RU2728662C1 - Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах - Google Patents

Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах Download PDF

Info

Publication number
RU2728662C1
RU2728662C1 RU2019133065A RU2019133065A RU2728662C1 RU 2728662 C1 RU2728662 C1 RU 2728662C1 RU 2019133065 A RU2019133065 A RU 2019133065A RU 2019133065 A RU2019133065 A RU 2019133065A RU 2728662 C1 RU2728662 C1 RU 2728662C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
bacteriophage
tissue
control sample
animal
Prior art date
Application number
RU2019133065A
Other languages
English (en)
Inventor
Олег Юрьевич Черных
Василий Александрович Баннов
Александра Андреевна Котельникова
Денис Владиславович Малышев
Владимир Олегович Черных
Александр Анатолиевич Лысенко
Андрей Георгиевич Кощаев
Роман Анатольевич Кривонос
Владимир Николаевич Шевкопляс
Александр Алексеевич Шевченко
Шахаб Вахидович Вацаев
Татьяна Андреевна Инюкина
Антон Алексеевич Нестеренко
Марина Петровна Семененко
Владимир Григорьевич Семенов
Сергей Николаевич Забашта
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Priority to RU2019133065A priority Critical patent/RU2728662C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2728662C1 publication Critical patent/RU2728662C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ идентификации ДНК ткани кошки домашнейв сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающем выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:T4F TACATATAAATCACGCAAAGCT4R TAGTATGGCTAATCTTATTGGТ4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC, взятых в соотношении 1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК из ткани кошки домашнейи для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани кошки домашнейсо следующей нуклеотидной последовательностью:F ATTCggCCTACATCCgTgAC прямой праймерR AgAAgACCCCTgCTACgACT обратный праймерР R6G-CTTgAgTggAgTAgggCgg-ВНQ1 зонд.Изобретение позволяет повысить точность идентификации видовой принадлежности ткани кошки, упростить процесс подготовки образцов. 5 табл.

Description

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.
Известно использование ПЦР в реальном времени для определения ДНК следующих животных - лошади, коровы, свиньи, осла, курицы, индейки, кошки, собаки и кролика (https://stylab.ru/netcat_files/userfiles/Files/Articles/Meat/Meat_1_04_2013.pdf.).
Также известен метод выявления мяса кошки в говядине и баранине, в котором используют технологию LAMP и ген субъединицы цитохрома с оксидазы I (COXI) на митохондриальной ДНК кошек (https://ru.espacenet.com/publication_Details/biblio?_II=0&ND=3&adiacent=true&locale=ru_RU&FT=D&date=20151111&CC=CN&NR=105039540A&KC=A). Реакцию амплификации проводили на водяной бане при постоянной температуре в течение 40 минут, а результаты наблюдали непосредственно невооруженным глазом, добавляя краситель к конечному продукту.
Наиболее близким по технической сущности является способ идентификации видовой принадлежности тканей животного в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах (патент РФ №2694713, кл. C12Q 1/68, 2019 г.), включающий выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для животного и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер
T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер
Т4Р: НЕХ-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд, взятых в соотношении 1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Недостатком известного технического решения является недостаточная точность из-за использования суспензии бактериофага, которая требует предварительную обработку, включая центрифугирование, концентрирование и перевод в определенный буферный раствор, что влечет за собой значительную трудоемкость и финансовые затраты.
Техническим результатом является повышение точности идентификации видовой принадлежности ткани кошки, упрощение процесса подготовки внутреннего контрольного образца и уменьшение его стоимости.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации ДНК ткани кошки домашней
Figure 00000001
в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающем выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 частиц фага на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер
T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер
Т4Р: НЕХ-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд, взятых в соотношении 1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК из ткани кошки домашней
Figure 00000002
и для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани кошки домашней
Figure 00000003
со следующей нуклеотидной последовательностью:
Figure 00000004
F ATTCggCCTACATCCgTgAC - прямой праймер
Figure 00000005
R AgAAgACCCCTgCTACgACT - обратный праймер
Figure 00000006
Р R6G-CTTgAgTggAgTAgggCgg-BHQ1 - зонд.
Новизна заявляемого способа состоит в идентификации видовой принадлежности ткани кошки с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием в контрольных образцах разных видов бактериофага Т4, что позволяет с высокой точностью определить наличие ДНК ткани кошки в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней
Figure 00000007
в сухих кормах и мясных полуфабрикатах осуществляется следующим образом.
Для исследования сухих кормов и мясных полуфабрикатов на содержание ДНК ткани кошки проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани кошки домашней
Figure 00000007
и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Для повышения точности идентификации ткани кошки для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов ДНК тканей кошки домашней
Figure 00000008
и нативный бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
Figure 00000009
F ATTCggCCTACATCCgTgAC прямой праймер
Figure 00000010
R AgAAgACCCCTgCTACgACT обратный праймер
Figure 00000011
P R6G-CTTgAgTggAgTAgggCgg-BHQ1 - зонд.
T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер
T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер
Т4Р: НЕХ-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд.
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: фаголизата и фрагмента генома нативного бактериофага со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирке, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование фаголизата бактериофага Т4, представляющего собой суспензию бактериофага, полученную после лизиса зараженных фагом клеток ткани, повышает воспроизводимость и упрощает процесс идентификации ткани кошки в продуктах. Использование нативного бактериофага, т.е. неповрежденного при исследовании, улучшает синтез ДНК, что также улучшает качество процесса идентификации.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.
Праймеры, специфичные для кошки домашней
Figure 00000012
были отобраны на основе митохондриальных последовательностей ДНК генома кошки домашней (Felis silvestris lybica isolate Pe4 NADH dehydrogenase subunit 5 (ND5) gene, partial cds; NADH dehydrogenase subunit 6 (ND6) gene, complete cds; tRNA-Glu gene, complete sequence; and cytochrome b (cyt b) gene, partial cds; mitochondrial, код доступа MG813967.1 complete genome, участок между 670 и 767). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации были подобраны олигонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды Felis Р (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Felis F и Felis R) Зонд был помечен красителем R6G. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.
Figure 00000013
F ATTCggCCTACATCCgTgAC - прямой праймер
Figure 00000014
R AgAAgACCCCTgCTACgACT - обратный праймер
Figure 00000015
Р R6G-CTTgAgTggAgTAgggCgg-BHQ1 - зонд.
В качестве внутреннего контроля использовался фаголизат бактериофага Т4, имеющий геномную ДНК порядка 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 600 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер
T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер
Т4Р: НЕХ-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд.
Пример конкретного осуществления способа идентификации идентификации ДНК ткани кошки домашней
Figure 00000016
в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
Для подтверждения эффективности способа были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.
От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.
Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.
Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-КОШКА-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-КОШКА-ФАКТОР» для определения ДНК тканей кошки домашней
Figure 00000017
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-163-51062356-2018, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.
Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.
Figure 00000018
Figure 00000019
Исследования состоит из трех этапов:
Figure 00000020
экстракция нуклеиновая кислота (НК);
Figure 00000020
проведение реакции ПЦР РВ;
Figure 00000021
учет результатов анализа.
* Возможна легкая опалесценция
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани кошки в качестве которого, используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл.
Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) КОШКА, ВКО КОШКА и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани кошки и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
Figure 00000022
F ATTCggCCTACATCCgTgAC прямой праймер
Figure 00000023
R AgAAgACCCCTgCTACgACT обратный праймер
Figure 00000024
Р R6G-CTTgAgTggAgTAgggCgg-ВНQ1 - зонд
T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер
T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер
Т4Р: НЕХ-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ КОШКА;
10 мкл ПЦР БУФЕР КОШКА;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.
Figure 00000025
Интерпретация результатов анализа.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.
Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Figure 00000026
Figure 00000027
Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.
В образце обнаружена ДНК ткани кошки
Figure 00000028
если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).
Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным.
Образец считается отрицательным ДНК
Figure 00000029
не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.
Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания тканей кошки представлен в таблице 5.
Figure 00000030
Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого способа с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с использованием внутреннего контроля в виде суспензии бактериофага, а в заявляемом - использовался фаголизат бактериофага и геном нативного бактериофага. Оказалось чувствительность ПЦР в заявляемом способе при обнаружении примеси ткани собаки в кормах и в мясных фаршах примерно выше в 1,3 раза. Трудоемкость и стоимость процесса определения ДНК ткани собаки в кормах и фаршах снизилась на 3,2-5%.

