RU2553534C1 - Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек - Google Patents
Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек Download PDFInfo
- Publication number
- RU2553534C1 RU2553534C1 RU2014130601/10A RU2014130601A RU2553534C1 RU 2553534 C1 RU2553534 C1 RU 2553534C1 RU 2014130601/10 A RU2014130601/10 A RU 2014130601/10A RU 2014130601 A RU2014130601 A RU 2014130601A RU 2553534 C1 RU2553534 C1 RU 2553534C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cats
- virus
- immunodeficiency
- pair
- primers
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к паре синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, и к способу диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием данных праймеров. Пара праймеров имеет следующую структуру - PF: 5′-TGGAGAAGGGAATTTCAGATGGG-3′ и PR: 5′-TTTGGGTCAAGTGCTACATATTGTGG-3′. Способ включает проведение ПЦР с детекцией полученных результатов методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Амплификацию проводят в следующем режиме: тотальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, цикл денатурация при 95°С в течение 20 или 60 сек, отжиг при 56°С в течение 20 или 60 сек, элонгация при 72°С в течение 40 или 60 сек. Цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 35 раз. Проводят заключительную элонгацию при 72°С в течение 5 мин. В случае наличия амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности длиной 366 п.н. судят о наличии FIV в организме кошки. Предложенное изобретение позволяет провести диагностику вирусного иммунодефицита кошек с высокой эффективностью. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярно-генетической диагностики вирусных болезней животных и может быть использовано в научных исследованиях для обнаружения рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) провируса иммунодефицита кошек методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в пробах слюны и крови животных.
Известен способ определения антител к FIV (feline immunodeficiency virus) в крови животных с применением хроматографических стрипов, основанный на специфическом взаимодействии антиген-антитело и выявлении образовавшегося комплекса с помощью окрашивания его наночастицами (J Feline Med Surg. 2013 Dec; 15(12):1063-9. doi: 10.1177/1098612X13488384. Epub 2013 May 10.Prevalence and risk factor analysis of feline haemoplasma infection in New Zealand domestic cats using a real-time PCR assay. Jenkins KS, Dittmer KE, Marshall JC, Tasker S).
Недостатком метода является низкая чувствительность, так как при незначительной виремии и угнетении иммунной системы титр антител ниже диагностического.
Известен способ определения антител к FIV в крови кошек методом ИФА (иммуноферментный анализ), основанный на обнаружении специфического комплекса антиген-антитело с помощью цветной реакции вследствие ферментирования субстрата энзимом, связанным с конъюгатом (JFelineMedSurg. 2013 Aug; 15(8):725-9. doi: 10.1177/1098612X13475465. Epub 2013 Jan 29. Preliminary evaluation of a quantitative polymerase chain reaction assay for diagnosis of feline immunodeficiency virus infection. Ammersbach M, Little S, Bienzle D).
Недостатком метода является невысокая информативность в случае обследования вакцинированного животного (ложноположительные результаты) и на ранних этапах заражения, когда в крови недостаточно высокий уровень антител (ложноотрицательные результаты).
Известен способ обнаружения антигена FIV в биологическом материале от кошек методом Real-Time PCR (полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени), основанный на многократном копировании (амплификации) специфического участка генома вируса с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью зондов, меченных флюорохромом (JFelineMedSurg. 2013 Dec; 15(12):1070-8. doi: 10.1177/1098612X13491959. Epub 2013 Jun 5. Adoor-to-doorprevalencestudy of feline immunodeficiency virus in an Australian suburb. Chang-Fung-Martel L Gummow B, Burgess G, Fenton E, Squires R).
Недостатком метода является высокая стоимость анализа и невозможность проведения его в рядовой ветеринарной лаборатории.
