JP6226460B2 - 核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、ｄｎａチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法 - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、ＤＮＡチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法に関する。

一般的に、血中ウイルス濃度はウイルス血症の程度を示す重要な指標になる。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の場合、血中ウイルス濃度が低い患者は、肝機能を示す数値ＡＳＴ、ＡＬＴの値が低く肝障害が軽微である。逆に血中ウイルス濃度が高い患者は肝障害が重篤で肝機能が低下している場合が多い。さらに、血中ウイルス濃度は、抗ウイルス治療の効果にも影響する。同じＨＣＶの例では、血中ウイルス量が低い症例ではインターフェロン療法が奏効する可能性が高いが、血中ウイルス量が高い症例では治療効果が得られにくい傾向がある。

日本には約２００万人のＣ型肝炎ウイルスに感染者がいる。そのうちの約７０％は慢性肝炎を発症している。これらの患者は、１０年から２０年の経過の後に高率に肝癌を発症することがわかっており、慢性肝炎のうちにウイルスを完全に排除しておくことが強く望まれている。インターフェロン療法はウイルスを排除する有効な方法であるとされているが、実際には単独療法では３割程度の患者でしか著効しない。一方でインターフェロン療法には重篤な副作用が伴い、その上、治療には多額の費用がかかる。よって治療開始前に血中ウイルス量を測定してインターフェロン療法の効果をある程度予測し、治療が奏効する可能性のある患者を選び出すことは、患者の負担を軽減するために重要な意味をもつ。

Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン療法の効果は、主にウイルス側の要因によって規定されている場合が多い。特に影響すると考えられている要因が、ウイルスのタイプ（即ち、遺伝子型）とウイルス量である。これら２要因は、互いに関連している。即ち、遺伝子型１ｂではウイルス量が多くなる傾向があり、逆に２ａ、２ｂ型ではウイルス量があまり多くならないという大まかな相関が認められる。また、治療開始後のウイルス量の推移の仕方が、治療効果に反映するとの報告もある（Ｃｈａｙａｍａ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ． １９９４， ６１７−６２０）。ウイルス量を測定することは治療方針を決定する、または治療を進めるにあたって、重要な判断材料となる。

また、組織中に発現したｍＲＮＡ量を測定することは、ある薬剤に対する個体の反応性を見る上で重要な指標になると考えられている。例えば、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン療法の効果を考える場合に、治療開始前と開始後の肝組織を採取し、それぞれで発現しているｍＲＮＡの量を数種の遺伝子に対して比較することにより、その個体のインターフェロンに対する反応性を調べることが可能となる。そのために、まず治療開始前後でいくつかの遺伝子の発現パターンを比較して、インターフェロンの効果の有無を規定するために意味のある遺伝子の発現変化のパターンが特定される。その結果から治療開始前後の特定の遺伝子の発現量の変化を測定する。それにより、治療効果があらかじめ予測できる。

これらウイルス量の測定は、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ法やＢｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ（バイエル社製）， Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ ｍｏｎｉｔｏｒ法（ロシュダイアグノスティック社製）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（アプライドバイオシステムズ株式会社製）などを利用して行われている。Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ法は、濃度標準核酸を用いた競合的ＰＣＲによってウイルス量を算定するものである。検出には電気泳動が用いられ、その泳動像を読むにはある程度の経験が必要である。また１検体あたり数本のＰＣＲをかける必要があり、手順が煩雑である。Ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙを行なうにはＢｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ を合成する特別な技術が必要となる。Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ法やＴａｑＭａｎ法では特別な測定用装置が必要となる。

組織中のｍＲＮＡ量を測定する従来法は、ノーザンブロッティング法で大まかに見る以外は、特別な装置と核酸標識を必要とするＴａｑＭａｎ法（アプライドバイオシステムズ株式会社製）、各種マイクロアレイを用いる方法などが挙げられる。

一方で、細菌による感染症における感染菌体量を調べるには、従来は細菌培養法が採用されている。この技術は、それぞれの細菌に適した培地に検体を塗布し、適切な温度で１日から３日間程度保温することによって、１個の菌体を可視化させ（コロニー形成）、そのコロニー数をカウントすることで、塗布したサンプル量中の菌体の量を算出するものである。この方法では、コロニー形成に時間を要し、コロニーを形成するために、試験される菌に適した培地を選ぶ必要があり、塗布できる検体量に限界がある。また、元々培養に不向きは菌種も存在する。

Ｋａｎｅｋｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ． ３７， ２７８−２８２， １９９２ Ｃｈａｙａｍａ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｒｏｌ．８， Ｓ４０−４４，１９９３

本発明の課題は、試料中の核酸を簡便に定量する手段を提供することである。

上記の課題を解決するための検体中に含まれる核酸を定量する方法は、核酸を含む検体、第１のプライマーと第２のプライマーとを含むプライマーセット、および濃度標準核酸を準備すること、前記検体と、前記プライマーセットと、既知の濃度の前記第１の濃度標準核酸とを１つの反応環境内で、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行って増幅産物を得ること、基体に固定化された第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブと増幅産物とを反応させること、ハイブリダイゼーション量を検出して比較し、検体中の核酸を定量することを含む。プライマーセットが増幅すべき標的鋳型配列は、５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域およびＦ１領域を含み、３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域を含む。濃度標準核酸は、５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、第１のプローブ結合領域とは配列が異なる第２のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とを含み、３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とを含む。

標的鋳型核酸とプライマーセットを示す図。 実施形態の１例の原理を示す図。 実施形態の１例を示す図。 実施形態の１例を示す図。 実施形態の１例を示す図。 実施形態の１例を示す図。 細菌培養結果がわかっている検体からの大腸菌の定量した結果の１例を示す図。 例１の結果を示す図。 例２の結果を示す図。 例３で用いたＤＮＡチップを模式的に示した図。 例３の結果を示す図。 例４の結果を示す図。 図１２Ａに示した例４の結果の一部分についての拡大図。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。

当該方法により、検体中の特定の核酸の量を測定することが可能である。当該方法は、目的とする特定の核酸の検体中の存在量を知るために、検出されるべき核酸を標的鋳型核酸として、プライマーセットで増幅すると共に、同一のプライマーセットを用いて競合的に濃度標準核酸を鋳型として増幅する。これらの競合的な増幅は、１つの反応環境内で行われる。このとき、濃度標準核酸の量は既知である。得られた増幅産物を、核酸プローブと反応させ、生じたハイブリダイゼーションを検出する。標的鋳型核酸に基づくハイブリダイゼーション量と、濃度標準核酸に基づくハイブリダイゼーション量とを比較することにより、検体中の標的鋳型核酸の量を決定する。濃度標準核酸の種類を増やし、それぞれの濃度標準核酸の量を異なる量、例えば、段階的に異なる量として、それらを検体と共に１つの反応環境内で同一のプライマーセットにより増幅することにより、より詳細に標的鋳型核酸の量を決定することが可能である。

言い換えれば、使用する濃度標準核酸の種類およびその数、並びに濃度によって、当該定量方法の精度を所望に応じて調整することが可能である。大まかな存在量が知りたい場合には、より少ない種類、例えば、１種類または２種類などの濃度標準核酸を使用してもよい。また、所望に応じて特定の基準、例えば、閾値を予め定めておき、その基準値よりも検体中の菌量が多いのか、少ないのかを判定する方法として当該方法を使用することも可能である。

検体に含まれる核酸を「検体核酸」と称する。検体核酸のうち、プライマーにより増幅することにより定量されるべき核酸を「標的鋳型核酸」と称する。プライマーにより増幅されるべき核酸を「鋳型配列」と称す。鋳型配列を含む核酸を「鋳型核酸」または「鋳型」と称す。

図１を参照して標的鋳型核酸１とプライマーセットについて説明する。

標的鋳型核酸１は、その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域２およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む。標的鋳型核酸１が二本鎖で存在する場合には、その相補配列である標的鋳型核酸３は、その５’末端側からＢ３領域、Ｂ２領域、ＬＢ領域およびＢ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、第１のプローブ結合領域の相補領域、およびＦ１ｃ領域をこの順番で含む。Ｆ３領域、Ｆ２領域、Ｆ１領域、Ｂ３領域、Ｂ２領域、Ｂ１領域、ＬＢ領域は、それぞれＦ３配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ３配列、Ｂ２配列、Ｂ１配列、ＬＢ配列を有する。Ｆ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、Ｂ１ｃ領域、ＬＢｃ領域は、それぞれＦ３領域、Ｆ２領域、Ｆ１領域、Ｂ３領域、Ｂ２領域、Ｂ１領域、ＬＢ領域に相補的な配列を有する。

プライマーセットは、第１のプライマー４と第２のプライマー５とを含む。第１のプライマー４は、５’末端側にＦ１に相補的なＦ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＦ２に同じＦ２配列を有するＦＩＰプライマーである。第２のプライマー５は、５’末端側にＢ１ｃに同じＢ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＢ２ｃに相補的なＢ２配列を有するＢＩＰプライマーである。

濃度標準核酸６は、その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第２のプローブ結合領域７およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む。第２のプローブ結合領域７の配列は、第１のプローブ結合領域２の配列と異なる。即ち、濃度標準核酸６は、標的鋳型核酸１における第１のプローブ結合領域２の配列以外は、標的鋳型核酸１の構成と同じである。図１には示さないが、濃度標準核酸６が二本鎖で存在する場合には、その相補配列である配列は、その５’末端側からＢ３領域、Ｂ２領域、ＬＢ領域およびＢ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、第２のプローブ結合領域の相補領域、およびＦ１ｃ領域をこの順番で含む。

前記検体と、前記プライマーセットと、既知の濃度の前記第１の濃度標準核酸とを１つの反応環境内に持ち込み、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行って増幅産物を得る。

標的鋳型核酸１と濃度標準核酸６の配列は、プローブ結合領域の配列のみが異なり、同じプライマーセットによりそれぞれ増幅される。同じプライマーセットにより、標的鋳型核酸１と濃度標準核酸６とを１つの反応環境内において競合的に共増幅した場合、反応環境内において、より多く存在する方が優先的に増幅される。