Claims (7)

  1. Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней
    Figure 00000031
    в сухих кормах тканей и мясных полуфабрикатах, включающий выделение ДНК из тканей животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для животного и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
  2. T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер
  3. T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер
  4. Т4Р: НЕХ-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд, взятых в соотношении 1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, отличающийся тем, что выделяют ДНК из ткани кошки домашней
    Figure 00000032
    и для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани кошки домашней
    Figure 00000033
    со следующей нуклеотидной последовательностью:
  5. Figure 00000034
    F ATTCggCCTACATCCgTgAC - прямой праймер
  6. Figure 00000035
    R AgAAgACCCCTgCTACgACT - обратный праймер
  7. Figure 00000036
    Р R6G CTTgAgTggAgTAgggCgg-BHQ1 - зонд.
RU2019133065A 2019-10-16 2019-10-16 Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах RU2728662C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019133065A RU2728662C1 (ru) 2019-10-16 2019-10-16 Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019133065A RU2728662C1 (ru) 2019-10-16 2019-10-16 Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2728662C1 true RU2728662C1 (ru) 2020-07-30

Family

ID=72085605

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019133065A RU2728662C1 (ru) 2019-10-16 2019-10-16 Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2728662C1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106435008A (zh) * 2016-12-26 2017-02-22 河南科技大学 用于检测鹌鹑性别的引物、试剂盒及检测方法
CN108624659A (zh) * 2018-06-22 2018-10-09 武汉轻工大学 一种检测肉类制品成分的实时定量pcr方法
RU2694713C1 (ru) * 2018-10-01 2019-07-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106435008A (zh) * 2016-12-26 2017-02-22 河南科技大学 用于检测鹌鹑性别的引物、试剂盒及检测方法
CN108624659A (zh) * 2018-06-22 2018-10-09 武汉轻工大学 一种检测肉类制品成分的实时定量pcr方法
RU2694713C1 (ru) * 2018-10-01 2019-07-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2700480C1 (ru) Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах
RU2694713C1 (ru) Способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах
KR101318311B1 (ko) 식품 중의 돼지고기 함량을 확인하는 방법
CN103154268B (zh) 用于检测存在于肉中的驴肉的试剂盒
RU2726555C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
Barry et al. A probe-based real-time PCR assay for the detection of Neospora caninum in clinical samples from cattle
RU2728662C1 (ru) Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2725539C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
CN116814857A (zh) 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法
RU2728639C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2700479C1 (ru) Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах
RU2728612C1 (ru) Способ идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2726427C1 (ru) Способ идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2734035C1 (ru) Способ идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2728382C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2726429C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2726433C1 (ru) Способ идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2742952C1 (ru) Способ идентификации видовой принадлежности тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2726248C1 (ru) Способ выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2714287C1 (ru) Способ определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2823069C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК ткани дальневосточной сардины, или иваси (Sardinops melanostictus), в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2725216C1 (ru) Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
RU2822748C1 (ru) Тест-система идентификации ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2814552C1 (ru) Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2725210C1 (ru) Тест-система для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах