RU2644233C2 - Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота - Google Patents

Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота Download PDF

Info

Publication number
RU2644233C2
RU2644233C2 RU2016109396A RU2016109396A RU2644233C2 RU 2644233 C2 RU2644233 C2 RU 2644233C2 RU 2016109396 A RU2016109396 A RU 2016109396A RU 2016109396 A RU2016109396 A RU 2016109396A RU 2644233 C2 RU2644233 C2 RU 2644233C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cattle
probe
gene
dna
primers
Prior art date
Application number
RU2016109396A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016109396A (ru
Inventor
Андрей Иванович Никитин
Константин Валерьевич Усольцев
Тагир Хадиевич Фаизов
Альберт Николаевич Чернов
Ирина Игоревна Усольцева
Мария Евгеньевна Семенова
Наиль Ильдарович Хаммадов
Замиля Загитовна Алеева
Фарит Абдуллович Хусниев
Рафаил Мазитович Ахмадеев
Шамиль Завдатович Валидов
Эдуард Аркадьевич Шуралев
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ"
Priority to RU2016109396A priority Critical patent/RU2644233C2/ru
Publication of RU2016109396A publication Critical patent/RU2016109396A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2644233C2 publication Critical patent/RU2644233C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Способ включает использование прямого и обратного олигонуклеотидного праймера, с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена провируса лейкоза крупного рогатого скота, отличающийся тем, что используют в качестве праймеров олигонуклеотиды структуры
Figure 00000017
,
Figure 00000018
а в качестве олигонуклеотидного зонда - зонд RT

