RU2700480C1 - Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах - Google Patents
Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2700480C1 RU2700480C1 RU2018134640A RU2018134640A RU2700480C1 RU 2700480 C1 RU2700480 C1 RU 2700480C1 RU 2018134640 A RU2018134640 A RU 2018134640A RU 2018134640 A RU2018134640 A RU 2018134640A RU 2700480 C1 RU2700480 C1 RU 2700480C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tissues
- gallus
- bacteriophage
- chicken
- meat
- Prior art date
Links
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 43
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims abstract description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 15
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 title abstract description 24
- 241000282887 Suidae Species 0.000 title abstract description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims abstract description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims abstract description 10
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 8
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 25
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 241000287826 Gallus Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 2
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 101001017362 Enterobacteria phage T4 Holin Proteins 0.000 description 1
- 241001329308 Enterobacteria phage T4T Species 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000010494 opalescence Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000020991 processed meat Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах в тест-системе для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающем пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичных для участка генома ДНК нескольких видов мяса олигонуклеотидных праймеров, зондов, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага и положительных контрольных образцов - содержащих фрагменты геномов ДНК нескольких видов мяса, согласно изобретению в качестве генома ДНК мяса используют ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца – смесь, содержащую фрагменты геномов тканей курицы ({Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1:1. Изобретение позволяет расширить функциональные возможности и повысить точность идентификации видовой принадлежности тканей кур свиней. 5 ил., 5 табл.
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.
Известен набор для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции содержащий комплект реагентов для экстракции ДНК из клинического материала, продуктов питания и кормов для животных; комплект реагентов для амплификации ДНК Gallus gallus и Sus scrofa; комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле ((Инструкция по применению тест-системы «ЧИС» для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции, организация-производитель - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва https://docviewer.yandex.ru).
Также известен тест-система, включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичных для участка генома ДНК нескольких видов мяса олигонуклеотидных праймеров, зондов, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага и положительных контрольных образцов - содержащих фрагменты геномов ДНК нескольких видов мяса, (Сорокина М.Ю. Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции, Москва, 2004 - прототип).
Однако известный набор используется для полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле с использованием специфичных для участка генома ДНК баранины и говядины олигонуклеотидных праймеров, нуклеотидная последовательность которых непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, что влияет на точность диагностирования видовой принадлежности мяса в продуктах питания и кормах для животных. Кроме того, известный набор предназначается только для идентификации генома ДНК баранины (Ovis) и говядины (Bos).
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности идентификации видовой принадлежности тканей кур свиней.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающем пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичных для участка генома ДНК нескольких видов мяса олигонуклеотидных праймеров, зондов, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага и положительных контрольных образцов - содержащих фрагменты геномов ДНК нескольких видов мяса, согласно изобретению в качестве генома ДНК мяса используют ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что обеспечивается возможность идентификации видовой принадлежности мяса птицы и свинины с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Сущность изобретения поясняется чертежом, где на рисунках 1-5 представлены скриншоты с дисплея прибора Rotor-Gene Q: рис. 1 - представлен график канала Су5 для внутреннего контрольного образца (ВКО); рис. 2 - таблица количественных данных для Cycling A.Red (ВКО); рис. 3 - представлен график канала JOE/Yellow для специфического сигнала для тканей свиньи (Sus scrofa); рис. 4 - представлен график канала FAM/Green - тканей курицы (Gallus gallus); рис. 5 - таблица количественных данных для Cycling A.Yellow (Sus scrofa) и A. Green (Gallus gallus).
Примеры конкретного применения теста-системы для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.
Для исследования кормов, продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание ДНК в тканях курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) для проведения полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации используют тест-систему включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичных для участка генома ДНК ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Для повышения точности идентификации мяса для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.
Праймеры, специфичные для тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации подобраны олигонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды Su-Znew-r6g (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Su-Fnew и Su-Rnew) и Ga-Znew fam (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Ga-F и Ga-). Зонды были помечены красителями FAM HEX. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Для подтверждения эффективности тест-системы были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.
От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.
Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.
Исследование проводят с помощью набора реагентов
«ПЦР - СВИНИНА-КУРИЦА - ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР- СВИНИНА-КУРИЦА - ФАКТОР» для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-139-51062356-2017, http://www.vetfaktor.ru/.
Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.
* Возможна легкая опалесценция
Исследования состоит из трех этапов:
- экстракция нуклеиновая кислота (НК);
- проведение реакции ПЦР РВ;
- учет результатов анализа.
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательный контрольный образец (ОКО), вносят по 10 мкл внутренний контрольный образец (ВКО) для ткани курицы и свиньи (СК) в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл. Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительный контрольный образец (ПКО) СК, ВКО СК и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага T4 взятых в соотношении 1:1:1.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ СК;
10 мкл ПЦР БУФЕР СК;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.
