RU2595373C1 - Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени - Google Patents
Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2595373C1 RU2595373C1 RU2015124620/10A RU2015124620A RU2595373C1 RU 2595373 C1 RU2595373 C1 RU 2595373C1 RU 2015124620/10 A RU2015124620/10 A RU 2015124620/10A RU 2015124620 A RU2015124620 A RU 2015124620A RU 2595373 C1 RU2595373 C1 RU 2595373C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- probe
- fluorescence
- biv
- mql
- denaturation
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 51
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 25
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 title abstract 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 abstract description 43
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 34
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 3
- 241000713686 Bovine lentivirus group Species 0.000 description 2
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100338789 Bos taurus HEXIM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000016377 Orthoretrovirinae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODMZDQKUHYGKKN-UHFFFAOYSA-N TCA C Natural products CC(CCCC(C)C1=CCC2(C)OC3=C(CC12)C(=O)C(O)CC3)C(=O)O ODMZDQKUHYGKKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012932 thermodynamic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Описан набор для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV (bovine immunodeficiency virus)), содержащий пару специфичных праймеров и ДНК-зонд, методом ПЦР в режиме реального времени. Праймеры и зонд имеют следующий нуклеотидный состав (5′-3′-): pf - TAGGGTAGTGGGATCTCAGAAATC, pr - ACATCCGTAACATCTCCTACCATC, z - GAGGATGGTAGGAGATGTTACGGAT. В качестве источника флуоресценции на 5′ конце зонда применяют краситель ROX, а для тушения флуоресценции на 3′ конце BHQ2. Также описан способ диагностики BIV методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора по п. 1. Реакционную смесь готовят путем смешения буфера 10-кратного для ПЦР - 2.5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,2 мкл, праймеров pf и pr (10 пмоль/мкл) по 1 мкл, зонда z (10 пмоль/мкл) - 0,5 мкл, Taq полимеразы (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 2 мкл, бидистиллированной воды - 7,6 мкл, а амплификацию проводят в следующем режиме: денатурация 95°С - 5 мин, циклирование: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 10 раз, циклирование 2 с детекцией: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 25 или 30 раз. Флуоресценцию измеряют по каналу Orange при температуре 55°С. Пересечение кривой флуоресценции линии threshold, установленной на уровне 30% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации, свидетельствует о наличии в образце провируса BIV, причем, чем меньше значение показателя «Ct», тем выше количество провируса BIV в исследуемом образце, в то время как отсутствие пересечения кривой флуоресценции линии threshold свидетельствует об отсутствии провируса BIV в образце. Изобретение может быть использовано в научных исследованиях для обнаружения генетического материала BIV в лимфоцитах крови животных методом ПЦР в режиме реального времени. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярно-генетической диагностики вирусных болезней животных и может быть использовано в научных исследованиях для обнаружения генетического материала провируса иммунодефицита крупного рогатого скота - BIV (bovine immunodeficiency virus) в лимфоцитах крови животных методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-time PCR).
Вирусный иммунодефицит крупного рогатого скота (ВИ КРС) - инфекционное заболевание, характеризующееся латентным течением и неизбежно приводящее к летальному исходу. В настоящее время не существует средств специфической терапии и профилактики этой инфекции. Следовательно, своевременная диагностика является единственным способом контроля над распространением данного заболевания.
Возбудитель инфекции принадлежит к семейству Retroviridae, подсемейству Orthoretrovirinae, роду Lentivirus (http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp).
Вирус является лимфонейротропным и повреждает, в первую очередь, иммунную систему: тканевый и гуморальный иммунитет (Bhatia S, Patil SS, Sood R Bovine immunodeficiency virus: a lentiviral infection // Indian J Virol. 2013 Dec; 24(3):332-41. doi: 10.1007/s13337-013-0165-9. Epub 2013 Sep 27). У животных, больных иммунодефицитом, часто возникают поражение центральной нервной и лимфоидной системы (лимфоидная фолликулярная гиперплазия и дисплазия лимфатических узлов), различные вторичные инфекции и опухолевые процессы - развивается синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), что ведет к снижение массы тела, потере продуктивности и получению некачественной продукции животноводства (Snider TG, Hoyt PG, Coats KS, Graves KF, Cooper CR, Storts RW, Luther DG, Jenny BF Natural bovine lentiviral type 1 infection in Holstein dairy cattle. Clinical, serological, and pathological observations // Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2003 Mar; 26(2):89-101).