Description

Изобретение относится к области химии. Описан способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Способ включает в себя использование прямого и обратного праймера, с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления гена провируса лейкоза крупного рогатого скота. выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.
Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающей прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для выявления фрагмента гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота с электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, в качестве праймеров используют олигонуклеотиды следующей структуры -
Figure 00000001
Figure 00000002
При постановке ПЦР этим способом размер продукта на выходе составляет 438 пар нуклеотидов.
Однако, данный способ требует проведение дополнительной стадии электрофоретической детекции, что повышает вероятность возникновения контаминации (пат. RU №2445370, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.12 г.).
Известен также способ выделения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени, включающий прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена провируса лейкоза крупного рогатого скота с определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. В качестве праймеров используют - Pol (nested, sense)
Figure 00000003
и Pol (nested, antisense)
Figure 00000004
и добавляют в реакционную смесь синтезированный зонд - Pol (molecular beacon)
Figure 00000005
с флуоресцентной меткой. Размер продукта на выходе составляет 202 п.н. (Гулюкин М.И. и др. Применение ПЦР для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота. Харьков, «Ветеринарная медицина», вып. 92. с. 145-150).
В этом способе выявления ДНК провируса крупного рогатого скота методом ПЦР, наиболее близком к предлагаемому, из-за низкой консервативности и малой вариабельности снижается специфичность и эффективность обнаружения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus:prospects for novel antiretroviral therapies in human. N. Gillet, A. Florins, M.Boxus, C. Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers, H. Balon, Amel-BayaBouzar, J. Defoichel, A. Burny, M. Reichert, R. Kettmann and Luc Willems. Rerovirology 2007, 4:18).
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании более специфичного и чувствительного способа обнаружения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР путем использования другой нуклеотидной последовательности генома вируса лейкоза крупного рогатого скота, а именно области гена р24.
Для достижения этого технического результата в способе экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий использование прямого и обратного олигонуклеотидного праймера, с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена провируса лейкоза крупного рогатого скота, выявляют фрагмент гена р24 провируса лейкоза крупного рогатого скота и используют в качестве праймеров олигонуклеотиды структуры:
Figure 00000006
Figure 00000007
а в качестве олигонуклеотидного зонда-зонд
RT
Figure 00000008
меченный с 5'-конца флуоресцентным красителем ROX и с 3'-конца гасителем RTQ2, которые имеют следующие характеристики: отсутствие самокомплементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, температура отжига составляет 61,0°С для PF, 62,2°С для PR 66,4°С для RT и фланкируют область консервативного гена р24 ВЛКРС размером 140 пар нуклеотидов консервативного гена р24 провируса лейкоза КРС, который обнаруживают за счет детекции сигнала флуоресценции.
В результате ПЦР на стадии отжига происходит комплементарное присоединение праймеров и зонда к молекуле ДНК-мишени. Во время стадии элонгации происходит разрушение зонда за счет 3'-нуклеазной активности полимеразы, а флуоресцентная метка (краситель) выходит в реакционную смесь. Детектирующий амплификатор фиксирует свободную флуоресценцию реакционной смеси и по уровню флюоресценции можно контролировать прохождение ПЦР в режиме реального времени.
Отличительными признаками предлагаемого способа экспресс диагностики лейкоза крупного рогатого скота от прототипа, являются использование другой нуклеотидной последовательности генома ВЛКРС, а именно области гена р24, которая отличается более высокой степенью консервативности и использование олигонуклеотидного зонда меченного 5'-конца флуоресцентным красителем ROX и 3'- конца гасителем RTQ2, что позволяет получить достоверный, высокочувствительный, высокоспецифичный способ выявления фрагмента провирусной ДНК ВЛКРС в биологическом материале в течение 4 часов.
Предложенный способ осуществляли с помощью компьютерной программы Vector NTI 9.0 (Introgen, США). На основании информации, представленной в базах данных Интернет ресурсов EMBL (Германия), GenBank(CIIIA), по генотипам ВЛКРС была выбрана референс последовательность - К02120. Для оценки вариабельности и поиска консервативных участков нуклеотидных последовательностей, ограничивающих эту область, был произведен с использованием компьютерной программы BioEdit. В результате анализа была выбрана консервативная нуклеотидная последовательность гена р24. Подборка оптимальных к последовательности гена р24 праймеров и зонда. Проверка качеств, термодинамический анализ выбранных олигонуклеотидов был выполнен с помощью программы Vector NTI 9.0 (Introgen, США). Праймеры были проверены на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека программой BLAST с помощью web-pecypca Национального центра биологической информации (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Оценка специфичности подтвердила гомологичность выбранных праймеров и зонда с нуклеотидной последовательностью гена р24 и отсутствие значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других видов вирусов. Расчетная длина специфического фрагмента составила 140 пар нуклеотидов (п.н.) Схема фланкируемого участка гена р24 генома вируса лейкоза крупного рогатого скота праймерами PF р24_140 и PR р24_140 представлена на рис. 1.
В таблице 1 приведены нуклеотидные последовательности праймеров и зонда, предлагаемые для обнаружения возбудителя лейкоза крупного рогатого скота по гену р24, кодирующего нуклеотидный белок.
Figure 00000009