Наиболее близким к заявленному изобретению являются праймеры; способ их применения в полимеразной цепной реакции, описанные в патенте RU №2317329 от 04.05.2005, опубликованном 20.12.2008 г.: «Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров, используемых для выявления ДНК провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа и условия полимеразной цепной реакции с их использованием», в котором с помощью компьютерных программ путем анализа структуры вируса, выбора консервативного участка вирусного генома подбирают оптимальную пару праймеров, у которых отсутствуют самокоплементарные участки внутри каждого праймера и между прямым и обратным, а затем используют эти праймеры для проведения ПЦР в объеме 25 мкл на одну пробу с детекцией полученных результатов методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
К недостаткам следует отнести невозможность выявления вируса иммунодефицита кошек с использованием описанных в патенте пары праймеров из-за неспецифичности их структуры для FIV, а условия полимеразной цепной реакции и состав реакционной смеси не могут быть использованы для обнаружения вируса иммунодефицита кошек.
Технической задачей является разработка эффективного и недорогого способа обнаружения ДНК провируса и РЖ вируса иммунодефицита кошек методом ПЦР путем конструирования двух специфических олигонуклеотидных праймеров и подбора условий для проведения ПЦР с ними.
Решение технической задачи достигается подбором пары синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, которые получены с помощью компьютерных программ путем анализа структуры вируса, выбора консервативного участка вирусного генома, подбора оптимальной пары праймеров, у которых отсутствуют самокоплементарные участки внутри каждого праймера и между прямым и обратным. Подобранная пара праймеров имеет температуру отжига 56°С для обоих олигонуклеотидов, GC состав 47,8% для PF и 42,3% для PR и следующую структуру - PF: 5′-TGGAGAAGGGAATTTCAGATGGG-3′ и PR: 5′-TTTGGGTCAAGTGCTACATATTGTGG-3′.
Способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек заключается в проведении ПЦР в объеме 25 мкл на одну пробу с использованием пары подобранных синтетических олигонуклеотидных праймеров и детекции полученных результатов методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Реакционная смесь готовится путем смешения буфера 10-кратного для ПЦР - 2,5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,2 мкл, праймера PF (10 пмоль/мкл) - 1 мкл, праймера PR (10 пмоль/мкл) - 1 мкл, Taq полимеразы (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 1 мкл, бидистиллированной воды - 14,1 мкл и пробы ДНК - 5 мкл. При этом амплификацию проводят в следующем режиме: тотальная денатурация 95°С - 5 мин, цикл денатурация (95°С - 20 или 60 сек) - отжиг (56°С - 20 или 60 сек) - элонгация (72°С - 40 или 60 сек), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 35 раз, заключительная элонгация 72°С - 5 мин и хранение 4°С - 10 мин. По наличию или отсутствию амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности длиной 366 п.н. судят о наличии или отсутствии FIV в организме кошки.
На фигуре 1 представлены генетические модификации вируса иммунодефицита кошек, где видны наиболее вариабельные и консервативные участки генома.
На фигуре 2 представлена структура референтного штамма Feline immunodeficiency virus, с указанием размера генома и его основных фрагментов, размещенная на web-ресурсе Национального центра биотехнологической информации - NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=FIV).
На фигуре 3 представлена электрофореграмма результатов исследования крови FIV - позитивных кошек методом ГЩР с использованием разработанных праймеров для определении размера амплифицируемого фрагмента. Пробы 1 и 2 являются положительными, так как содержат ампликоны, электрофоретическая подвижность которых соответствует длине фрагмента 366 п.н. В треке K- (отрицательный контроль) подобный фрагмент отсутствует.
На фигуре 4 представлена электрофореграмма результатов определения чувствительности разработанных праймеров. При исследовании крови чувствительность метода составила 10-4, при исследовании слюны - 10-3, о чем свидетельствуют полосы на уровне K+ (положительный контроль) в треках, при отсутствии подобной полосы в K-.
На фигуре 5 представлена электрофореграмма результатов определения специфичности разработанных праймеров. Положительный результат в ПЦР получали только с образцами ДНК, содержащими FIV, при отсутствии продукта амплификации с другими пробами, о чем свидетельствуют полосы на уровне K+ (положительный контроль) в треке FIV, при отсутствии подобных полос в треках FeLV, BLV, BIV и K-.
На фигуре 6 представлена электрофореграмма результатов исследования различного биологического материала от кошек с применением разработанных праймеров. Пробы 3, 4, 5, 17, 18 - положительные, так как содержат полосы в треках уровне K+ при отсутствии подобной полосы в K-.