得られた増幅産物を基体に固定化された核酸プローブ群と反応させ、生じたハイブリダイゼーション量によって、目的とする標的鋳型核酸の検体中の存在量を判定する。

この方法において、互いに異なる濃度を有する複数の濃度標準核酸を用いてもよい。例えば、第１〜第ｎまでの複数の濃度標準核酸を用いる場合、第１〜第ｎの濃度標準核酸の各プローブ結合領域は、第２_１〜第２_ｎのプローブ結合領域をそれぞれ含む。ここで、ｎは２以上の整数である。第２_１〜第２_ｎのプローブ結合領域は、何れも標的鋳型核酸１に含まれる第１のプローブ結合領域２の配列とは異なり、且つ他の第２_１〜第２_ｎのプローブ結合領域の配列は、互いに異なる配列を有する。各濃度標準核酸のプライマー結合領域は、プローブ結合領域以外の配列は標的鋳型核酸１と同じである。複数の濃度標準核酸を使用する場合には、１つの反応環境内で、検体と、第１〜第ｎの濃度標準核酸のうちの何れか１種類と、プライマーセットとを持ち込む。用意される反応環境は、第１〜第ｎの反応環境であり、準備された第１〜第ｎの濃度標準核酸の全てについてそれぞれ競合的に増幅反応を行う。増幅反応の後に、第１〜第ｎの反応環境においてそれぞれ得られた第１〜第ｎの増幅産物を１つに合わせる。１つに合わせられた増幅産物は、第１〜第ｎの増幅産物、即ち、例えば、ｎが３であった場合、第１の増幅産物、第２の増幅産物、第３の増幅産物を含む。その後、合わせられた増幅産物を核酸プローブ群と反応させて、生じたハイブリダイズ信号を検出し、得られたハイブリダイズ信号の有無または大きさを互いに比較することにより、検体中の標的鋳型核酸１の濃度を判定する。

本方法の原理について図２を参照しながら説明する。検体を準備する。検出されるべき標的鋳型核酸１を選択する。標的鋳型核酸１は、第１のプローブ結合領域２を含む。標的鋳型核酸１をＬＡＭＰ増幅するためのプライマーセットと、濃度標準核酸６とを準備する。プライマーセットは、第１のプライマー４と第２のプライマー５を備える。濃度標準核酸６は、第１のプローブ結合領域２とは異なる配列を有する第２のプローブ結合領域７を有する。次に、検体と、濃度標準核酸６と、プローブセットとを１つの反応環境内に持ち込み、競合的にＬＡＭＰ増幅反応を行う。

（ａ−１）に示すように、例えば、標的鋳型核酸１と濃度標準核酸６との反応環境内の存在比が１０：１である場合、即ち、反応環境内に存在する標的鋳型核酸の量と濃度標準核酸の量に偏りがある場合、存在量が大きい方の鋳型が優先的に増幅される。増幅により得られる増幅産物量のイメージを図２（ａ−２）に示す。図２（ａ−２）のように、存在量が大きい方の鋳型からの増幅産物が、他方の鋳型からの増幅産物量よりも多く存在する。

（ｂ−１）に示すように、例えば、標的鋳型核酸１と濃度標準核酸６との反応環境内の存在比が１：１である場合、即ち、反応環境内に存在する標的鋳型核酸の量と濃度標準核酸の量が等しい場合、増幅反応は２つの鋳型について等しく進行する。即ち、図２（ｂ−２）に示すように、標的鋳型核酸１および濃度標準核酸６のそれぞれからの増幅産物は等しい量で存在する。

従って、既知の濃度の濃度標準核酸と検体とを競合的にＬＡＭＰ増幅反応を行った後に、増幅産物を検出することにより、濃度標準核酸の濃度を指標に検体中の標的鋳型核酸の濃度を判定することが可能である。

核酸プローブと増幅産物との反応は、ＤＮＡチップを用いて行ってよい。

「核酸プローブ」とは、標的配列に対して相補的な配列を含む核酸である。核酸プローブは、それ自身公知の固相に対して固定化されてもよい。好ましい核酸プローブは、基体表面に固定化されて使用される。そのような基体と、基体に固定化された核酸プローブとを含む装置は、一般的にＤＮＡチップにより行われてよい。「ＤＮＡチップ」とは、検出しようとする核酸に相補的な配列を有する核酸プローブと、検出対象の核酸との間のハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸を解析する装置である。ＤＮＡチップの語は、一般的に使用される「核酸チップ」、「マイクロアレイ」および「ＤＮＡアレイ」などの用語と同義であり、互いに交換可能に使用される。

核酸プローブは、標的鋳型核酸に由来する増幅産物と、増幅時に使用された全ての濃度標準核酸にそれぞれ由来する全ての増幅産物が検出できるように用意される。例えば、標的鋳型核酸と、１種類の濃度標準核酸を共増幅する場合、ＤＮＡチップは、第１の固定化領域に固定化された第１の核酸プローブ８と、第２の固定化領域に固定化された第２の核酸プローブ９を備える。図１に示すように、第１の核酸プローブ８は、５’側のＦ２領域と３’側の第１のプローブ結合領域２を含む第１の標的配列に相補的な配列を有する。第２の核酸プローブ９は、５’側のＦ２領域と３’側の第２のプローブ結合領域７を含む第２の標的配列に相補的な配列を有する。更に、ＤＮＡチップは、第１の核酸プローブ８および第２の核酸プローブ９にそれぞれ相補的な第３の核酸プローブおよび／または第４の核酸プローブを更に含んでもよい。

第１〜第ｎの濃度標準核酸を用いる場合には、第２_１〜第２_ｎの核酸プローブ、即ち、ｎ種類の互いに配列の異なる核酸プローブが用意される。ここでｎは、２以上の整数である。各核酸プローブは、それぞれの濃度標準核酸が含むＦ２領域と第２_１〜第２_ｎのプローブ結合領域の何れか１つの配列とをそれぞれ含む第２_１〜第２_ｎの標的配列に相補的な配列を有する。即ち、第２_１の核酸プローブは、５’側のＦ２領域と３’側の第２_１のプローブ結合領域とを含む第２_１の標的配列に相補的な配列を有する。第２_ｎの核酸プローブは、５’側のＦ２領域と３’側の第２_ｎのプローブ結合領域とを含む第２_ｎの標的配列に相補的な配列を有する。このような第２_１〜第２_ｎの核酸プローブは、ＤＮＡチップの第２_１〜第２_ｎの固定化領域に種類毎にそれぞれ固定化されていてもよい。

或いは、第１の核酸プローブ８は、Ｆ２領域および第１のプローブ結合領域２を含む第１の標的配列と同じ配列を有してもよい。また、第２の核酸プローブ９は、Ｆ２領域および第２のプローブ結合領域７を含む第２の標的配列と同じ配列を有してもよい。同様に第ｎの核酸プローブは、Ｆ２領域および第２_ｎのプローブ結合領域を含む第ｎの標的配列と同じ配列を有してもよい。

「標的配列」とは、鋳型核酸を、プライマーセットを用いて増幅して得られた増幅産物の配列のうち、核酸プローブと結合させることによって検出されるべき配列である。標的配列を含む核酸を標的核酸という。標的配列は、鋳型核酸の配列のうちの、Ｆ２領域とプローブ結合領域とを含む、またはＦ２領域とプローブ結合領域とからなる。標的配列は、核酸プローブを用いて標的核酸を検出するために利用される。

核酸プローブは、ＤＮＡチップに固定化されて使用されてよい。好ましくは１つのＤＮＡチップに検出に使用されるべき核酸プローブが全て含まれる。好ましくは、１つのＤＮＡチップに含まれる核酸プローブは、標的鋳型核酸に由来する増幅産物と、その定量のために使用される全ての濃度標準核酸に由来する増幅産物とを含み、それらを同時に検出する。しかしながら、目的とする定量に必要とされる核酸プローブが複数の基体に固定化されて、使用されてもよい。

検体に含まれる複数種類の特定の核酸を同時に定量することも可能である。その場合、検出されるべき全ての特定の核酸について、それぞれ標的鋳型配列を決定し、それらの標的鋳型配列の全てをそれぞれ増幅するためのプライマーセットと、それぞれの標的鋳型配列と競合して増幅させるべき濃度標準核酸と、得られた全ての検出されるべき増幅産物を検出するための核酸プローブが準備される。これらの配列および核酸は、上述した構成と同様の構成で準備されればよい。また、複数種類の特定の核酸のために準備された核酸プローブは、１つの基体に固定化されてもよく、複数の基体に固定化されてもよい。

複数の種類の特定の核酸について、それぞれの反応環境内で、それぞれの濃度標準核酸と競合してＬＡＭＰ法により増幅反応を行う。その後、得られた全ての増幅産物を１つに合せて、１つの増幅産物混合物を得る。この増幅産物混合物を、例えば、全ての核酸プローブを備えるＤＮＡチップに対して持ち込み、核酸プローブと反応させる。得られたハイブリダイズ信号から、複数種類の特定の核酸を同時に定量することが可能となる。

検体は、核酸を含む何れかの物質であればよく、例えば、個体の体液、組織、器官、尿、便、乳汁中、血液、血清、血漿、吐しゃ物、組織擦過検体等、定量対象となる核酸が定量する価値のある典型的濃度で存在する試料であればよい。「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。例えば、核酸は、天然由来のＤＮＡおよびＲＮＡなど、一部分または完全に人工的に合成および／または設計された人工核酸など、並びにそれらの混合物などであってよい。「検体」とは、実施形態の方法が実施されるべき対象であり、核酸を含む可能性のある試料であればよい。検体は、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を妨害しない状態であることが好ましい。例えば、生体などから得られた材料を、本実施形態に従う検体として使用するためには、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行ってもよい。例えば、検体は液体であってもよい。

定量されるべき核酸は、例えば、外因性の核酸であってよく、例えば、微生物、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、藻類、真菌類などの核酸であってよい。また、検出されるべき核酸は、個体に内在する何れかの核酸であってもよく、例えば、個体の体内、例えば、血液または組織、尿、唾液または乳汁などに発現したｍＲＮＡなどであってもよい。

「１つの反応環境内」とは、例えば、そこにおいて反応を行うことの可能な１つの反応場のことを示す。例えば、試験管、カップ、ウェルなどの反応容器の内部を反応環境と解すればよい。

実施形態によれば、病原体の生体内濃度、血中濃度、組織中濃度、尿中濃度、唾液中濃度または乳汁中濃度を測定することが可能である。

２つの配列が「同一」または「同じ」とは、２つの配列がその全長に亘り、９０％以上、９５％以上、９８％以上または１００％で互いに等しい配列をいう。２つの配列が「相補的」であるとは、２つの配列がその全長に亘り、９０％以上、９５％以上、９８％以上または１００％で互いに相補的な配列をいう。

上述において、ＤＮＡチップに関する記載をしたが、核酸プローブが固定化されて使用される場合、その基体は、ＤＮＡチップのための基板に限定されるものではない。例えば、基体は、磁性ビーズ、マイクロタイタープレートおよびチューブなどの不溶性支持体であってもよい。