Представленные праймеры и зонд имеют следующие характеристики: комплементарность к области гена р24 ВЛКРС, отсутствие самокоплементарных участков внутри каждого олигонуклеотида и между собой. Температура отжига составляет 61,0°С для PF p24, 62,2°С для PR р24 и 66,4°С для probe_RTp24. GC состав: 61,9% для PFp24, 63,6% - PR p24, 46,9% для probe_RTp24. Праймеры фланкируют фрагментконсервативного гена р24 ВЛКРС размером 140 пар нуклеотидов. Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре. Характеристика разработанных праймеров приведена в таблице 2.
Figure 00000010
В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции, с использованием разработанных праймеров. Состав реакционной смеси представлен в таблице 3.
Figure 00000011
Как видно из таблицы 3, полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу ДНК.
Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в таблице 4.
Figure 00000012
В качестве положительного контроля прохождения полимеразной цепной реакции с применением разработанных праймеров, используют лиофилизированный препарат положительного контрольного антигена (АГ) ВЛКРС. Препарат получен из вируса, накопленного в вируспродуцирующей культуре клеток почки эмбриона овцы (FLK). Предварительно препарат АГ был испытан в ПЦР анализе с помощью коммерческих наборов для детекции ДНК провируса лейкоза КРС отечественных производителей.
Детекцию результатов проводили в процессе амплификации на стадии «отжига» праймеров посредством детектирующего амплификатора ДТ-96 производства «ДНК-технология». Учет результатов вели по каналу флуоресценции ROX. Результаты анализа показаны в таблице 5 и на рис. 2, показана зависимость флуоресценции канала ROX от номера цикла по накоплению провируса лейкоза, где С 7 - положительный контроль (лиофилизированный препарат положительного контрольного антигена ВЛКРС), С 3 - отрицательный контроль.
Figure 00000013
Из таблицы 5 видно, положительное значение Ср по каналу ROX равное 23,9 свидетельствует о накоплении в процессе ПЦР ожидаемого продукта реакции - участка провирусной ДНК ВЛКРС.
Также учет результатов ПЦР был выполнен с помощью горизонтального электрофореза в 1,8% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
В процессе ПЦР получены продукты амплификации ДНК провируса лейкоза КРС длиной 140 п.н. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов. Электрофореграмма результатов полимеразной цепной реакции представлена на рис. 3, где 1 трэк - маркер молекулярного веса (от 100 до 1000 п. н.); 2 трэк - специфичный ампликон провирусной ДНК ВЛКРС; 3 трэк - ОКО (контрольный отрицательный образец).
В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю (К+), присутствовала светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность соответствовала длине ампликона 140 п.н. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю (К-), такая полоса отсутствовала. Это свидетельствует о наличии искомого участка провирусной ДНК ВЛКРС.
Для определения чувствительности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда был проведен анализ проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений суспензии клеток FLK (вирус продуцирующая культура клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированная вирусом лейкоза КРС). Анализ показал, что последним разведением, в котором проходила ПЦР, является 5 разведение (10-5), что составляет 1,3×101 в.к./мл. Результаты ПЦР в реальном времени представлены в таблице 6 и на рис. 4 по определению чувствительности и специфичности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда, где D 1 - К- - отрицательный контрольный образец; D 2- разведение (10-4); D 3- разведение (10-5); D 4- разведение (10-6); D 5- разведение (10-1); D 6 -разведение (10-2); D 7- разведение (10-3).
Figure 00000014
Для проверки специфичности, разработанные праймеры и зонд проверяли методом ПЦР в реальном времени с использованием следующих образцов ДНК:
1. провирусная ДНК FLK-BLV, выделенной из вирус продуцирующей культуры клеток почки эмбриона овцы (FLK), образец №1;
2. ДНК от здоровых коров, образец №2;
3. провирусная ДНК возбудителя иммунодефицита КРС, образец №3;
4. ДНК герпес вируса возбудителя инфекционного ринотрахеита КРС, образец №4;
5. ДНК Е. coli, образец №5;
6. ДНК бактерий рода Salmonella, образец №6.
Положительный результат в ПЦР получили только с образцами ДНК провирусной ДНК FLK-BLV. В остальных пробах ДНК продукт амплификации отсутствовал, приведены В таблице 7 и на рис. 5 представлены результаты ПЦР по определению специфичности разработанных праймеров и зонда, где С 3- провирусная ДНК FLK-BLV, выделенной из вирус продуцирующей культуры клеток почки эмбриона овцы (FLK), образец №1; С 2-отрицательный контрольный образец; С 4 ДНК от здоровых коров, образец №2; С 5 -провирусная ДНК возбудителя иммунодефицита КРС, образец №3; С 6 -ДНК герпес вируса возбудителя инфекционного ринотрахеита КРС, образец №4; С 7-ДНК Е. coli, образец №5; С 8-ДНК бактерий рода Salmonella, образец №6.
Figure 00000015
Как видно, из вышеописанных примеров, предложенный способ полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием оригинальных праймеров и зонда позволяет обнаруживать провирусную ДНК возбудителя лейкоза крупного рогатого скота.
Выбор высоко консервативной области гена р24 позволяет повысить специфичность данного способа диагностики лейкоза КРС.
Использование предлагаемых специфических праймеров и зонда повышает чувствительность метода ПЦР по сравнению с прототипом до 1,3×101 в.к./мл.
Предложенный способ апробирован с 2009-2015 гг на многих животноводческих фермах Республики Татарстан на более 500 пробах ДНК, полученных из крови крупного рогатого скота. Приводим один из примеров в таблице - 8 и на рис. 6 по амплификации специфических фрагментов ДНК провируса лейкоза КРС с помощью разработанных праймеров и олигонуклеотидного зонда для диагностики лейкоза КРС, где С 3-К- - отрицательный контрольный образец; С7 - отрицательная проба (кровь теленка неинфицированная вирусом лейкоза КРС); С 5-положительная проба (кровь коровы инфицированная вирусом лейкоза крс); С 9 - К+ - положительный контрольный образец.
Figure 00000016
Как видно из таблицы 8, предлагаемый способ экспресс-диагностики лейкоза КРС позволяет достоверно обнаруживать провирус лейкоза КРС в клинических образцах.
Предложенный способ неоднократно апробирован на базе лаборатории биохимии и молекулярно-генетического анализа ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).
Таким образом, предлагаемый достоверный и высокочувствительный способ позволяет сократить время, упростить процесс ранней диагностики лейкоза КРС и выявления вируса лейкоза КРС.