Вирусный иммунодефицит кошек - заразная, хронически протекающая, неизлечимая болезнь, приводящая к нарушению функции иммунной системы, развитию синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) и заканчивающаяся летально.
Возбудитель болезни - Feline immunodeficiency virus относят к семейству Retroviridae, подсемейству Orthoretrovirinae, роду Lent/virus, группе Feline lentivirus. Внутри группы различают 5 генотипов вида Feline immunodeficiency virus: А, В, С, D и Е. [Olmsted R.A.et all, 1989]. Наиболее часто встречается подтип Е, а также А и В. Кроме того, в природных популяциях выявлены несколько интер-подтипов FIV-рекомбинантов: А/В, А/С и B/D. Разделение на подтипы осуществляется на основании анализа модификаций структуры гена env [Martins AN et all, 2008] (Фиг. 1).
FIV имеет три основных структурных гена, кодирующих вирусные протеины в следующем порядке: 5′-gag-pol-env-3′: gag (group specificanti gen. - кодируют белки сердцевины), pol (кодируют обратную транскрип тазу - polymerase) и env (кодируют белки оболочки - envelope). Вирусный геном содержит донорный сайт вблизи гена gag и акцепторный перед геном env. FIV несут два добавочных гена: ген dUТРазы, расположенный в пределах гена pol (ответственен за предотвращение ошибочного включения урацила в молекулу РНК-вируса во время его репликации и, соответственно, его аттенуации). Вторая открытая рамка считывания, обозначенная как orf-A или orf-2, кодирует протеин, состоящий из 77 аминокислот, который является критическим на ранней стадии инфицирования клетки и при формировании вирусной частицы. Нарушение функции белка Orf-A ведет к снижению способности вируса к репликации и уменьшению его патогенности [В. Филдс. Вирусология. Т. 1. М.: Мир, 1989. - 492 с.].
Схема жизненного цикла вируса включает: связывание вириона с рецептором клетки хозяина, вход в клетку, обратное транскрибирование с образованием кДНК интеграцию в геном хозяина (формирование провируса). [Супотницкий М.В. Эволюционная патология. К вопросу о месте ВИЧ-инфекции и ВИЧ/СПИД-пандемии среди других инфекционных, эпидемических и пандемических процессов. - Москва: Вузовская книга, 2009. - 400 с.].
Вирус является лимфо-нейротропным, инфицирование приводит глубокой к иммуносупрессии, проявляющейся в развитии вторичных инфекций и опухолевых процессов. Животное всю жизнь находится на поддерживающей терапии.
Полимеразная цепная реакция, которая является прямым высокочувствительным и высокоспецифичным молекулярно-биологическим методом, способна идентифицировать фрагменты провирусной ДНК и вирусной РНК (после проведения обратной транскрипции) FIV в лимфоцитах периферической крови и в слюне кошек и заключается в многократном увеличении копий специфичного участка ДНК выявляемого вируса с помощью фермента ДНК-полимеразы. Праймеры фланкируют искомый участок, присоединяясь по принципу комплементарности на денатурированную ДНК, и ориентированы таким образом (прямой и обратный), что элонгация новой цепи ДНК проходит только между ними. Основными параметрами эффективного прохождения реакции амплификации, обеспечивающими специфичность и чувствительность, являются правильный выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.
Конструирование пары синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, и разработка способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с их использованием осуществлялись в семь этапов:
- анализ структуры генома FIV;
- конструирование праймеров;
- подбор оптимальной пары праймеров;
- моделирование состава реакционной смеси способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров;
- отработка условий способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров;
- определение чувствительности способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров;
- определение специфичности способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров.
1. Анализ структуры генома FIV. С помощью компьютерной программы Vector NTI 11 (Invitrogen, США) проводит анализ структуры генома референтного штамма Feline immunodeficiency virus (фиг. 2) и фрагментов генома FIV, размещенных на web-ресурсе NCBI, с целью выявления наиболее консервативного участка.