実施形態によれば、検体に含まれる検体核酸を標的鋳型核酸としてＬＡＭＰ増幅する際に、その同じ反応環境に既知の濃度の濃度標準核酸を混在させ、その結果として得られる増幅産物を比較し、それにより検体核酸と濃度標準核酸のどちらが増幅するかが判定される。それにより、標的鋳型核酸の量を推定することが可能である。このような方法により、体内病原体濃度およびｍＲＮＡ量を簡便に測定することが可能である。またそれにより、細菌性およびウイルス性の感染症の病態把握や治療の方針の決定に役立つ。

増幅産物の核酸の全体構造は、ＰＣＲ産物のような２本鎖の直鎖状ＤＮＡであっても、環状のＤＮＡであってもよい。増幅産物の長さは、直鎖状のＤＮＡであれば、２００塩基対以上５０００塩基対以下の長さが好ましい。環状であれば、２００塩基対以上１００００塩基対以下の長さが好ましい。検出に使用される配列以外の領域に、検出部分およびプライマー領域と相同な配列もしくは類似した配列が存在しないことを確認して使用することが好ましい。また、増幅産物が極端に立体構造を取らないよう、ＧＣ含量の高い領域を含まないよう、互いに相補的な配列を含まないよう工夫することも好ましい。プライマーセットに含まれる各プライマーおよび濃度標準核酸の合成方法は、ＰＣＲ法のような２本鎖ＤＮＡ合成法や、プラスミド等に組み込んだクローニング産物として得ることも可能である。クローニングに使うベクター種は、特に制限するものではない。

標的鋳型核酸がＲＮＡの場合は、濃度標準核酸もＲＮＡであることが望ましい。その場合には、プローブ部分を別配列に置き換えたＤＮＡ断片を、一度ＳＰ６およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む転写ベクターに組み込んで、そこからＲＮＡ転写を行って必要なＲＮＡを得ることができる。転写に使うベクターや酵素については、特に制限するものではない。

濃度標準核酸上のプローブ結合領域の配列は、標的鋳型核酸上のプローブ結合領域とＴｍ値や長さが似通っていることが好ましい。また、濃度標準核酸または標的鋳型核酸として用いる核酸全体の他の部分の配列とも、相同でない配列もしくは相補的でない配列を選ぶことが必要である。さらに念のために、検査されるべき生物種には感染しない病原体の塩基配列、または検査されるべき生物種のゲノム上の配列とは異なる配列を、濃度標準核酸のプローブ結合領域の配列として選択することも好ましい。

表１に、牛の乳房炎の原因菌としての大腸菌（エンテロバクテリア科の菌）、連鎖球菌、ブドウ球菌を測定する検査に使用することが可能な濃度標準物質のプローブ結合領域２のための配列の例を示す。

濃度標準核酸のプローブ結合領域２のための配列は、検出されるべき核酸と関係のない生物種から選択してくることが好ましい。表１の例には、ヒトＢ型肝炎ウイルスのゲノム配列に基づいて作成したプローブ結合領域の配列候補を２０種類示した。また、プローブ結合領域の配列は、標的鋳型配列においてプローブ結合領域と設定された領域と比べて、長さとＴｍ値があまり変わらないものを選択する必要がある。なお、表１に示した配列は、肝炎ウイルスなどのヒトの感染症の病原体に対する定量系を設計する場合には使用できない。

また、牛には感染しないヒトのＢ型肝炎ウイルスのゲノムの一部を用いている。プローブ配列の長さは、１５塩基から３５塩基程度の長さで、Ｔｍ値は６２℃〜７８℃までの間で選ぶことが好ましい。

図３には、濃度標準核酸を２種類用いる場合の測定例を示した。反応環境である２つのチューブにそれぞれ添加する２種類の濃度標準核酸は、互いに添加量が異なる。この図３（ａ）の例では、低濃度の濃度標準核酸を１０コピー（即ち、１Ｅ＋０１ｃｏｐｙ）、高濃度の濃度標準核酸を１００コピー（即ち、１Ｅ＋０２ｃｏｐｙ）添加している。定量されるべき標的鋳型核酸の濃度は、標的鋳型核酸の増幅産物の量と、２種類の濃度標準核酸、即ち、第１および第２の濃度標準核酸についての増幅産物の量とを比較することにより得られる。例えば、反応環境中の標的鋳型核酸の濃度が、低濃度の第１の濃度標準核酸よりも低い濃度の場合の結果は、（ｂ）および（ｃ）に示される。この場合、第１および第２の濃度標準核酸の増幅産物は、何れも標的鋳型核酸の増幅産物の量よりも多く、標的鋳型核酸の増幅は低い。反応環境中の標的鋳型核酸の濃度が、低濃度の第１の濃度標準核酸よりも高く、高濃度の第２の濃度標準核酸よりも低い濃度の場合の結果は（ｄ）および（ｅ）に示される。この場合、標的鋳型核酸と第２の濃度標準核酸の増幅産物が多く、第１の濃度標準核酸の増幅産物は少ない。標的鋳型核酸の濃度が、高濃度の第２の濃度標準核酸よりも高い濃度の場合の結果は、（ｆ）および（ｇ）に示される。この場合、標的鋳型核酸のみが増幅し、第１および第２の濃度標準核酸の増幅は低い。このように２種類の濃度標準核酸と、検体核酸である標的鋳型核酸との増幅産物の存在の量の関係から、反応環境中の標準鋳型核酸の濃度を、例えば、３段階に測り分けることができる。

図４には、３つの異なる濃度、即ち、１×１０^１（１．００Ｅ＋０１）、１×１０^３（１．００Ｅ＋０３）および１×１０^５（１．００Ｅ＋０５）の濃度で、それぞれ標的鋳型核酸Ａを含む検体について、５種類の濃度標準核酸を用いて定量する例を示す。検体毎に、それぞれ５つの反応環境、例えば、反応容器を用意し、競合的に増幅反応を行う。５種類の濃度標準核酸は、互いに異なる添加量で添加される。各競合的増幅反応の結果図４（Ａ）〜（Ｏ）と、検体毎にＤＮＡチップにより検出されるハイブリダイズ信号の例を図４（Ｐ）〜（Ｒ）に示す。

まず、反応環境１におけるそれぞれの濃度で持ち込まれた各濃度標準核酸と、１×１０^１（即ち、１．００Ｅ＋０１）の濃度で反応環境に存在する標的鋳型核酸との反応について説明する。

検体１については、反応環境１においては、標的鋳型核酸Ａと１×１０^１の濃度で存在する第１の濃度標準核酸Ｂとの間で増幅反応が競合する。反応環境２では、標的鋳型核酸Ａと１×１０^２（即ち、１Ｅ＋０２）の濃度で存在する第２の濃度標準核酸Ｃとの間で増幅反応が競合する。反応環境３では、標的鋳型核酸Ａと１×１０^３（即ち、１．００Ｅ＋０３）の濃度で存在する第３の濃度標準核酸Ｄとの間で増幅反応が競合する。反応環境４では、標的鋳型核酸Ａと１×１０^４（即ち、１．００Ｅ＋０４）の濃度で存在する第４の濃度標準核酸Ｅとの間で増幅反応が競合する。反応環境５では、標的鋳型核酸Ａと１×１０^５（即ち、１．００Ｅ＋０５）の濃度で存在する第５の濃度標準核酸Ｆとの間で増幅反応が競合する。反応環境１では、２つの核酸は等量で存在するために、（Ａ）に示すように両方の核酸が同様に増幅される。反応環境２〜５では、第２の濃度標準核酸Ｂ〜第５の濃度標準核酸Ｆの方が何れの場合も多く存在するために、第２の濃度標準核酸Ｂ〜第５の濃度標準核酸Ｆが標的鋳型核酸Ａに優先して増幅される（それぞれ（Ｄ）、（Ｇ）、（Ｊ）および（Ｍ）を参照）。検体１について得られた増幅産物を混合して得た混合物１についてＤＮＡチップで検出した結果を（Ｐ）に示す。この結果から、標的鋳型核酸Ａは、１×１０^１の濃度であると判定する。

検体２では、標的鋳型核酸Ａは、１×１０^３の濃度で存在する。この場合、反応環境１および２では、標的鋳型核酸Ａの方が濃度標準核酸ＢおよびＣよりも多く存在する。従って、反応環境１および２では、（Ｂ）および（Ｅ）に示すように、標的鋳型核酸Ａが優先して増幅される。反応環境３では、２つの核酸は等量で存在するために、（Ｈ）に示すように両方の核酸が同様に増幅される。反応環境４および環境５では、第４の濃度標準核酸Ｅ〜第５の濃度標準核酸Ｆの方が何れの場合も多く存在するために、第２の濃度標準核酸Ｅ〜第５の濃度標準核酸Ｆが標的鋳型核酸Ａに優先して増幅される（それぞれ（Ｋ）および（Ｎ）を参照）。検体２について得られた増幅産物を混合して得られた混合物２についてＤＮＡチップで検出した結果を（Ｑ）に示す。この結果から、標的鋳型核酸Ａは、１×１０^３の濃度であると判定する。

検体３では、標的鋳型核酸Ａは、１×１０^５の濃度で存在する。この場合、反応環境１〜４では、標的鋳型核酸Ａの方が濃度標準核酸Ｂ〜Ｆよりも多く存在する。従って、反応環境１〜４では、（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）および（Ｌ）に示すように、標的鋳型核酸Ａが優先して増幅される。反応環境５では、２つの核酸は等量で存在するために、（Ｏ）に示すように両方の核酸が同様に増幅される。検体３について、それぞれの反応環境で得られた増幅産物を混合した混合物３についてＤＮＡチップで検出した結果を（Ｒ）に示す。この結果から、標的鋳型核酸Ａは、１×１０^５の濃度であると判定する。

このように、標的鋳型核酸濃度よりも低い濃度で濃度標準核酸が存在する場合には、そのような濃度の濃度標準核酸に由来するハイブリダイズ信号は得られない。従って、濃度標準核酸の濃度を所望に応じた数だけ段階的に用意することにより、標的鋳型核酸の量を判定することが可能である。また、大凡の標的鋳型核酸の量を知りたい場合には、濃度標準核酸の濃度の数を減らせばよい。濃度標準核酸の濃度は、必要に応じて何段階にでもすることが可能である。濃度を変えて使用される濃度標準核酸はプローブ結合領域の配列が互いに異なればよい。

濃度標準核酸の添加量は、例えば、等倍希釈であっても、任意の異なる倍数で希釈してもよい。例えば、２倍ずつ希釈してもよく、必要な整数倍で希釈してもよく、必要なピッチで刻んで希釈すればよい。所望に応じて、濃度標準核酸の濃度を設定すればよい。

例えば、標的鋳型核酸の濃度の判定の例を図５に示す。図５（ａ）の場合には、何れの濃度の濃度標準核酸も、標的鋳型核酸よりも優先して増幅されている。従って、この場合には、標的鋳型核酸は、最も低い濃度の濃度標準核酸以下の濃度であると判定する。また、更に、同一基体上に定性検査用の核酸プローブも固定化しておくことにより、低濃度であっても陽性であるのか、陰性であるかの判定も可能になる。