Claims (1)

  1. Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий использование прямого и обратного олигонуклеотидного праймера, с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена провируса лейкоза крупного рогатого скота, отличающийся тем, что выявляют фрагмент гена р 24 провируса лейкоза крупного рогатого скота и используют в качестве праймеров олигонуклеотиды структуры PF: 5'-GGCACCGGGTTCGCAAGTAT-3', PR: 5'-CGGTTAGGCTGGTCATGTGGCC-3', а в качестве олигонуклеотидного зонда - зонд RT р 24 AAACACTACGACTTGCAATCTTACAGGCCGAC, меченный с 5'-конца флуоресцентным красителем ROX и с 3'-конца гасителем RTQ2, которые имеют следующие характеристики: отсутствие самокомплементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, температура отжига составляет 61,0°C для PF, 62,2°C для PR и 66,4°C для зонда RT и фланкируют область консервативного гена р 24 вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 140 пар нуклеотидов, который обнаруживают за счет детекции сигнала флуоресценции.
RU2016109396A 2016-03-15 2016-03-15 Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота RU2644233C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016109396A RU2644233C2 (ru) 2016-03-15 2016-03-15 Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016109396A RU2644233C2 (ru) 2016-03-15 2016-03-15 Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2016109396A RU2016109396A (ru) 2017-09-20
RU2644233C2 true RU2644233C2 (ru) 2018-02-08

Family

ID=59893498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016109396A RU2644233C2 (ru) 2016-03-15 2016-03-15 Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2644233C2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2767688C1 (ru) * 2021-04-07 2022-03-18 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Омский аграрный научный центр" (ФГБНУ "Омский АНЦ") Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2445370C1 (ru) * 2010-10-28 2012-03-20 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции
RU2012144762A (ru) * 2012-10-22 2014-04-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук Способ тестирования вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием пцр-диагностики с флуоресцентной формой детекции

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2445370C1 (ru) * 2010-10-28 2012-03-20 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции
RU2012144762A (ru) * 2012-10-22 2014-04-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук Способ тестирования вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием пцр-диагностики с флуоресцентной формой детекции

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ГУЛЮКИН М.И. и др. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления вируса лейкоза КРС. - Харьков: Ветеринарная медицина, вып.92, с.145-150. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2767688C1 (ru) * 2021-04-07 2022-03-18 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Омский аграрный научный центр" (ФГБНУ "Омский АНЦ") Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016109396A (ru) 2017-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
RU2445370C1 (ru) Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции
RU2727054C1 (ru) Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции
RU2700480C1 (ru) Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
Li et al. Development of a recombinase-aided amplification combined with lateral flow dipstick assay for the rapid detection of the African swine fever virus
KR20180115967A (ko) FCoV, CCoV 및 TGEV를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법
RU2644233C2 (ru) Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота
RU2726555C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
CN116814857A (zh) 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法
KR20190037027A (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법
CN107513583A (zh) 检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量pcr引物及试剂盒
RU2607025C1 (ru) Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления РНК атипичного пестивируса крупного рогатого скота
CN111647690B (zh) 用于检测covid-19病毒的rt-raa引物对和诊断试剂盒
RU2725539C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2700479C1 (ru) Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах
Agnihotri et al. Comparative evaluation of immunochromatographic and reverse transcriptase polymerase chain reaction based tests for diagnosis of canine distemper
RU2595373C1 (ru) Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2726429C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2553534C1 (ru) Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек
RU2728660C1 (ru) Способ определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле
RU2725216C1 (ru) Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2731716C1 (ru) Набор для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота и способ дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота
RU2816852C1 (ru) Способ пцр-идентификации фитопатогенного гриба fusarium oxysporum
Chen et al. Development and application of a recombinase‐aided amplification combined with a lateral flow dipstick assay for rapid visual detection of anguillid herpesvirus 1

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180316