2. Конструирование праймеров. С помощью компьютерной программы GENERUNR, геном вируса в формате FASTA применяли для подбора праймеров на участке гена gag (с 628 по 1980 п.н.), который является наиболее консервативным для всех вариантов FIV (фиг. 1).
3. Подбор оптимальной пары праймеров. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0. При дизайне праймеров основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри праймеров и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига и плавления праймеров.
На основании проведенного компьютерного анализа была подобрана пара праймеров, характеристика которых приведена в таблице 1.
Подобранная пара олигонуклеотидных праймеров имеет оптимальные размер (23-26 п.н.), структуру (отсутствие само- и взаимокомплементарности) и GC состав (42-47%), среднюю температуру отжига для обоих праймеров 56°С, температуру работы фермента 72°С.
Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывают в коммерческой организации.
4. Моделирование состава реакционной смеси способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров. Нуклеиновые кислоты (НК) из биологического материала от кошек выделяли методом нуклеосорбции на силикогеле с использованием наборов «ДНК-сорб-В» и «РИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис, Россия). Получение кДНК на матрице РНК, выделенной из слюны животных, осуществляли с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ИнтрЛабСервис). ПЦР проводили в объеме реакционной смеси - 25 мкл на 1 пробу. Состав реакционной смеси представлен в таблице 2.
Состав реакционной смеси подбирали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl2 была в пределах 1,5-4 мМ, что обеспечивает оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, концентрация дНТФ - не более 0,4 мМ, концентрация праймеров - 10 пмоль/мкл и объем пробы - 5 мкл, что способствует повышению специфичности реакции. При использовании амплификатора с крышкой без нагрева на смесь наслаивают 20 мкл минерального масла для ПЦР. При использовании амплификатора с нагревающейся крышкой минеральное масло не используется.
5. Отработка условий способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров. Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров осуществляли па амплификаторах «АМПЛИ 4» и «Терцик», «Veriti» (США). Температурно-временной режим проведения реакции для амплификаторов представлен в таблице 3.
Для амплификаторов с активным регулированием температуры по раствору в пробирке («Терцик», «Veriti») время прохождения всех этапов амплификации (денатурация - отжиг - элонгация) короче, чем для амплификатора с матричным регулированием температуры («АМПЛИ 4)»).
Учет осуществляли методом горизонтального гельэлектрофореза в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в качестве интерколирующего красителя для ДНК. Результат учитывали на оборудовании фирмы BioRad (США). Для определения размера ампликонов после проведения ПЦР с разработанными праймерами, использовали маркер молекулярных масс "1 kb DNA ladder" («Stratagene», США) (фиг. 3). В электрофоретической дорожке проб 1 и 2 присутствует светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность соответствует длине ампликона 366 п.н. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю (K-), такая полоса отсутствует.
6. Определение чувствительности способа диагностики вирусного, иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров. Положительные пробы биоматериала использовали в качестве позитивного контроля при определении чувствительности метода. Из очищенных проб (кровь, слюна) готовили десятикратные разведения, которые исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров. Последним разведением, в котором обнаруживалась специфическая полоса на электрофореграмме при исследовании крови, считалось разведение 10-4, при исследовании слюны - 10-3 (фиг. 4).
7. Определение специфичности способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанной пары праймеров. Специфичность проверяли на образцах провирусной ДНК FIV, FeLV (вирус лейкемии кошек), BIV (вирус иммунодефицита КРС), BLV (вирус энзоотического лейкоза КРС), являющихся близкородственными ретровирусами, а также образцах от интактных и серонегативных кошек. Положительный результат в ПЦР получали только с образцами ДНК, содержащими FIV, при отсутствии продукта амплификации с другими пробами (Фиг. 5).
Пример 1. Применение реакции амплификации для выявления ДНК провируса иммунодефицита кошек с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров при исследовании периферической крови животных. Для анализа методом ПНР были взяты пробы периферической крови от кошек, серопозитивных при исследовании на антитела к FIV методом ИХА, показавших присутствие вируса при исследовании методом Real-Time PCR и имеющих клинические проявления СПИДа. В процессе ПЦР были получены продукты амплификации на матрице ДНК провируса иммунодефицита кошек длиной 366 п.н. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов.