図には示さないが、標的鋳型核酸のみが優先して増幅されて、何れの濃度標準核酸の増幅も検出されなかった場合には、標的鋳型核酸は、最高濃度で存在する濃度標準核酸の濃度以上であると判定する。

図５（ｂ）〜（ｄ）の場合には、ハイブリダイズ信号が中間の値を示す結果があった場合のグラフである。この場合、その反応環境内では、標的鋳型核酸と濃度標準核酸の濃度が拮抗していたと考えられる。この場合は、（ｂ）または（ｃ）のように、最も低いハイブリダイズ信号の２倍以上の信号が得られれば、その反応において濃度標準核酸の増幅が勝ったと判定すればよい。（ｄ）のように最も低いハイブリダイズ信号の２倍に満たないハイブリダイズ信号であって場合、その濃度標準核酸の濃度と標的鋳型核酸は同じ濃度含まれていたと判定する。図５（ｃ）の例の場合、濃度標準核酸Ｅが１×１０^４（即ち、１Ｅ＋０４）コピーの濃度で添加されていたとすると、（ｃ）の標的鋳型核酸は、１×１０^４コピー（即ち、１Ｅ＋０４）以上、１×１０^５（即ち、１Ｅ＋０５）コピー以下だったと判定し、（Ｄ）の検体は、標的鋳型核酸が１×１０^４（即ち、１Ｅ＋０４）コピーだったと判定する。

また、実施形態によれば、上述の定量方法を用いて、牛乳房炎の原因菌である大腸菌群、ブドウ球菌、連鎖球菌の３種の菌群を定量する検査法と、そのために必要なプローブ、プライマー、濃度標準核酸も提供される。

牛乳房炎は、酪農業界にとっては、毎年大きな経済的損失を出す乳牛の疾病である。その根絶を目指して、検査法の整備が計画されているが、これまでのところ、細菌培養による検査法しか存在しない。そこにＤＮＡチップに代表される遺伝子検査が参入しようとした場合、その感度の高さが逆に問題になる。数個でもその存在が確認されただけで、即対策が必要な黄色ブドウ球菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのような菌種とは異なり、先述した大腸菌群（即ち、エンテロバクテリア科の菌）、ブドウ球菌、連鎖球菌は、少ない菌数の感染ならば問題にならないことが多い常在菌である。よって、高感度の遺伝子検査では、ある程度の菌量までは切り捨てて、必要な濃度以上を陽性と判定する感度調整（足切り）が必要になる。

この牛乳房炎の原因菌３菌種に対して、当該核酸の定量方法を適用することも可能である。牛乳房炎場合は、対象になる数値は既存の検査法である細菌培養法の結果であるＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍＬという数値を参考にするしかない。この数値は、１ｍＬの検体を培養したら、何個のコロニーが形成されるというものである。しかしながら、実際の１コロニーが１細胞に由来するとは限らないし、検体中にはコロニーを形成できないような生菌も含まれている。従って、ＣＦＵ／ｍＬは、あくまでも目安の数字と考えてよい。従って、遺伝子検査の対象としては、細菌のゲノムだけではなく、１細胞中に数コピー含まれているために観察のしやすい１６Ｓ ｒＲＮＡを標的鋳型核酸として使用することも好ましい。例えば、これらの３種類の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを標的鋳型核酸として選択し、プライマーおよび濃度標準核酸を設計して当該定量方法を行うことが可能である。また更に、実際の臨床症状と照らし合わせて、足切りラインを決定することも可能である。

大腸菌群、ブドウ球菌および連鎖球菌の定量のために使用できるプライマーの例を表２に示す。

大腸菌群のゲノムを使っての定量については、結果は大腸菌全体の総数を示すものである。一方の１６Ｓ ｒＲＮＡを標的鋳型核酸とした大腸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌の検出は、１６Ｓ ｒＲＮＡが１細胞内に数コピー存在しているので、検出量が菌数になるものではない。菌数を得るためには、検出量を１細胞内のコピー数で割ればよい。

表３に、上記の３つの菌を検出するための核酸プローブの例を示す。

表４に上記の３つの菌を定量するための標的鋳型核酸と濃度標準核酸の例を示す。

表４−１の（１）（ａ）には、エンテロバクテリア科の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのための配列番号６０で示される標的鋳型核酸の例を示した。また、そこには、その配列におけるＬＡＭＰプライマーセットのためのＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＬＢｃ領域を四角で示した。表４−１の（１）（ｂ）および（ｃ）には、配列番号６０と一緒に使用するための濃度標準核酸１（配列番号６１）と濃度標準核酸２（配列番号６２）をそれぞれ示し、更にＬＡＭＰプライマーセットのための各領域を四角で示した。

表４−２の（２）（ａ）には、エンテロバクテリア科の菌のｒｐｏＡのための配列番号６３で示される標的鋳型核酸の例を示した。また、そこには、その配列におけるＬＡＭＰプライマーセットのためのＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＬＢｃ領域を四角で示した。表４−２の（２）（ｂ）および（ｃ）には、配列番号６３と一緒に使用するための濃度標準核酸１（配列番号６４）と濃度標準核酸２（配列番号６５）をそれぞれ示し、更にＬＡＭＰプライマーセットのための各領域を四角で示した。

表４−３の（３）（ａ）には、ブドウ球菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのための配列番号６６で示される標的鋳型核酸の例を示した。また、そこには、その配列におけるＬＡＭＰプライマーセットのためのＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＬＢｃ領域を四角で示した。表４−３の（３）（ｂ）および（ｃ）並びに表４−４の（ｄ）には、配列番号６６と一緒に使用するための濃度標準核酸１（配列番号６７）、濃度標準核酸２（配列番号６８）および濃度標準核酸３（配列番号６９）をそれぞれ示し、更にＬＡＭＰプライマーセットのための各領域を四角で示した。

表４−４の（４）の（ａ）には、連鎖球菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのための配列番号７０で示される標的鋳型核酸の例を示した。また、そこには、その配列におけるＬＡＭＰプライマーセットのためのＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＬＢｃ領域を四角で示した。表４−４の（４）（ｂ）並びに表４−５の（ｃ）および（ｄ）には、配列番号７０と一緒に使用するための濃度標準核酸１（配列番号７１）、濃度標準核酸２（配列番号７２）および濃度標準核酸３（配列番号７３）をそれぞれ示し、更にＬＡＭＰプライマーセットのための各領域を四角で示した。

それぞれの菌の定量のために、これらの標的鋳型核酸と濃度標準核酸との組み合わせを使用することが可能である。また、これらの標的鋳型核酸および濃度標準核酸は、上記の各表において示されたＬＡＭＰプライマーセットのための各領域と上述したプローブ結合領域とを含むように設計されればよい。従って、各表に示された配列よりも長い配列であってもよく、短い配列であってもよい。また、プローブ結合領域の配列も表４−１〜表４−５に示される濃度標準核酸に限定されるものではなく、上述の表１に示されるプローブ結合領域の候補配列などを使用することも可能である。また、当業者であれば、表１に示されるプローブ結合領域の候補配列を参考にすることにより、適切な長さと適切なＴｍ値を有し、且つオリジナルの配列とハイブリダイゼーションにより判別可能な配列を、適宜、設計することが可能であり、そのような配列についても本実施形態においてプローブ結合領域の配列として置き換えて使用されてよい。

例えば、牛における乳房炎の検査は次のように行うことが可能である。検査対象となるサンプルは、牛の乳汁（ミルク）であってよい。採取された乳汁から、病原体の遺伝子を抽出する方法は、例えばＦＡＳＴ−ＩＤ ＤＮＡ抽出キット（日本認証サービス株式会社製）などの市販のキットを選択することができるが、それらに特に限定するものではない。抽出された病原体のゲノムは、ＴＥバッファーなどの一般的な緩衝液に溶解した状態で得られる。すぐに検査に供さない場合は、−２０℃以下の環境で保存すればよい。

抽出されたゲノムは、次にＬＡＭＰ反応によって必要な増幅を行う。このとき、定量に必要な競合反応だけでなく、通常の菌特異的なＬＡＭＰ反応も同時に行われてよい。これにより、特定の菌の定性試験を同時に行うことが可能である。例えば、特定の菌が存在する場合には結果は陽性となり、特定の菌が存在しない場合には結果は陰性となる。この試験は、陽性−陰性試験とも称される検査である。牛乳房炎に関連する前述の３種の原因菌を検査するためのＬＡＭＰ増幅を行うための複数の容器を備えた容器セットの１例を図６に示す。図６（ａ）は、大腸菌群用とブドウ球菌用の反応容器、即ち、反応環境である。容器（１）は、大腸菌群の定性試験用容器であり、容器（２）、（３）および（４）は、大腸菌群の定量用容器である。容器（５）はブドウ球菌の定性試験用容器であり、容器（６）、（７）および（８）は、ブドウ球菌の定量用容器である。図６（ｂ）は、連鎖球菌用の反応容器と、他の菌の定性試験用の反応容器と、コントロール用の反応容器を含む。容器（９）は、連鎖球菌の定性試験用容器であり、容器（１０）、（１１）および（１２）は、連鎖球菌の定量用容器である。容器（１３）および（１４）は、それぞれ単数または複数の任意の菌を増幅するための反応容器である。容器（１５）および（１６）はコントロール用の容器である。各定量用の容器にはそれぞれ３種類の異なる濃度に調製された３種類の濃度標準核酸を添加する。このように複数の容器を備える容器セットは、同じ条件で増幅反応を行うことが用意であるので好ましい。このような容器セットにおいて同時に使用されるプライマーセットの設計は、反応の至適温度が同じ温度になるように行うことが好ましい。

定性試験用のプライマーセットは、検出されるべき特定の菌種の核酸を特異的に増幅することが可能なプライマーセットであればよい。定量検査と同じ温度が反応の至適温度であり、反応開始時間もほぼ同じ増幅反応を採用することが好ましい。

当該３種類の菌以外の菌も上記容器（１３）および（１４）において、定性用に増幅してもよい。また更に、更なる反応容器を用意して、容器セットに含ませてもよい。例えば、マイコプラズマ、コリネバクテリウム、緑膿菌、酵母様真菌および／またはカンジダなどの定性検査を大腸菌群、ブドウ球菌および連鎖球菌の定量および定性試験と同時に行ってもよい。必要に応じて、それらの追加菌種に対しても、定量検査を行うための容器を容器セットに搭載してもよい。

