r v> ia to o’ o’ o* o o o lA CO τ- h* ΟτΟ CD ffl CO -r- CO O' CO* CO’ O Χξ <

CN CN CN CO

CO

O O O O O lO o o o o m o O O io o o ia o to m

CO o

O CQ CO N- CN χ- co o r- co co xf χ-’ oo’ o co x- x- CN x- CO CN

0> O CD CO lO «O) 00 00

$r $ <0 S? £ S o’ o’ o’ o o’ o’

O)(N γ ιη τ- oo o iň oo ϋ ▼- ϋ v>

O co’ CD O < CN CN CN CO CO

O O O O O O O O O IA O O O ΙΛ O O IA O IO in

to 2	to 2
§	s. _
35 ar	Poč
(β o
=>0.	C CL
o <»	2 ω
3 E	0) £
H +3	CO £S

sco iA

IS - Experimentální 95% interval spolehlivosti ^d Počet pozitivních vzorků/celkový počet vzorků ® Spočítána z průměrného regresního koeficientu ^ZSO - Směrodatná odchylka ⁰ CV - Koeficient variance

Tabulka 4

Detekce MAP v kravském mléce (zdojky ze všech struků) z chovu krav infikovaného paratuberkulózou

IS900+ a F57+	IS900+ a F57-
Cisto krávy IS90O* F57* Počet MAP	Cislo krávy IS900* F57* Počet MAP“

1	37	10	5	1	52	<2
2	598	58	29	2	22	<2
3	12	9	5	3	19	<2
4	30	4	2	4	16	<2
5	4	3	2	5	3	<2
6	34	6	3	6	13	<2
7	679	74	37	7	1	<2
8	53	10	5	8	4	<2
9	10	4	2	9	16	<2
10	37	3	2	10	6	<2
11	30	5	3	11	9	<2
12	49	5	3	12	3	<2
13	160	6	3	13	14	<2
14	399	7	4	14	30	<2
15	6	4	2	15	36	<2
				16	34	<2
				17	24	<2
				18	21	<2
				19	45	<2
				20	25	<2
				21	47	<2
				22	6	<2

^a Průměr poětu kopií z duplikátu na PCR reakci.

^b Poěet MAP buněk na 1 ml výchozího množství mléka. Přepočteno z množství MAP buněk naměřeného pomocí F57 reál time PCR (počet kopií F57 získaných z reál time PCR děleno 2 = počet MAP buněk v 1 ml výchozího množství mléka).

^c Poěet MAP buněk na 1 ml výchozího množství mléka. Přepočteno z množství MAP buněk naměřeného pomocí IS900 reál time PCR (počet kopií IS900 získaných z reál time PCR děleno 36 = počet MAP buněk v 1 ml výchozího množství mléka).

1. Způsob detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) duplexní kompetitivní polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) v reálném čase s interní amplifíkační kontrolou, vyznačující se tím, že se detekce a kvantifikace MAP ve vzorcích živočišného a rostlinného původu provádí primery a hydrolyzačními sondami, které amplifikují dva lokusy specifické pro MAP, tedy IS900 a F57, o následujícím složení

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY primerů pro F57

F57qPCRF GCCCATTTCATCGATACCC

F57qPCRR GTACCGAATGTTGTTGTCAC, sondy pro F57

F57qPCRTM primerů pro IS000

IS900qPCRF

IS900qPCRR sondy pro IS900

IS900qPCRTM

FAM - CAATTCTCAGCTGCAACTCGAACACAC - BHQ,

GATGGCCGAAGGAGATTG

CACAACCACCTCCGTAACC,

FAM - ATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGT - BHQ, přičemž sonda pro interní ampiifikační kontrolu má složení lACqPCRTM Cy5 - GGCTCTTCTATGTTCTGACCTTGTTGGA - BHQ.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se stanovení MAP pomocí primerů a sond podle nároku 1 provádí ve vzorcích jakéhokoli živočišného původu, zejména pocházejících z hospodářských zvířat a v klinických vzorcích pocházejících z humánních pacientů, ve vzorcích rostlinného původu, ve vzorcích prostředí zejména z hnoj i v, prachu, sena, ve vzorcích pocházejících z archeologických nálezů a ve vzorcích potravin a krmiv.
3. Plazmidové konstrukty, vzniklé při použití primerů a sond, uvedených v nároku 1.
4. Detekční soupravy pro detekci a diagnostiku MAP podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahují jeden nebo více oligonukleotidů definovaných v nároku 1 nebo plazmidových konstruktů podle nároku 3.

1 výkres ⁴⁰ Ί 38 38

34 32 a.

30 28 28

20 <

τ--1-¹—I - —

12 3 4

Logaritmu* koncentrace (počet kopií)

Obr. 1

Grafické zobrazení porovnání F57 a IS90O reál time PCR v rozmezí 10⁵ -10° kopii na 1 μΙ (což odpovídá 5 χ 10⁵ - 5 x 10° kopii na reál time PCR reakci). Regresní rovnice a hodnoty spolehlivosti R² pro obé křivky jsou následující: gradient plazmidu Tuor (IS900 reál time PCR) - y = -3.46963x + 39.84290; R² = 0.99952 a gradient plazmidu Beren (F57 reál time PCR) - y = -3.49555x + 39.93065; R² = 0.99978.