Пример 2. Применение реакции амплификации для выявления РНК вируса иммунодефицита кошек с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров при исследовании слюны животных. Для анализа методом ПНР были взяты пробы слюны от кошек, показавших наличие ДНК провируса иммунодефицита кошек в периферической крови методом ПЦР. В процессе ПЦР были получены продукты амплификации на матрице кДНК вируса иммунодефицита кошек длиной 366 п.н. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов.
Пример 3. Применение реакции амплификации для выявления провирусной ДНК и вирусной РНК возбудителя вирусного иммунодефицита кошек с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров при исследовании биологического материала от кошек. Для анализа методом ПЦР были взяты пробы слюны и периферической крови от разных кошек, принадлежащих частным владельцам и обратившимся за ветеринарной помощью в УНИЦ «Ветеринарный госпиталь» ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ». В процессе ПЦР были получены продукты амплификации длиной 366 п.н. (фиг. 6). Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов.
Предложенный способ позволяет детектировать на ранних стадиях высококонсервативную область гена gag вируса иммунодефицита кошек. Выбор высококонсервативной области гена gag, общей для всех генетических вариантов FIV, позволяет повысить чувствительность способа диагностики иммунодефицита кошек, выявлять животных, инфицированных любым типом вируса. Проведение обратной транскрипции позволяет выявлять вирусную РНК возбудителя ВИК в слюне животных. Использование предлагаемой модификации ПЦР позволяет значительно снизить себестоимость анализа, что важно для владельцев животных, и делает его доступным для рядовой ветеринарной лаборатории.
Техническим результатом, на достижение которого направлено данное изобретение, является доступный по стоимости, достоверный, высокочувствительный и высокоспецифичный способ выявления фрагмента провирусной ДНК и РНК вируса иммунодефицита кошек в биологическом материале в короткие сроки.
Предложенный способ апробирован с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2014 году на 17 пробах ДНК и 17 пробах РНК, полученных из крови и слюны кошек, принадлежащих частным владельцам и обращавшимся в УНИЦ «Ветеринарный госпиталь» ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ». Работу проводили на базе межкафедральной учебно-научно-исследовательской лаборатории «Геном» ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» и ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов).
Claims (2)
1. Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, полученных с помощью компьютерных программ, анализа структуры вируса, выбора консервативного участка вирусного генома, подбора оптимальной пары праймеров, у которых отсутствуют самокоплементарные участки внутри каждого праймера и между прямым и обратным, которые отличаются тем, что имеют температуру отжига - 56°C для обоих олигонуклеотидов, GС состав - 47,8% для РF и 42,3% для PR и следующую структуру -
и
.
2. Способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием пары синтетических олигонуклеотидных праймеров, заключающийся в проведении ПЦР в объеме 25 мкл на одну пробу с детекцией полученных результатов методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, отличающийся тем, что реакционная смесь готовится путем смешения буфера 10-кратного для ПЦР - 2,5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,2 мкл, праймера PF (10 пмоль/мкл) - 1 мкл, праймера PR (10 пмоль/мкл) - 1 мкл, Taq полимеразы (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 1 мкл, бидистиллированной воды - 14,1 мкл и пробы ДНК - 5 мкл, при этом амплификацию проводят в следующем режиме: тотальная денатурация 95°C - 5 мин, цикл денатурация (95°C - 20 или 60 сек) - отжиг (56°C - 20 или 60 сек) - элонгация (72°C - 40 или 60 сек), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 35 раз, заключительная элонгация 72°C - 5 мин, хранение 4°C - 10 мин, а по наличию или отсутствию амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности длиной 366 п.н. судят о наличии или отсутствии FIV в организме кошки.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014130601/10A RU2553534C1 (ru) | 2014-07-22 | 2014-07-22 | Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014130601/10A RU2553534C1 (ru) | 2014-07-22 | 2014-07-22 | Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2553534C1 true RU2553534C1 (ru) | 2015-06-20 |
Family
ID=53433657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014130601/10A RU2553534C1 (ru) | 2014-07-22 | 2014-07-22 | Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2553534C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112391500A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-23 | 杭州奥泰生物技术股份有限公司 | 一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030087397A1 (en) * | 1999-01-29 | 2003-05-08 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Multiplex real-time PCR |