容器セットにおける増幅は、次のように行ってもよい。それぞれの容器に、予め作製したＬＡＭＰ反応液と、乳汁から抽出したゲノム核酸を標的鋳型核酸として添加する。このときに、定量用の容器には、濃度標準核酸も添加する。乳汁から抽出したゲノム核酸は、必要であれば予め熱変性を加えてもよい。熱変性の条件は、８０℃〜９５℃の温度で１〜５分間程度でよいが、これに限定するものではない。熱変性の後、サンプルを氷上に移して急冷の工程を加えることも好ましい。

反応液の組成の例を以下に示す。

・ＬＡＭＰ反応液組成
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ_４
１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰｓ。

この組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込めばよい。

・ｐｒｉｍｅｒ 添加量
ＦＩＰ ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰ ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３ ５ｐｍｏＬ
Ｂ３ ５ｐｍｏＬ
Ｌｏｏｐ ２０ｐｍｏＬ。

さらに、総量２５μＬにて反応を行う際には、酵素液として、例えばＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを、１〜２μＬ（８ｕｎｉｔ／ｕＬ）で添加する。増幅のための酵素はＢｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに限定されるものではなく、鎖置換活性を有する酵素であれば、他の酵素が使用されてもよい。また、標的鋳型核酸がＲＮＡの場合には、この酵素液に逆転写酵素を加えればよい。

反応液と鋳型を混合した液を、ＰＣＲチューブに入れて反応を開始する。反応温度は、使用する酵素や標的鋳型核酸の特性によって至適とされるところは変わるので、適宜選択すればよい。例えば、概ね５９℃〜６６℃の範囲内で選ばれることが多く、ここにおいてもこの範囲であってもよい。反応装置は、通常のＬＡＭＰ反応の検出に使用される濁度測定装置であってもよく、通常のＰＣＲに使用するサーマルサイクラーであってもよい。反応時間は、使用するプライマーの特性によって変わるので、適宜選択すればよい。例えば、３０分〜６０分の間で選ばれることが多く、ここにおいてもこの範囲であってもよい。濃度の異なる２種類の鋳型を混在させて競合的ＬＡＭＰ反応を行うことは個々において初めてなされることである。しかしながら、このような反応条件であっても、反応時間を長くすることにより、混在している量の少ない方の鋳型が増幅する現象は確認されなかった。

検出手段は、ＤＮＡチップなどの不溶性基盤上にＤＮＡ断片が核酸プローブとして固定化されており、その相補配列同士が互いに結合するか否かを検出することにより、溶液内に存在する核酸断片の配列の一部を読み取る原理の測定法であればよい。例えば、マイクロタイタープレートやビーズのように、プローブ毎にハイブリ反応環境を変える必要のある基盤では、定性用の増幅産物は、それに適応した定性用の核酸プローブに反応させて、相補鎖を形成するかどうかを確認すればよい。定量用の増幅産物は、１つの競合して行った増幅反応による増幅産物を、標的鋳型核酸検出用の核酸プローブと濃度標準核酸検出用の核酸プローブとに同時に反応させることが好ましい。また、異なる容器内で行われたそれぞれの反応により得られた全ての反応産物を１つに合わせて、検出されるべき標的核酸に対応するように構成された複数種類の核酸プローブを１つの基体に固定化されたＤＮＡチップに対して添加することにより検出を行ってもよい。

牛乳房炎では、常在菌と病原菌とが共存して乳汁に存在する。従って、常在菌と病原菌とを識別して定量するために、菌量を指標にした足切りラインを決定することも好ましい。

足切りラインの決定は、まず、常在菌として大腸菌群、ブドウ球菌および連鎖球菌を含むサンプルと、病原体として大腸菌群、ブドウ球菌および連鎖球菌を含むサンプルについて、それらを常在菌または病原体として測り分けられる濃度標準核酸の量を決定することが必要である。

図７には、大腸菌群の陽性検体で、培養法で７００ｃｆｕ／ｍＬという数値を示した乳汁からの抽出産物について定量方法を行った結果の１例を示す。この場合、濃度標準核酸は、低い方で２ｅ＋０１ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎを持ち込み、高いほうで２ｅ＋０２ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎを持ち込んでいる。培養法での７００ｃｆｕ／ｍＬという結果は、本発明では２ｅ＋０１ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎの濃度標準核酸より持ち込みゲノム数が少ないということになる。もし、この菌量が、乳房炎原因菌としては問題視しないような低菌量とするならば、この菌は２ｅ＋０１ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎの濃度標準核酸を足切りラインとして、それ以下を陰性と判断すると定めることができる。ただし、培養法では１００ｃｆｕ／ｍＬという数値も出る。仮に、１００ｃｆｕ／ｍＬで切ったほうがいい菌に対しては、２ｅ＋０１ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎより少ない領域に足切りラインを引く必要ある。その場合、鋳型量が少なすぎてサンプリング誤差を生む可能性がある。従って、１細胞に１ゲノムしかないゲノム核酸を標的鋳型核酸にするのではなく、数コピー存在する１６ｓ ｒＲＮＡを標的鋳型核酸として使うことが好ましい。この核酸を用いれば、仮に１ｃｆｕ／ｍＬが足切りラインであっても、濃度標準核酸は１ｃｏｐｙ／ｍＬでなくても構わないことになる。ただし、多くの検体を経験することにより、より臨床的に意味のある足切りラインを菌種毎に設定することも可能である。

実施形態はまた、検体に存在する菌が常在菌であるか、病原菌であるかを判定するための基準、即ち、足切りラインを作製する方法を提供する。この方法により、偽陽性の判定を防止することが可能である。また、この足切りラインを作製する方法によって、特定の菌の検出するための手段、例えば、検出装置または検出方法における検出感度を調整することが可能である。

また更に実施形態は、検体中に含まれる特定の菌が常在菌か、病原菌であるかの判断をするため方法を提供する。例えば、検体中に含まれる特定の菌が常在菌であるか否かを判定する方法は、
（ａ）核酸を含む検体を準備することと、
（ｂ）その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む標的鋳型配列を増幅するための第１のプライマーと第２のプライマーとを含むプライマーセットであり、第１のプライマーが、５’末端側にＦ１に相補的なＦ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＦ２に同じＦ２配列を有するＦＩＰプライマーであり、第２のプライマーが５’末端側にＢ１ｃに同じＢ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＢ２ｃに相補的なＢ２配列を有するＢＩＰプライマーであるプライマーセットを準備することと、
（ｃ）第１の濃度標準核酸〜第３の濃度標準核酸を準備すること；ここで、第１の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第２のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番でそれぞれ含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番でそれぞれ含み、第２の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第３のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番でそれぞれ含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番でそれぞれ含み、第３の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第４のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番でそれぞれ含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番でそれぞれ含む、
（ｄ）予め低濃度であると定めた濃度の第１の濃度標準核酸、予め中程度濃度であると定めた濃度の第２の濃度標準核酸、および予め高濃度であると定めた濃度の第３の濃度標準核酸を、前記濃度標準核酸の種類毎に第１〜第３の反応環境内に、前記検体と、前記プライマーセットと共にそれぞれ持ち込み、ＬＡＭＰ法により増幅反応をそれぞれ行って、増幅産物をそれぞれ得ることと、
（ｅ）前記第１〜第３の反応環境内で得られた第１〜第３の増幅産物を１つに合わせることと、
（ｆ）基体に固定化された第１〜第４の核酸プローブと、（ｅ）で得られた前記合わせられた増幅産物とを反応させること；ここで、前記第１の核酸プローブは、当該基体の第１の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第１のプローブ結合領域を含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的であり、前記第２の核酸プローブは、前記基体の第２の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第２のプローブ結合領域を含む第２の標的配列またはその相補配列に相補的であり、第３の核酸プローブは、当該基体の第３の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第３のプローブ結合領域を含む第３の標的配列またはその相補配列に相補的であり、第４の核酸プローブは、当該基体の第４の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第４のプローブ結合領域を含む第４の標的配列またはその相補配列に相補的である、
（ｇ）（ｆ）において生じた第１〜第４の核酸プローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーション量をそれぞれ検出し、互いに比較することにより、検体に含まれる特定の核酸を定量することと、
を含む。

検体中に含まれる菌が常在菌か、病原菌であるかの判断は、例えば、（ｇ）において定量された当該菌量が、低菌量であると判定された場合に、常在菌であると判定されてよい。或いは、（ｇ）において定量された当該菌量が、低菌量または中程度の菌量であると判定された場合に、常在菌であると判定されてよい。この場合、低菌量または中程度の菌量を、予め定めた基準値、即ち、足切りラインとして設定すればよい。

特定の濃度を、予め低濃度であると定める、予め中程度濃度であると定める、または予め高濃度であると定めるための方法として、例えば、それ自身公知の方法、例えば、培養法、Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法（Fluorescence in situ Hybridization法）および各種細菌カウンターを利用する方法などが利用されてよい。培養法とは、サンプルを培地に塗布して培養し、生成したコロニー数を元のサンプル濃度に換算することにより菌量を決定する方法である。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ法とは、ＰＣＲ法を利用した核酸定量法であり、濃度標準核酸との増幅立ち上がり時間との比較により菌量を決定する方法である。ＦＩＳＨ法とは、核酸定量法の一種であるが、ＦＩＴＣまたはＣＹ３により蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズすることで信号をカウントすることにより菌量を決定する方法である。その他の各種細菌カウンターを利用する方法とは、各メーカーによって独自に開発された種々のマーカーを用いて、そのマーカーが示す信号をカウントすることにより菌量を決定する方法である。

或いは、特定の検体に含まれる特定の菌が、この範囲であれば常在菌であると判断するための数値が具体的に示されているものに関しては、そのような数値を足切りラインとしてもよい。その場合、そのような数値で表される菌量を、当該判別方法の低菌量または中程度の菌量と定め、濃度基準核酸を準備し、競合的な増幅反応に用いればよい。そのような数値は、例えば、ヒトが一日に排泄する糞便における常在菌としての大腸菌群の量について公知であり、その菌量は、平均で１０^１１から１０^１３個であるであると言われている。

このような検体中に含まれる菌が常在菌か、病原菌であるかの判断を行う方法は、それ自身公知の定性試験法、および／またはより精度の高い定性および／または定量試験法と併用して用いられてよい。それにより、更に精密に試験されるべき菌を特定することが可能である。

［例］
［例１］
大腸菌の標準株（ＡＴＣＣ： ２５９２２）のｒｐｏＡ遺伝子をクローン化したもの（配列番号６３）を陽性コントロールとして使用し、１種類の濃度標準核酸（配列番号６４）との競合反応を行って、ＤＮＡチップで検出した。その結果を図８に示す。上段の図８（ａ）〜（ｃ）のグラフには、それぞれの反応に添加した陽性コントロールのコピー数と濃度標準核酸のコピー数を図示する。下段の図８（ｄ）〜（ｆ）のグラフには、それぞれの競合増幅反応により得られた増幅産物の量をＤＮＡチップにより測定した結果を示す。これらの結果から、添加した濃度標準核酸のコピー数の大きさに応じて、増幅産物が生成されていることが確認できた。