Молодняк, полученный от больных коров, также может быть инфицирован, так как вирус передается внутриутробно или заражение происходит алиментарно, при выпаивании молоком от больных коров и контактно при совместном содержании (Meas S, Usui Τ, Ohashi Κ, Sugimoto С, Onuma M. Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency virus in dairy cattle herds // Vet Microbiol. 2002 Jan 23; 84(3):275-82). Вакцинация BIV-инфицированных телят с целью профилактики других инфекционных заболеваний малоэффективна, поскольку вирус иммунодефицита избирательно поражает и разрушает центральное звено иммунной системы (СD4-лимфоциты), что приводит к снижению иммунного ответа. BIV-инфицированные телята в большей степени подвержены заболеваниям различной этиологии, а именно респираторным, кишечным и другим вирусным и бактериальным инфекциям, грибковым и инвазионным заболеваниям (Carpenter S, Vaughn ЕМ, Yang J, Baccam Ρ, Roth JA, Wannemuehler Y Antigenic and genetic stability of bovine immunodeficiency virus during long-term persistence in cattle experimentally infected with the BIV(R29) isolate // J Gen Virol. 2000 Jun; 81(Pt 6):1463-72).
Зарубежные исследователи сообщают о широкой распространенности BIV в мире (Bhatia S, Patil SS, Sood R Bovine immunodeficiency virus: a lentiviral infection // Indian J Virol. 2013 Dec; 24(3):332-41. doi: 10.1007/s 13337-013-0165-9. Epub 2013 Sep 27).
По некоторым данным распространение BIV в Московской области составляет от 11 до 67%, а в Ставропольском крае 11-33% (Колотвин В.В. Выявление вируса иммунодефицита крупного рогатого скота в Московской области / В.В. Колотвин, А.В. Капитонов, Н.Ф. Гриненко, Л.М. Пискарева, Г.В. Пашвыкина, С.С. Абакин, Г.О. Шайхаев, А.Д. Альтштейн, А.Ф. Валихов // Российский ветеринарный журнал (сельскохозяйственные животные). - М., - 2006. - №2. - С. 18-20).
Геном BIV имеет размер 8,48 kb и содержит три основных структурных гена, кодирующих вирусные протеины в следующем порядке: 5'-gag-pol-env-3': ген gag кодирует белки, формирующие «сердцевину» вируса; ген pol-ферментную систему вируса (обратную транскриптазу; интегразу и рибонуклеазу); ген env определяет способность вируса выходить за пределы клетки и инфицировать другие. Жизненный цикл BIV включает несколько последовательных фаз: связывание вириона с рецептором клетки хозяина: слияние вирусной оболочки и клеточной мембраны; эндоцитоз; обратное транскрибирование; интеграция с геномом хозяина. На этом этапе, провирусной ДНК, вирус может задержаться на несколько лет, делая зараженный организм латентным источником инфекции. При этом вирусная популяция увеличивается за счет клонирования инфицированных клеток. Затем наступает этап репликации: интегрированный провирус транскрибируется клеточной РНК полимеразой и, после сборки капсида, вирионы высвобождаются из клетки почкованием (Супотницкий М.В. Эволюционная патология. К вопросу о месте ВИЧ-инфекции и ВИЧ/СПИД-пандемии среди других инфекционных, эпидемических и пандемических процессов. - Москва: Вузовская книга, 2009. - 400 с).
В настоящее время, для диагностики ВИ КРС в Российской Федерации не существует сертифицированных тест-систем и официально утвержденных инструкций. В мировой практике имеется ряд тестов для выявления как самого BIV, так и вирус специфичных антител.