| US20060013827A1 (en) * | 2004-06-21 | 2006-01-19 | Dorothee Bienzle | Method of diagnosing FIV |
| RU2317329C2 (ru) * | 2005-05-04 | 2008-02-20 | Дмитрий Валериевич Федосов | Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления днк провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа, и условия полимеразной цепной реакции с их использованием |
-
2014
- 2014-07-22 RU RU2014130601/10A patent/RU2553534C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030087397A1 (en) * | 1999-01-29 | 2003-05-08 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Multiplex real-time PCR |
| US20060013827A1 (en) * | 2004-06-21 | 2006-01-19 | Dorothee Bienzle | Method of diagnosing FIV |
| RU2317329C2 (ru) * | 2005-05-04 | 2008-02-20 | Дмитрий Валериевич Федосов | Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления днк провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа, и условия полимеразной цепной реакции с их использованием |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHANG-FUNG-MARTEL J. ET AL., A door-to-door prevalence study of feline immunodeficiency virus in an Australian suburb, J Feline Med Surg, 2013, v.15, no.12, p. 1070-1078 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112391500A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-23 | 杭州奥泰生物技术股份有限公司 | 一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yapar et al. | Rapid and quantitative detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by one-step real-time reverse transcriptase-PCR | |
| Alvarez-Martínez et al. | Sensitivity and specificity of nested and real-time PCR for the detection of Pneumocystis jiroveci in clinical specimens | |
| Ryschkewitsch et al. | Comparison of PCR-southern hybridization and quantitative real-time PCR for the detection of JC and BK viral nucleotide sequences in urine and cerebrospinal fluid | |
| RU2445370C1 (ru) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции | |
| US7709191B2 (en) | Heteroduplex tracking assay | |
| Gimeno et al. | Detection and differentiation of CVI988 (Rispens vaccine) from other serotype 1 Marek's disease viruses | |
| Fernandez et al. | Screening and confirmatory testing of MHC class I alleles in pig-tailed macaques | |
| US7344830B2 (en) | Heteroduplex tracking assay | |
| CN109576397B (zh) | 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒 | |
| Ruggiero et al. | On-site detection of bovine leukemia virus by a field-deployable automatic nucleic extraction plus insulated isothermal polymerase chain reaction system | |
| Jackwood et al. | Real-time reverse transcriptase–polymerase chain reaction detection and analysis of nucleotide sequences coding for a neutralizing epitope on infectious bursal disease viruses | |
| RU2553534C1 (ru) | Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек | |
| RU2550257C2 (ru) | СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПИЧНЫХ И АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ Yersinia pestis СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ | |
| CN111647690B (zh) | 用于检测covid-19病毒的rt-raa引物对和诊断试剂盒 | |
| RU2615465C2 (ru) | Диагностическая система для выявления днк провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции | |
| Lew et al. | Sensitive and specific detection of bovine immunodeficiency virus and bovine syncytial virus by 5′ Taq nuclease assays with fluorescent 3′ minor groove binder-DNA probes | |
| RU2595373C1 (ru) | Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| Kokawa et al. | Molecular characteristics and prevalence of small ruminant lentiviruses in goats in Japan | |
| Kuriakose et al. | Detection of avian influenza viruses and differentiation of H5, H7, N1, and N2 subtypes using a multiplex microsphere assay | |
| RU2644233C2 (ru) | Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| US20100323341A1 (en) | Heteroduplex tracking assay | |
| Adams et al. | Sensitivity and specificity of a nested polymerase chain reaction for detection of lentivirus infection in lions (Panthera leo) | |
| RU2586504C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров и способ его применения для индикации вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в клиническом материале методом мультиплексной полимеразной цепной реакции | |
| Geng et al. | Specific detection of bovine coronavirus N protein with TaqMan probe qRT-PCR | |
| Najjar et al. | Lab-on-a-chip multiplexed electrochemical sensor enables simultaneous detection of SARS-CoV-2 RNA and host antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160723 |