［例２］
（１）大腸菌群、ブドウ球菌、連鎖球菌の定量のための標的鋳型核酸
大腸菌群のための標的鋳型核酸（配列番号６０）、ブドウ球菌のための標的鋳型核酸（配列番号６６）、連鎖球菌のための標的鋳型核酸（配列番号７０）を選択した。

（２）大腸菌群、ブドウ球菌、連鎖球菌の定量のための核酸プローブおよびプライマーの設計
大腸菌群、ブドウ球菌および連鎖球菌の定量のためのプライマーセットおよび核酸プローブを設計した。設計されたプライマーセットを表２に、核酸プローブを表３に示す。全ての核酸プローブは、１つのＤＮＡチップに固定化されたものを使用した。

（３）大腸菌群、ブドウ球菌、連鎖球菌の定量のための濃度標準核酸
上記（１）および（２）の配列に基づいて、大腸菌群のための濃度標準核酸１（配列番号６１）および濃度標準核酸２（配列番号６２）、ブドウ球菌のための濃度標準核酸１（配列番号６７）および濃度標準核酸２（配列番号６８）、連鎖球菌のための濃度標準核酸１（配列番号７１）および濃度標準核酸２（配列番号７２）を設計し、これらを用意した。

（４）牛乳房炎原因菌である大腸菌、ブドウ球菌、連鎖球菌における、乳房炎発症牛の乳汁での細菌培養検査結果とＤＮＡチップによる定量結果の比較について
乳房炎原因菌の３菌種について実施形態の定量方法を行った。更に、それにより得られた結果と、細菌培養を利用する定量法により得られる結果とを比較した。

材料
北海道十勝地方のＡ農場で乳房炎を発症した牛から絞った乳汁を、そのまま冷蔵保存状態で東京近郊の実験施設に輸送し、採取した翌日から細菌培養検査を開始した。同じ乳汁は、培養検査開始からさらに１日間長く冷蔵状態で保管されたあと、ＤＮＡチップ検査に供した。

核酸抽出法
乳汁からの核酸抽出は、ＦＡＳＴ−ＩＤ ＤＮＡ抽出キット（日本認証サービス株式会社製）の推奨方法に、固形物及び脂肪分、菌の外殻を破壊する目的でビーズビーティング処理を追加し、さらにタンパク質と脂質をさらに除去する目的で、硫酸アンモニウムと酢酸による沈殿処理を追加して行った。乳汁は、１検査あたり、２００μＬ〜４００μＬを使用し、抽出後の核酸は、６０μＬのＴＥ緩衝液に溶解した。抽出後のサンプルは、その後の増幅反応に供するまで、−２０℃にて保管された。

ＬＡＭＰ増幅反応
ＬＡＭＰ反応組成は、下記の通りであった。

・ＬＡＭＰ反応液組成
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ_４
１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰｓ
Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ８ｕｎｉｔ。

この組成の反応液に、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んだ。

・ｐｒｉｍｅｒ 添加量
ＦＩＰ ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰ ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３ ５ｐｍｏＬ
Ｂ３ ５ｐｍｏＬ
Ｌｏｏｐ ２０ｐｍｏＬ。

以上の組成で、２５μＬの反応スケールで反応を行った。抽出産物は、熱処理を施したものをそれぞれの反応チューブに２μＬずつ添加し、濃度標準核酸は１ｅ＋０１ｃｏｐｙ／μＬのものと１ｅ＋０２ｃｏｐｙ／μＬに希釈したものを、それぞれ２μＬずつ添加した。反応は６１℃にて１時間行った。

ＤＮＡチップ測定
ＤＮＡチップは、表３に記載した核酸プローブを種類毎に固相したものを用いて、増幅産物を１反応あたり２μＬずつ添加して測定した。

測定装置は、ジェネライザー２Ｃ６００装置を用いた。反応条件を表５に示す。

結果
測定結果は、図９に示した。それぞれの菌種毎に、ＤＮＡチップで陽性と判定された検体の中から、培養法での結果が高菌濃度と判定されたものと、陰性と判定されたものを１例ずつ選択した。各菌種とも、培養陰性となったものは、ＤＮＡチップでも標的鋳型核酸に対応したプローブの電流値が上がらず、２濃度の濃度標準核酸は両方とも電流値が上がっていた。これらは、定性のＤＮＡチップ検査では陽性となったが、菌量が少ないと判定されるため足切り対象となる。一方、培養法で高菌量と判定された検体でのＤＮＡチップの結果は標的鋳型核酸に対応したプローブの電流値だけが上昇し、２濃度の濃度標準核酸は両方とも電流値が上がらなかった。これらの検体は、培養法の結果と合致して、菌量が多かったと判定された。

［例３］
牛乳房炎原因菌の定性検査と、ブドウ球菌、連鎖球菌の定量検査を１チップ上での同時検査
牛乳房炎の乳汁中に含まれる他の原因菌の有り無しを調べる定性検査では、多くのＬＡＭＰ産物を一度に集めて１チップ上で検査を行う必要がある。そのようなチップに対して、更に、定量用のＬＡＭＰ産物を添加しても、定性検査および定量検査の両検査の結果に支障があるか否かについて試験した。

材料および核酸抽出法
材料および核酸抽出法は、例２と同じものを使用した。

ＬＡＭＰ増幅
定量用の増幅は、例２と同じ条件により行った。定性用のプライマーは、ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、Ｓｔｒｅｏｔｐｃｐｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ科、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｃｏｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ、緑膿菌、Ｃａｎｄｉｄａのそれぞれについて、特異的に増幅するプライマーを選択し、それぞれ個別の反応チューブ内で増幅した。使用されたプライマーは上述の表２に示した通りである。

・ＤＮＡチップ測定
ＤＮＡチップとして、図１０に示す流路を反応部として備える装置を使用した。図１０（ａ）は、ＤＮＡチップ８０の平面図であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）のＤＮＡチップ８０の線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。ＤＮＡチップ８０は、支持体８１と、被覆体８２と、流路８３と、核酸プローブ８５とを備える。流路８３は、支持体８１の１つの面と被覆体８２の１つの面に形成された凹部とにより規定される。流路８３は、対向する部分が互いに平行な波線状である。流路８３は、一方の端部から他方の端部に向う流れ方向を有する。被覆体８２は、流路８３内の液体を密封するように支持体８１に対して密着して配置されている。

複数のプローブ固定化領域８４は、流路８３の流れ方向に沿って、流路８３の底面に配置されている。複数のプローブ固定化領域５のそれぞれには、互いに異なる目的配列にハイブリダイズするように構成された複数種類のプローブ核酸８５がそれぞれ固定化されている。複数のプローブ固定化領域８４にそれぞれ固定されたプローブ核酸８５と増幅産物とのハイブリダイゼーションが、それぞれ独立して行われるように、プローブ固定化領域５は配置されている。流路８３へのサンプルの添加は、流入口８６から行った。サンプルの排出は、流出口８７から行った。従って、流入口８６が、流路８３の上流であり、流出口８７が流路８３の下流である。

プローブ固定化領域８４に固定化されるブドウ球菌および連鎖球菌を定量するための核酸プローブを表３に示した。また、大腸菌、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ、藻類、緑膿菌および酵母様真菌を定性するために、これらに特異的な配列を有するように設計された核酸プローブを用意した。更に、ブドウ球菌および連鎖球菌を定性するために、これらの菌を特異的に検出するための核酸プローブを用意した。コントロールのために結核菌、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）キメラおよびＨＰＶからの配列を特異的に検出するための核酸プローブを用意した。

流路８３の上流に定性試験用の核酸プローブを固定化した。その下流にブドウ球菌および連鎖球菌の定量用プローブを固定化した。その下流に、陽性コントロール（結核菌＋ＨＢＶキメラ；図１１中「p」で示す）と陰性コントロール（ＨＢＶ；図１１中「n」で示す）のための核酸プローブを固定化した。陽性コントロールとは、陽性の場合のＬＡＭＰ増幅の正常性とＤＮＡチップ測定の正常性を確認する目的で添加し、陰性コントロールとはＤＮＡチップ測定における非特異反応の有無を確認する目的で添加した。

・結果
同様に測定した２例の結果を図１１に示す。（Ａ）のグラフを得るための試験において使用した検体についての結果を説明する。（Ａ）のグラフに示す定性試験の結果では、ブドウ球菌陽性、連鎖球菌も陽性であった（図１１（Ａ）の「ブドウ」および「連鎖球菌」のカラムを参照されたい）。（Ａ）のグラフに示す定量試験の結果からは、ブドウ球菌は、両方の濃度標準核酸（Ｃ１、Ｃ３）が電流値増加なく、標的鋳型核酸（Ｔ）だけが増加していた（図１１（Ａ）の「CNS comp」を参照されたい）。従って、高菌量と判定された。連鎖球菌は、標的鋳型核酸（Ｔ）と高濃度の濃度標準核酸（Ｃ１０）の電流値が上がっていることから、中程度の菌量であったと判定された（図１１（Ａ）の「Strept comp」を参照されたい）。したがって、（Ａ）のグラフを得るための試験において使用した検体は足切り対象にはならないと判定した。

一方の（Ｂ）のグラフを得るための試験において使用した検体は、定性試験の結果では、ブドウ球菌陽性、連鎖球菌も陽性となっていた。（Ｂ）のグラフに示す定量試験の結果では、ブドウ球菌は、標的鋳型核酸（Ｔ）と高濃度の濃度標準核酸（Ｃ３）の電流値が上がっていた（図１１（Ｂ）の「CNS comp」を参照されたい）。従って、ブドウ球菌は、中程度の菌量であったと判定された。連鎖球菌は、濃度標準核酸（Ｃ９、Ｃ１０）の電流値だけが上昇し、標的鋳型核酸（Ｔ）が上昇していないことから、低菌量であると判定された（図１１（Ｂ）の「Strept comp」を参照されたい）。したがって、（Ｂ）のサンプルは連鎖球菌に関して足切り対象にすべきであると判定した。

［例４］足切りの効果について
牛乳房炎原因菌の検査において、試験結果の足切りをすることによる検出手段の感度調整を行うことの意義を実際の検体に関する結果を集計して調べた。