Известен способ диагностики вирусного иммунодефицита КРС вирусологическим методом, основанный на культивирование BIV на фетальных культурах клеток селезенки и легкого КРС или кролика с последующей индикацией и идентификацией вируса (Van Der Maaten MJ, Boothe AD, Seger CL. Isolation of a virus from cattle with persistent lymphocytosis. J Natl Cancer Inst. 1972; 49:1649-1657; Guo HY, Ma YG, Gai YM, Liang ZB, Ma J, Su Y, Zhang QC, Chen QM, Tan J. Bovine HEXIM1 inhibits bovine immunodeficiency virus replication through regulating BTat-mediated transactivation. Vet Res. 2013; 44(1):21. doi: 10.1186/1297-9716-44-21; Suarez DL, Van Der Maaten MJ, Wood C. Isolation and characterization of new wild type isolates of bovine lentivirus. J Virol. 1993; 67:5051-5055).
Недостатками данного метода являются длительность, трудоемкость и необходимость использования биологических моделей.
Известен способ выявления антител к BIV в крови животных методом твердофазного иммуноферментного анализа, основанный на обнаружении специфического комплекса антиген-антитело с помощью цветной реакции вследствие ферментации субстрата энзимом, связанным с конъюгатом (Abed Y, Archambault D. A viral transmembrane recombinant protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of bovine immunodeficiency virus infection. J Virol Methods. 2000; 85:109-116. doi: 10.1016/S0166-0934(99)00161-5; Bhatia S, Gangil R, Gupta DS, Sood R, Pradhan HK, Dubey SC. Single chain fragment variable antibody against the capsid protein of bovine immunodeficiency virus and its use in ELISA. J Virol Methods. 2010; 167:68-73. doi: 10.1016/j.jviromet.2010.03.012).
Недостатком метода является невысокая информативность на ранних этапах заражения, когда в крови недостаточно высокий уровень антител и ложноположительные результаты в случае обследования молодняка вследствие наличия в крови клостральных антител.
Известен способ выявления провирусной ДНК BIV методами классической полимеразной цепной реакции (ПНР) и гнездной ПЦР (Suarez DL, Whetstone СА. PCR diagnosis of the bovine immunodeficiency-like virus. Methods Mol Biol. 1998; 92:67-79; Колотвин B.B. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота: индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации: Автореферат диссертации канд. биол. наук. М., 2007. - 18; Suarez DL, Van der Maaten MJ, Whetstone CA. Improved early and long-term detection of bovine lentivirus by a nested polymerase chain reaction test in experimentally infected calves. Am J Vet Res. 1995; 56(5):579-586). Данные методы основаны на прямом обнаружении генома провируса BIV в лимфоцитах крови КРС.
Недостатками данных способов являются:
- повышенный риск контаминации образцов, реактивов, помещения и оборудования лаборатории в момент манипуляции с ампликами при проведении дополнительного цикла амплификации и детекции результатов методом электрофореза в агарозном геле;
- не полное использование возможностей ПЦР, таких как максимальная специфичность и скорость проведения реакции;
- субъективность в интерпретации результатов;
- невозможность количественной оценки при учете результатов.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ, описанный в патенте RU №2499054 от 11.10.2012 г., опубликован 20.11.2013 г., бюл. №32. В данном изобретении выбор специфических праймеров и зондов проводили с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных в GenBank, а обнаружение генома вируса осуществляли путем проведения ПЦР в реальном времени с применеием олигонуклеотидных праймеров и гибридизационного TaqMan ДНК-зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. При этом праймеры и зонд имели следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA; 14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1; 14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА ТС. В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ1. Для проведения ПЦР в режиме реального времени в отдельной пробирке готовили общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляли 8 мкл смеси для ПЦР, 7 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы, смесь перемешивали, избегая образования пены, и раскапывали по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см, на поверхность смеси вносили воск в объеме 15 мкл, на воск наносили по 10 мкл исследуемого образца. Реакцию осуществляли в следующем режиме:
1. Удержание температуры 95°С - 3 мин
2. Циклирование 95°С - 10 с
60°С - 20 с
72°С - 15 с
Цикл повторить 5 раз
3. Циклирование с детекцией 2
95°С - 10 с
60°С - 20 с - Детекция
72°С - 15 с
Цикл повторить 40 раз
Флуоресценцию измеряли по каналу Green при температуре 60°С.