Интерпретация результатов анализа.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2 и 3 Инструкции.
Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на каналах FAM/Green и JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на каналах JOE/Yellow и/или FAM/Green) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ (рис. 1, 2).
В образце обнаружена ДНК ткани свиньи (Sus scrofa), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 3, 5).
В образце обнаружена ДНК ткани курицы (Gallus gallus), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале FAM/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 4, 5).
Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow и/или FAM/Green значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным (содержание целевой ДНК ниже предела обнаружения метода).
Образец считается отрицательным (ДНК ткани свиньи (Sus scrofa) и/или ткани курицы (Gallus gallus) если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале FAM/Green и/или JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 3,4,5), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.
Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани курицы и свиньи представлен в таблице 5.
Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. Оказалось чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при обнаружении примеси тканей курицы и свиныны в кормах в 10 раз выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.
Claims (10)
- Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичных для участка генома ДНК нескольких видов мяса олигонуклеотидных праймеров, зондов, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага и положительных контрольных образцов - содержащих фрагменты геномов ДНК нескольких видов мяса, отличающийся тем, что в качестве генома ДНК мяса используют ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца – смесь, содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
- Su-Fnew GGAACAGACCTCGTAGAATG
- Su-Rnew GTAGGTCTGGTGAGAATAGTA
- Su-Znew-r6g ACAAAGCAACCCTCACACGATTC
- Ga-F AATTTCGGCTCCCTATTA
- Ga-R TCGTCCGATGTGAAGGAA
- Ga-Znew fam ATGCACTACACAGCAGACACA-BHQ1
- T4F TACATATAAATCACGCAAAGC
- T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG
- T4P CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134640A RU2700480C1 (ru) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134640A RU2700480C1 (ru) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2700480C1 true RU2700480C1 (ru) | 2019-09-17 |
Family
ID=67989843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018134640A RU2700480C1 (ru) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2700480C1 (ru) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2714287C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-02-13 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725216C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725539C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| CN111575356A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-08-25 | 河南正本清源科技发展股份有限公司 | 鱼粉中家禽组织的dna分子检测方法 |
| RU2744595C1 (ru) * | 2019-12-18 | 2021-03-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" | Способ определения аллелей генов ryr1, dmd и esr1 методом пцр в "реальном времени", а также с помощью высокопроизводительной пцр в формате микрочипа |
| RU2769226C1 (ru) * | 2021-09-14 | 2022-03-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Набор олигонуклеотидов для полуколичественной оценки содержания днк курицы в мясной продукции методом пцр в режиме реального времени |
-
2018
- 2018-10-01 RU RU2018134640A patent/RU2700480C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| T. Kozlova, Safety and quality control raw meat and meat products in Russia, Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Science, N 5 (5), 2012, p.33-38, найдено в Интернет 08.09.2019, адрес сайта https:docviewer.yandex.ru/view/0/?*. * |
| СОРОКИНА М.Ю., Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции, авто диссертации, Москва, 2004, весь документ. * |
| СОРОКИНА М.Ю., Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции, автореферат диссертации, Москва, 2004, весь документ. T. Kozlova, Safety and quality control raw meat and meat products in Russia, Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Science, N 5 (5), 2012, p.33-38, найдено в Интернет 08.09.2019, адрес сайта https:docviewer.yandex.ru/view/0/?*. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2714287C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-02-13 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725216C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725539C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2744595C1 (ru) * | 2019-12-18 | 2021-03-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" | Способ определения аллелей генов ryr1, dmd и esr1 методом пцр в "реальном времени", а также с помощью высокопроизводительной пцр в формате микрочипа |
| CN111575356A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-08-25 | 河南正本清源科技发展股份有限公司 | 鱼粉中家禽组织的dna分子检测方法 |
| RU2769226C1 (ru) * | 2021-09-14 | 2022-03-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Набор олигонуклеотидов для полуколичественной оценки содержания днк курицы в мясной продукции методом пцр в режиме реального времени |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2700480C1 (ru) | Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| RU2694713C1 (ru) | Способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| Sawyer et al. | Real-time PCR for quantitative meat species testing | |
| RU2680094C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2645263C1 (ru) | Тест-система для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| CN114774563B (zh) | 一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用 | |
| RU2726555C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2700479C1 (ru) | Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| RU2725539C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2702858C1 (ru) | Тест-система для идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| RU2725216C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2725215C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2725210C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728382C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726429C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726433C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728639C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726248C1 (ru) | Способ выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2714287C1 (ru) | Способ определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728612C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2822748C1 (ru) | Тест-система идентификации ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2734035C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726427C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728662C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201002 |