材料、核酸抽出法およびＬＡＭＰ増幅についての詳細は、例２および３に記載のものと同様である。

結果
牛４頭に関して、４分房それぞれから採取した乳汁から、培養検査の結果と同じサンプルによるＤＮＡチップ検査（フィールド試験２−１；ＦＴ２−１）の結果と、３ヶ月後に同じ牛から再度採取した乳汁からのＤＮＡチップ検査（フィールド試験２−２；ＦＴ２−２）の結果を示した（表６−１〜表６−６）。

ＤＮＡチップ検査の検出結果の表記のうち、「白丸」は陽性と判定されたものを示す。ＦＴ２−１とＦＴ２−２により得られた結果を示す各表において、最右の２項目に定量試験の結果を「Ｌ」、「Ｍ」および「Ｈ」の記号により示した。「Ｌ」は低菌量であり、「Ｍ」は中程度の菌量であり、「Ｈ」は高菌量を示す。ＦＴ２−１と２−２の両方において、ＣＮＳ（ブドウ球菌）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（共に連鎖球菌）の欄が、陽性率が高かった。これに対して、培養法の結果が特に連鎖球菌では陽性がほとんどなく、培養結果とＤＮＡチップ検査の結果が乖離していることが分かった。これは、培養法が、常在菌のような菌量の少ない菌を陽性と判定しない程度の感度であるのに対して、ＤＮＡチップが過剰に高感度であることが原因であると考えた。これらの結果に加えて、更に、実施形態に従う定量方法により得られた結果を考慮すると、「Ｌ」と示された低菌量で存在する菌は、常在菌であると判定されるべきであり、従って、足切り対象であると判定できた。このように足切りを行うことで、陽性率が低く抑えられ、偽陽性の結果が生じることを予防できる。更に、「Ｍ」と示された中程度の菌量で存在する菌も、ブドウ球菌においては足切り対象に入れてもよいと思われた。一方の連鎖球菌については、「Ｌ」と示された低菌量で存在する菌について、足切りを行って、対象を陰性と判定することにより、陽性率が低く抑えられることがわかった。

更に、ＦＴ２−１において使用したＤＮＡチップと同様のＤＮＡチップを用いて、上記の方法と同様の方法により、複数の菌の検出を行った。また、同時に、大腸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌について例２と同様の方法により定量を行った。それにより得られた検出結果について、足切りを行う前と足切りを行った後のデータを得て、それらを比較した。その結果を図１２Ａに示す。また、図１２Ａの一部を拡大した図を図１２Ｂに示す。

図１２Ｂにおいて、大腸菌については、低菌量で存在する菌を足切りの対象とした。ブドウ球菌については、中菌量で存在する菌および低菌量で存在する菌を足切りの対象とした。連鎖球菌については、低菌量で存在する菌について足切りの対象とした。

図１２ＡおよびＢでは、陽性の結果を黒丸で示している。図１２Ａに示すように、足切り前には、検査された検体中のほとんどにおいて、大腸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌は陽性の結果となっていた。しかしながら、実施形態の定量法により菌量を定量し、予め設定した菌量を閾値（または基準値）として足切りをすることにより、真に菌量の多い検体だけを陽性と判定することが可能になった。

以上のことから、常在菌が存在するような疾患の高感度遺伝子検査においては、定量することが不可欠であることが確認された。偽陽性を排除することを可能にすることにより、常在菌であるか否かを判定し、病原菌のみをより精度よく検出することが可能となる。

Claims (11)