Но данный способ не может быть использован для выявления провируса иммунодефицита КРС из-за неспецифичности праймеров и зонда для BIV, а проведение реакции обратной транскрипции (ОТ) перед постановкой ГЩР увеличивает материальные и временные затраты на постановку анализа и усиливает риск возникновения контаминации в лаборатории.
Технической задачей является разработка быстрого, высокоспецифичного и чувствительного количественного способа обнаружения ДНК провируса иммунодефицита КРС методом ПНР в реальном времени путем конструирования набора, содержащего пару специфичных олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зонд, а также подбора условий для проведения ПНР с ними, обеспечивающего минимальный риск контаминации в лаборатории при проведении анализа, а также исключающего субъективность при оценке результатов ПЦР.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в конструировании специфических олигонуклеотидных праймеров и TaqMan-зонда, комплементарных консервативной области генома BIV, и разработке способа их применения в Real-time PCR, что обеспечивает максимальную чувствительность, специфичность и скорость проведения реакции, минимизацию возможности контаминации образцов, реактивов, помещения и оборудования лаборатории образующимися ампликонами, а также полную объективность и количественный анализ полученных данных за счет автоматического учета результатов.
На фигуре 1 представлена схема строения генома BIV, размещенная на web-ресурсе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=bovine+immunodeficiency+virus).
На фигуре 2 представлен отчет работы прибора Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия) и результаты проведения Real-time PCR с применением разработанных праймеров и зонда при моделировании реакционной смеси и определений условий амплификации.
На фигуре 3 представлен отчет работы прибора Rotor-Gene 6000 и результаты проведения Real-time PCR с применением разработанных праймеров и зонда при определении чувствительности способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
На фигуре 4 представлен график из отчета работы прибора Rotor-Gene 6000 при определении специфичности способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
На фигуре 5 представлен график из отчета работы прибора Rotor-Gene 6000 при использовании Real-time PCR для выявления ДНК провируса BIV в крови КРС с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда.
На фигуре 6 представлен отчет работы прибора Rotor-Gene 6000 и результаты проведения Real-time PCR при выявлении ДНК провируса BIV в лимфоцитах крови КРС с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда.
Техническая задача решается, а технический результат достигается путем конструирования специфических праймеров и зонда с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank (http://vvrvm.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/9626219?report=genbank) и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. При этом праймеры и зонд отличаются тем, что имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):pf - TAGGGTAGTGGGATCTCAGAAATC, pr - ACATCCGTAACATCTCCTACCATC, z - GAGGATGGTAGGAGATGTTACGGAT, в качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяют краситель ROX, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ2. Для проведения ПЦР в режиме реального времени в отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, которая отличается тем, что на одну пробу берут буфер 10-кратный для ПЦР - 2,5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,2 мкл, праймеры pf и pr (10 пмоль/мкл) по 1 мкл, зонд z (10 пмоль/мкл) 0,5 мкл, Taq полимеразу (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 2 мкл, бидистиллированную воду - 7,6 мкл. Смесь перемешивают, избегая образования пены, раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см. На поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл и на воск наносят по 10 мкл исследуемого образца. Постановка реакции отличается тем, что ее осуществляют в следующем режиме (для Rotor-Gene 6000):
1. Удержание температуры 95°С - 5 мин
2. Цитирование 95°С - 20 с
55°С - 20 с
72°С - 20 с
Цикл повторить 10 раз
3. Циклирование с детекцией 2
95°С - 20 с
55°С - 20 с - Детекция
72°С - 20 с
Цикл повторить 25 или 30 раз
Флуоресценцию измеряют по каналу Orange при температуре 55°С.
При этом отсутствует необходимость проводить реакцию ОТ.
Конструирование пары синтетических олигонуклеотидных праймеров и зонда, применяемых для выделения ДНК провируса иммунодефицита КРС, и разработка способа диагностики ВИ КРС с их использованием осуществлялись в семь этапов.
1. Анализ структуры генома BIV.
2. Конструирование праймеров и зонда.
3. Подбор оптимальной пары праймеров и зонда.
4. Моделирование состава реакционной смеси способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
5. Отработка условий способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
6. Определение чувствительности способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
7. Определение специфичности способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
1. Анализ структуры генома BIV.
С помощью компьютерной программы Vector NTI 11 (Invitrogen, США) проводили анализ структуры генома референтного штамма Bovine immunodeficiency virus и фрагментов генома BIV, размещенных на web - ресурсе NCBI, с целью выявления наиболее консервативного участка, которым оказался ген gag (316…1746 п. н.) (фиг. 1).
2. Конструирование праймеров и зонда.
С помощью компьютерной программы GENERUNR 3.0, геном вируса в формате FASTA применяли для подбора специфических олигонуклеотидов на участке gag (316…1746 п. н.), как наименее вариабельного для BIV.
3. Подбор оптимальной пары праймеров и зонда.
Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0. (http://molbiol-tools.ca/molecular_biology_freeware.htm#Primer%20design) и BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). При дизайне праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров; выбор температуры отжига зонда на 10°С выше, чем праймеров.
На основании проведенного компьютерного анализа была подобрана пара праймеров и зонд, характеристики которых приведены в таблице 1.
Разработанные олигонуклеотиды имеют оптимальные размер (24-25 пл.), структуру, о чем свидетельствуют показатели энергии Гиббса на 3' конце (3'-end dG): -5 и -7 kcal/mol и энергии Гиббса димерных структур (Dimers dG): 0,3 и 2,8 kcal/mol, и GC состав (45,8 и 48%), температуру отжига праймеров 55°С, температуру отжига зонда 65°С.
4. Моделирование состава реакционной смеси способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
Нуклеиновые кислоты (НК) из стабилизированных ЭДТА проб периферической крови КРС выделяли методом нуклеосорбции на силикогеле с использованием набора «ДНК-сорб-В» (ИнтерЛабСервис, Россия). ПЦР проводили в объеме реакционной смеси - 25 мкл на 1 пробу. Состав реакционной смеси представлен в таблице 2.
Состав реакционной смеси подбирали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl2 была в пределах 1,5- 4 мМ, что обеспечивает оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, концентрация дНТФ - не более 0,4 мМ, концентрация праймеров -10 пмоль/мкл и объем пробы - 10 мкл. Перед нанесением пробы ДНК, во избежание образования неспецифических фрагментов, на поверхность смеси вносили 1-2 капли расплавленного воска для ПЦР, чтобы разделить реакционную смесь и исследуемый образец.
5. Отработка условий способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
Отработку условий ПЦР с использованием разработанных олигонуклеотидов осуществляли на амплификаторе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия). Температурно-временной режим проведения ПЦР представлен в таблице 3.
Флуоресценцию измеряют по каналу Orange (возбуждение 589 нм, излучение 605 нм) при температуре 55°С на втором циклировании. При учете результата threshold (порог) устанавливали вручную на уровне 30% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации. Уровень threshold составил 0,05. Значения показателя «Ct» были на уровне 24-25. В положительных образцах кривая флуоресценции пересекает линию threshold и, в зависимости от интенсивности сигнала, возвышается над линией более или менее. В отрицательных образцах и отрицательном контроле флуоресценции не наблюдается, что отражается прямой детекции на уровне или ниже линии threshold (фиг. 2).
6. Определение чувствительности способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
Положительные пробы ДНК использовали в качестве позитивного контроля при определении чувствительности метода. Учитывая высокую чувствительность метода ПЦР в реальном времени, из очищенных проб ДНК, полученной из инфицированных ВИ лимфоцитов крови КРС, готовили разведения 10-3 и 10-4. Пробы исследовали методом Real-time PCR с применением разработанных специфических олигонуклеотидов. Во всех разведениях кривая флуоресценции пересекала линию threshold и возвышалась над ней. В разведении 10-3 показатель «пороговый цикл» («Ct») составил 18, для 10-4 - 25 (фиг. 3).
7. Определение специфичности способа диагностики ВИ КРС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.
Специфичность разрабатываемого способа проверяли на гомологичных и гетерологичных образцах: провирусная ДНК BIV, BLV (вирус энзоотического лейкоза КРС), FIV (вирус иммунодефицита кошек), FeLV (вирус лейкемии кошек), а также образцах от интактных животных. Положительный результат в ПЦР был получен только с образцом ДНК, содержащими BIV, при отсутствии кривой флуоресценции с другими пробами и в отрицательном контроле (фиг. 4).