1. 検体中に含まれる特定の核酸を定量する方法であって、
   （ａ）核酸を含む検体を準備することと、
   （ｂ）その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む、第１の標的鋳型配列を増幅するための第１のプライマーと第２のプライマーとを含むプライマーセットであり、前記第１のプライマーが、５’末端側にＦ１に相補的なＦ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＦ２に同じＦ２配列を有するＦＩＰプライマーであり、前記第２のプライマーが５’末端側にＢ１ｃに同じＢ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＢ２ｃに相補的なＢ２配列を有するＢＩＰプライマーであるプライマーセットを準備することと、
   （ｃ）第１の濃度標準核酸〜第ｎの濃度標準核酸を準備することと；ここで、ｎは、２以上の整数であり、前記第１の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、前記第１のプローブ結合領域とは配列が異なる第２ _１ のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番で含み、第ｎの濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第２ _ｎ のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番でそれぞれ含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番でそれぞれ含み、
   （ｄ）互いに異なる濃度である第１〜第ｎの濃度をそれぞれ有する前記第１〜第ｎの濃度標準核酸を１種類ずつを、前記検体と、前記プライマーセットとともに第１〜第ｎの反応環境内に持ち込み、前記第１〜第ｎの反応環境のそれぞれにおいてＬＡＭＰ法により増幅反応を行って第１〜第ｎの増幅産物を得ることと；ここで、前記各第１〜第ｎの反応環境において前記第１の標的鋳型配列の増幅と前記濃度標準核酸の増幅とは競合的に行われ、前記第１の標的鋳型配列及び前記濃度標準核酸のうち、より多く存在する方が優先的に増幅される、
   （ｅ）前記第１〜第ｎの増幅産物を一つに併せることと、
   （ｆ）基体の第１の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第１のプローブ結合領域を含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的な第１の核酸プローブと、前記基体の第２ _１ 〜第２ _ｎ の固定化領域にそれぞれ固定化され、前記Ｆ２領域および第２ _１ 〜第２ _ｎ のプローブ結合領域をそれぞれ含む第２ _１ 〜第２ _ｎ の標的配列またはその相補配列に相補的な第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブと、前記（ｅ）で得られた前記併せた増幅産物とを反応させることと、
   （ｇ）前記（ｆ）において生じた第１および第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブのそれぞれについてのハイブリダイズ信号をそれぞれ検出し、
   （１）前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの全ての前記ハイブリダイズ信号が、前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の２倍以上である場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記第１〜第ｎの濃度のうち最も低い濃度以下であると判定し、
   （２）前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの中で、前記ハイブリダイズ信号が、前記全ての核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号のうち最も小さいものの２倍以上である（以下、「ハイブリダイズ信号が多い」と記す）ものと、前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満であるものとが両方存在する場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記ハイブリダイズ信号が多い前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの前記第１〜第ｎの濃度のうち最も低い濃度と同じ濃度であると判定し、
   （３）前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの全ての前記ハイブリダイズ信号が、前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満である場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記第１〜第ｎの濃度のうち最も高い濃度以上であると判定する
   ことにより前記検体に含まれる特定の核酸を半定量することと、
   を含む方法。
2. 前記プライマーセットが、更に、前記Ｆ３領域に同じＦ３配列を有するＦ３プライマー、前記Ｂ３ｃ領域に相補的なＢ３配列を有するＢ３プライマー、前記ＬＢｃ領域に同じＬＢｃ配列をもつＬＢｃプライマーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される更なるプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
3. 検体中に含まれる複数種類の特定の核酸を定量する方法であって、
   （ａ）核酸を含む検体を準備することと、
   （ｂ）前記特定の核酸について種類毎に標的鋳型配列を設計し、全ての標的鋳型配列について以下の（ｉ）〜（iii）を行うことと；
   ここで、前記標的鋳型配列は、その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む、
   （ｉ）当該標的鋳型配列を増幅するための第１のプライマーと第２のプライマーとを含むプライマーセットを準備することであり、前記第１のプライマーが、５’末端側にＦ１に相補的なＦ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＦ２に同じＦ２配列を有するＦＩＰプライマーであり、前記第２のプライマーが５’末端側にＢ１ｃに同じＢ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＢ２ｃに相補的なＢ２ｃ配列を有するＢＩＰプライマーであるプライマーセットを準備することと、
   （ii）その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域とは配列が異なり且つ互いに配列の異なる第２_１〜第２_ｎのプローブ結合領域のうちの何れか１つの領域、およびＦ１領域をこの順番でそれぞれ含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域、およびＢ１ｃ領域をこの順番でそれぞれ含む第１の濃度標準核酸〜第ｎの濃度標準核酸を準備することと、ここで、ｎは２以上の整数である、
   （iii）互いに異なる濃度である第１〜第ｎの濃度をそれぞれ有する前記第１〜第ｎの濃度標準核酸を、前記濃度標準核酸の種類毎に第１〜第ｎの反応環境内に、前記検体と、前記プライマーセットと共にそれぞれ持ち込み、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行って第１〜第ｎの増幅産物をそれぞれ得ることと；ここで、前記各第１〜第ｎの反応環境において前記第１の標的鋳型配列の増幅と前記濃度標準核酸の増幅とは競合的に行われ、前記第１の標的鋳型配列及び前記濃度標準核酸のうち、より多く存在する方が増幅される、
   （iV）第１の核酸プローブと、第２_１の核酸プローブ〜第２_ｎの核酸プローブとを準備することと；ここで、第１の核酸プローブは、前記Ｆ２領域および第１のプローブ結合領域を含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的であり、前記第２_１の核酸プローブは、前記Ｆ２領域および第２_１のプローブ結合領域を含む第２_１の標的配列またはその相補配列に相補的であり、前記第２_ｎの核酸プローブは、前記Ｆ２領域および第２_ｎのプローブ結合領域を含む第２_ｎの標的配列またはその相補配列に相補的である、
   （ｃ）前記全ての標的鋳型配列について準備された当該核酸プローブを１つの基体に種類毎に固定化することにより、ＤＮＡチップを準備することと、
   （ｄ）前記全ての標的鋳型配列について行われた各増幅反応によって得られた全増幅産物を１つに合わせて増幅産物混合物を得ることと、
   （ｅ）（ｃ）で準備されたＤＮＡチップに含まれる当該核酸プローブに対して、（ｄ）で得られた前記増幅産物混合物を反応させることと、
   （ｆ）（ｅ）の反応により生じたそれぞれのハイブリダイズ信号を検出し、当該核酸プローブ毎にハイブリダイズ信号の有無および／または大きさを得ることと、
   （ｇ）前記標的鋳型配列毎に、
   （１）前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの全ての前記ハイブリダイズ信号が、前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の２倍以上である場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記第１〜第ｎの濃度のうち最も低い濃度以下の濃度であると判定し、
   （２）前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの中で、前記ハイブリダイズ信号が、前記全ての核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号のうち最も小さいものの２倍以上である（以下、「ハイブリダイズ信号が多い」と記す）ものと、前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満であるものとが両方存在する場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記ハイブリダイズ信号が多い前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの前記第１〜第ｎの濃度のうち最も低い濃度と同じ濃度であると判定し、
   （３）前記第２ _１ 〜第２ _ｎ の核酸プローブの全ての前記ハイブリダイズ信号が、前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満である場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記第１〜第ｎの濃度のうち最も高い濃度以上の濃度であると判定する
   ことにより種類毎に当該特定の核酸の前記検体中の量を半定量することと、
   を含む方法。
4. 前記特定の核酸について種類毎に、前記プライマーセットが、更に、前記Ｆ３領域に同じＦ３配列を有するＦ３プライマー、前記Ｂ３ｃ領域に相補的なＢ３配列を有するＢ３プライマー、前記ＬＢｃ領域に同じＬＢｃ配列をもつＬＢｃプライマーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される更なるプライマーを含む、請求項３に記載の方法。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、前記特定の核酸が、エンテロバクテリア科、ブドウ球菌および／または連鎖球菌に由来する核酸を含み、前記プライマーセットが、
   （１）エンテロバクテリア科の菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号２３により示される第１のプライマーと、配列番号２４で示される第２のプライマーと、配列番号２１で示される第３のプライマーと、配列番号２２で示される第４のプライマーと、配列番号２５で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；
   （２）エンテロバクテリア科の菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号２８により示される第１のプライマーと、配列番号２９で示される第２のプライマーと、配列番号２６で示される第３のプライマーと、配列番号２７で示される第４のプライマーと、配列番号３０で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；
   （３）ブドウ球菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号３２により示される第１のプライマーと、配列番号３３で示される第２のプライマーと、配列番号３１で示される第３のプライマーと、配列番号３４で示される第４のプライマーと、配列番号３５で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；および／または
   （４）連鎖球菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号３８により示される第１のプライマーと、配列番号３９または配列番号４０で示される第２のプライマーと、配列番号３６で示される第３のプライマーと、配列番号３７で示される第４のプライマーと、配列番号４１または配列番号４２で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；
   を含み、
   前記濃度標準核酸が、
   （１’）エンテロバクテリア科の菌のための濃度標準核酸であり、配列番号６１および配列番号６２によりそれぞれ示される第１の濃度標準核酸セットから少なくとも１つ選択された第１の濃度標準核酸；
   （２’）ブドウ球菌のための濃度標準核酸であり、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９によりそれぞれ示される第２の濃度標準核酸セットから少なくとも１つ選択された第２の濃度標準核酸；および／または
   （３’）連鎖球菌に由来する濃度標準核酸であり、配列番号７１、配列番号７２および配列番号７２によりそれぞれ示される第３の濃度標準核酸セットから少なくとも１つ選択される第３の濃度標準核酸；
   を含み、
   前記核酸プローブが、
   （１’’）エンテロバクテリア科の菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；
   （２’’）エンテロバクテリア科の菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；
   （３’’）ブドウ球菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；および／または
   （４’’）連鎖球菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号５６、配列番号６７、配列番号５８および配列番号５９でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；
   を含む方法。
6. 請求項１に記載の方法に使用するためのアッセイキットであって、
   （ａ）その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む標的鋳型配列を増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットは、第１のプライマーと第２のプライマーとを含み、第１のプライマーが、５’末端側にＦ１に相補的なＦ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＦ２に同じＦ２配列を有するＦＩＰプライマーであり、第２のプライマーが５’末端側にＢ１ｃに同じＢ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＢ２ｃに相補的なＢ２配列を有するＢＩＰプライマーであるプライマーセットと、
   （ｂ）第１の濃度標準核酸〜第ｎの濃度標準核酸であり、前記第１の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第２_１のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番でそれぞれ含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番でそれぞれ含み、第ｎの濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第２_ｎのプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番でそれぞれ含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番でそれぞれ含み、ｎは２以上の整数である、第１の濃度標準核酸〜第ｎの濃度標準核酸と、
   （ｃ）基体と、前記基体に固定化された第１の核酸プローブおよび第２_１の核酸プローブ〜第２_ｎの核酸プローブとを具備するＤＮＡチップであり、前記第１の核酸プローブは、当該基体の第１の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第１のプローブ結合領域を含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的であり、前記第２_１の核酸プローブは、前記基体の第２_１の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第２_１のプローブ結合領域を含む第２_１の標的配列またはその相補配列に相補的であり、第２_ｎの核酸プローブは、当該基体の第２_ｎの固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第２_ｎのプローブ結合領域を含む第２_ｎの標的配列またはその相補配列に相補的である、ＤＮＡチップと、
   を含むアッセイキット。
7. 請求項５の方法に使用するためのアッセイキットであって、
   前記プライマーセットが、
   （１）エンテロバクテリア科の菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号２３により示される第１のプライマーと、配列番号２４で示される第２のプライマーと、配列番号２１で示される第３のプライマーと、配列番号２２で示される第４のプライマーと、配列番号２５で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；
   （２）エンテロバクテリア科の菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号２８により示される第１のプライマーと、配列番号２９で示される第２のプライマーと、配列番号２６で示される第３のプライマーと、配列番号２７で示される第４のプライマーと、配列番号３０で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；
   （３）ブドウ球菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号３２により示される第１のプライマーと、配列番号３３で示される第２のプライマーと、配列番号３１で示される第３のプライマーと、配列番号３４で示される第４のプライマーと、配列番号３５で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；および／または
   （４）連鎖球菌に由来する標的鋳型核酸を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号３８により示される第１のプライマーと、配列番号３９または配列番号４０で示される第２のプライマーと、配列番号３６で示される第３のプライマーと、配列番号３７で示される第４のプライマーと、配列番号４１または配列番号４２で示される第５のプライマーと含むプライマーセット；
   を含み、
   前記核酸プローブが、
   （１’’）エンテロバクテリア科の菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；
   （２’’）エンテロバクテリア科の菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；
   （３’’）ブドウ球菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；および／または
   （４’’）連鎖球菌に由来する増幅産物を検出するための核酸プローブであり、配列番号５６、配列番号６７、配列番号５８および配列番号５９でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット、および／またはこれらの相補配列でそれぞれ示される核酸プローブを含む核酸プローブセット；
   を含むアッセイキット。
8. 請求項５に記載のアッセイキットであって、エンテロバクテリア科の菌、ブドウ球菌および連鎖球菌のための濃度標準核酸を更に含み、前記濃度標準核酸が、
   （１’）エンテロバクテリア科の菌のための濃度標準核酸であり、配列番号６１および配列番号６２によりそれぞれ示される第１の濃度標準核酸セットから少なくとも１つ選択された第１の濃度標準核酸と、
   （２’）ブドウ球菌のための濃度標準核酸であり、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９によりそれぞれ示される第２の濃度標準核酸セットから少なくとも１つ選択された第２の濃度標準核酸と、
   （３’）連鎖球菌に由来する濃度標準核酸であり、配列番号７１、配列番号７２および配列番号７２によりそれぞれ示される第３の濃度標準核酸セットから少なくとも１つ選択される第３の濃度標準核酸と
   を含むアッセイキット。
9. 検体中に含まれる特定の菌について、常在菌であるか否かを判定する方法であって、
   （ａ）核酸を含む検体を準備することと、
   （ｂ）その５’末端側からＦ３領域、Ｆ２領域、第１のプローブ結合領域およびＦ１領域をこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域およびＢ１ｃ領域をこの順番で含む標的鋳型配列を増幅するための第１のプライマーと第２のプライマーとを含むプライマーセットであり、第１のプライマーが、５’末端側にＦ１に相補的なＦ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＦ２に同じＦ２配列を有するＦＩＰプライマーであり、第２のプライマーが５’末端側にＢ１ｃに同じＢ１ｃ配列を有し、且つ３’末端側にＢ２ｃに相補的なＢ２配列を有するＢＩＰプライマーであるプライマーセットを準備することと、
   （ｃ）第１の濃度標準核酸〜第３の濃度標準核酸を準備すること；ここで、第１の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第２のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番で含み、第２の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第３のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番で含み、第３の濃度標準核酸は、その５’末端側からＦ３領域と、Ｆ２領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第４のプローブ結合領域と、Ｆ１領域とをこの順番で含み、且つ３’末端側からＢ３ｃ領域と、Ｂ２ｃ領域と、ＬＢｃ領域と、Ｂ１ｃ領域とをこの順番で含む、（ｄ）予め低濃度であると定めた濃度の第１の濃度標準核酸と、予め中程度濃度であると定めた濃度の第２の濃度標準核酸と、予め高濃度であると定めた濃度の第３の濃度標準核酸とを、前記濃度標準核酸の種類毎に第１〜第３の反応環境内に、前記検体と、前記プライマーセットと共にそれぞれ持ち込み、ＬＡＭＰ法により増幅反応を行って増幅産物をそれぞれ得ることと；ここで、前記各第１〜第ｎの反応環境において前記第１の標的鋳型配列の増幅と前記濃度標準核酸の増幅とは競合的に行われ、前記第１の標的鋳型配列及び前記濃度標準核酸のうち、より多く存在する方が増幅される
   （ｅ）前記第１〜第３の反応環境内で得られた第１〜第３の増幅産物を１つに合わせることと、
   （ｆ）基体に固定化された第１〜第４の核酸プローブと、（ｅ）で得られた前記合わせられた増幅産物とを反応させること；ここで、前記第１の核酸プローブは、当該基体の第１の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第１のプローブ結合領域を含む第１の標的配列またはその相補配列に相補的であり、前記第２の核酸プローブは、前記基体の第２の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第２のプローブ結合領域を含む第２の標的配列またはその相補配列に相補的であり、第３の核酸プローブは、当該基体の第３の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第３のプローブ結合領域を含む第３の標的配列またはその相補配列に相補的であり、第４の核酸プローブは、当該基体の第４の固定化領域に固定化され、前記Ｆ２領域および第４のプローブ結合領域を含む第４の標的配列またはその相補配列に相補的である、
   （ｇ）（ｆ）において生じた第１〜第４の核酸プローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーション量をそれぞれ検出し、
   （１）前記第２〜第４の核酸プローブの全ての前記ハイブリダイズ信号が、前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の２倍以上である場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は前記低濃度より少なく、前記特定の菌が前記検体中に低菌量で存在すると判定し、
   （２）前記第２の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号が前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満であり、前記第３及び第４の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号が前記第２の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の２倍以上である場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は前記中程度の濃度であり、前記特定の菌が前記検体中に中程度の菌量で存在すると判定し、
   （３）前記第２及び第３の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号が前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満であり、前記第４の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号が前記第２及び３の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の２倍以上である場合、又は前記第２〜第４の核酸プローブの全ての前記ハイブリダイゼーション信号が前記第１の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満である場合、前記第１の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は前記高濃度以上であり、前記特定の菌が前記検体中に高菌量で存在すると判定する
   ことにより検体に含まれる特定の核酸が常在菌であるか否かを判定することと、
   を含む方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、（ｇ）において定量された当該菌量が、低菌量であると判定された場合に、常在菌であると判定する、方法。
11. 請求項９に記載の方法であって、（ｇ）において定量された当該菌量が、低菌量または中程度の菌量であると判定された場合に、常在菌であると判定する、方法。
    

Images