Пример 1. Применение Real-time PCR для выявления ДНК провируса иммунодефицита КРС с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда при исследовании периферической крови КРС.
Для анализа методом ПЦР были взяты 32 пробы периферической крови от коров (с. Озерное Саратовская обл.), признанных больных энзоотическим лейкозом на основании серологических и гематологических исследований, так как по литературным данным у таких животных наиболее часто выявляется ВИ КРС. В качестве контроля использовали очищенную ДНК крови BIV-позитивных животных. В процессе ПЦР в 10 пробах были получены кривые флуоресценции, пересекающие линию threshold, при отсутствии таковой в отрицательном контроле. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов (фиг. 5).
Пример 2. Применение реакции амплификации для выявления ДНК провируса иммунодефицита КРС в лимфоцитах крови, с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда.
Для анализа методом ПЦР были взяты 6 проб лимфоцитов крови КРС находящегося в частном владении и подозрительного в заражении BIV, в том числе у трехнедельной телочки, полученной от BIV-позитивной коровы. В процессе ПЦР во всех 6 пробах были получены кривые флуоресценции, пересекающие линию threshold, при отсутствии таковой в отрицательном контроле. Значения показателя «Ct» составило от 18 до 24. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов (фиг. 6).
Предложенные набор и способ диагностики позволяют количественно выявлять на ранних стадиях высоко консервативную область гена gag ВИ КРС. Применение олигонуклеотидного зонда позволяет повысить чувствительность и специфичность способа, исключить субъективность при оценке результатов. Использование предлагаемой модификации ПНР позволяет значительно снизить возможность контаминации образцов, помещения, оборудования и реактивов, а также сократить сроки проведения анализа, что важно как для владельцев животных, так и для ветеринарных специалистов.
Предложенный способ диагностики и набор для его реализации апробированы с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2015 году на 32 пробах периферической крови и 6 пробах лимфоцитов крови, полученных от КРС, подозрительного в заражении BIV.
Работу проводили на базе межкафедральной учебно-научно-исследовательской лаборатории «Геном» ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» и ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов).
Claims (2)
1. Набор для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и ДНК-зонд, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что имеют следующий нуклеотидный состав (5′-3′-):
pf - TAGGGTAGTGGGATCTCAGAAATC,
pr - ACATCCGTAACATCTCCTACCATC,
z - GAGGATGGTAGGAGATGTTACGGAT,
в качестве источника флуоресценции на 5′ конце зонда применяют краситель ROX, а для тушения флуоресценции на 3′ конце BHQ2.
pf - TAGGGTAGTGGGATCTCAGAAATC,
pr - ACATCCGTAACATCTCCTACCATC,
z - GAGGATGGTAGGAGATGTTACGGAT,
в качестве источника флуоресценции на 5′ конце зонда применяют краситель ROX, а для тушения флуоресценции на 3′ конце BHQ2.
2. Способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием набора для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота по п. 1, отличающийся тем, что реакционную смесь готовят путем смешения буфера 10-кратного для ПЦР - 2,5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,2 мкл, праймеров pf и pr (10 пмоль/мкл) по 1 мкл, зонда z (10 пмоль/мкл) - 0,5 мкл, Taq полимеразы (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 2 мкл, бидистиллированной воды - 7.6 мкл, а амплификацию проводят в следующем режиме:
денатурация 95°С - 5 мин,
циклирование: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 10 раз,
циклирование 2 с детекцией: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 25 или 30 раз, при этом флуоресценцию измеряют по каналу Orange при температуре 55°С, и пересечение кривой флуоресценции линии threshold, установленной на уровне 30% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации, свидетельствует о наличии в образце провируса BIV, причем, чем меньше значение показателя «Ct», тем выше количество провируса BIV в исследуемом образце, в то время как отсутствие пересечения кривой флуоресценции линии threshold свидетельствует об отсутствии провируса BIV в образце.
денатурация 95°С - 5 мин,
циклирование: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 10 раз,
циклирование 2 с детекцией: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 25 или 30 раз, при этом флуоресценцию измеряют по каналу Orange при температуре 55°С, и пересечение кривой флуоресценции линии threshold, установленной на уровне 30% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации, свидетельствует о наличии в образце провируса BIV, причем, чем меньше значение показателя «Ct», тем выше количество провируса BIV в исследуемом образце, в то время как отсутствие пересечения кривой флуоресценции линии threshold свидетельствует об отсутствии провируса BIV в образце.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015124620/10A RU2595373C1 (ru) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015124620/10A RU2595373C1 (ru) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2595373C1 true RU2595373C1 (ru) | 2016-08-27 |
Family
ID=56892041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015124620/10A RU2595373C1 (ru) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2595373C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11761032B2 (en) * | 2017-03-11 | 2023-09-19 | Yan Wang | Methods and devices for performing real time digital PCR |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2009130342A (ru) * | 2007-01-08 | 2011-02-20 | Хайнрих-Петте-Институт Фюр Экспериментелле Фирологи Унд Иммунологи Ан Дер Универзитет Гамбург (De) | Применение адаптированных рекомбиназ для лечения ретровирусных инфекций |
-
2015
- 2015-06-23 RU RU2015124620/10A patent/RU2595373C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2009130342A (ru) * | 2007-01-08 | 2011-02-20 | Хайнрих-Петте-Институт Фюр Экспериментелле Фирологи Унд Иммунологи Ан Дер Универзитет Гамбург (De) | Применение адаптированных рекомбиназ для лечения ретровирусных инфекций |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SUAREZ DL et al, PCR diagnosis of the bovine immunodeficiency-like virus, Methods Mol Biol., v.92, pp.67-79. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11761032B2 (en) * | 2017-03-11 | 2023-09-19 | Yan Wang | Methods and devices for performing real time digital PCR |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110551846B (zh) | 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 | |
| Yapar et al. | Rapid and quantitative detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by one-step real-time reverse transcriptase-PCR | |
| Fischer et al. | Detection and differentiation of field and vaccine strains of canine distemper virus using reverse transcription followed by nested real time PCR (RT-nqPCR) and RFLP analysis | |
| Wang et al. | Development of a recombinase polymerase amplification assay with lateral flow dipstick for rapid detection of feline parvovirus | |
| CN112739833A (zh) | 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 | |
| Zeng et al. | Development of a real time loop-mediated isothermal amplification method for detection of Senecavirus A | |
| De Regge et al. | Development, validation and evaluation of added diagnostic value of aq (RT)-PCR for the detection of genotype A strains of small ruminant lentiviruses | |
| RU2595373C1 (ru) | Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| Chen et al. | Development of two novel on-site detection visualization methods for murine hepatitis virus based on the multienzyme isothermal rapid amplification | |
| Liu et al. | Establishment of one-step duplex TaqMan real-time PCR for detection of feline coronavirus and panleukopenia virus | |
| Li et al. | Development of real‐time recombinase polymerase amplification (RPA) and RPA combined with lateral flow dipstick (LFD) assays for the rapid and sensitive detection of cyprinid herpesvirus 3 | |
| CN106636458A (zh) | 猴免疫缺陷病毒的rt‑lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法 | |
| CN116814857A (zh) | 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法 | |
| CN110257561A (zh) | 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用 | |
| Tran et al. | Evaluation of an automated insulated isothermal polymerase chain reaction system for rapid and reliable, on-site detection of African swine fever virus | |
| CN117568496A (zh) | 一种区分野毒株和Ts-11疫苗株的鸡毒支原体三重PCR检测方法 | |
| RU2615465C2 (ru) | Диагностическая система для выявления днк провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции | |
| RU2586504C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров и способ его применения для индикации вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в клиническом материале методом мультиплексной полимеразной цепной реакции | |
| JP6226460B2 (ja) | 核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、ｄｎａチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法 | |
| CN110257560B (zh) | 一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用 | |
| RU2553534C1 (ru) | Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек | |
| Lutz et al. | The role of polymerase chain reaction and its newer developments in feline medicine | |
| Lapira et al. | Molecular detection of ephemeral fever virus among large ruminants in the Philippines | |
| CN114410835A (zh) | 一种用于快速检测新型冠状病毒的rpa-lfd试剂盒 | |
| CN113549709A (zh) | 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170624 |