RU2814552C1 - Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени - Google Patents
Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814552C1 RU2814552C1 RU2023116701A RU2023116701A RU2814552C1 RU 2814552 C1 RU2814552 C1 RU 2814552C1 RU 2023116701 A RU2023116701 A RU 2023116701A RU 2023116701 A RU2023116701 A RU 2023116701A RU 2814552 C1 RU2814552 C1 RU 2814552C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tissue
- dna
- animal
- primer
- fluorescent
- Prior art date
Links
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 241001147168 Scomber australasicus Species 0.000 title claims abstract description 26
- 241000736084 Scomber japonicus Species 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 title claims abstract description 14
- 241000534669 Albula vulpes Species 0.000 title claims abstract description 10
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 title claims abstract description 10
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 title claims abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 18
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 abstract description 9
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 abstract description 8
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 6
- 241000276495 Melanogrammus aeglefinus Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 3
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 2
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101001017362 Enterobacteria phage T4 Holin Proteins 0.000 description 1
- 241001329308 Enterobacteria phage T4T Species 0.000 description 1
- 101000861034 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit 3 Proteins 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- 241000276489 Merlangius merlangus Species 0.000 description 1
- 241001609028 Micromesistius poutassou Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 101150087530 mt:ATPase6 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Описан способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах. Выделяют ДНК из ткани животного сорбционным методом. Осуществляют постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер,
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер,
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1. Измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей. Проводят интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией. Так, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. При этом согласно изобретению выделяют ДНК из ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и для положительного контрольного образца используют фрагмент генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) со следующей нуклеотидной последовательностью:
Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер,
Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер,
Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд. Изобретение может быть использовано для расширения функциональных возможностей и повышения точности идентификации видовой принадлежности тканей рыб. 5 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к идентификации видовой принадлежности тканей рыб с помощью полимеразной цепной реакции.
Известен способ видовой идентификации рыб семейства тресковых методом пцр в режиме реального времени, в котором выделяют ДНК из проб тканей рыб или из образца пищевого продукта (продовольственного сырья). Проводят анализ методом полимерной цепной реакции в режиме реального времени для выявления специфических последовательностей ДНК рыб с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов, установленных для каждого вида рыб. Готовят смесь для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР. Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией Threshold и значением порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30. ДНК пикши {Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши {Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышает 30. Для определения путассу {Micromesisteus poutassou) и сайды {Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30 в пробирках/реакторах с тест-системами. Предлагаемый способ позволяет провести идентификацию всех видов тресковых рыб в рамках одного анализа и получить результат анализа быстрее по сравнению с существующими методами (патент РФ №2748058, кл. C12Q 1/68, 2021 г.).
Наиболее близким по технической сущности является способ идентификации видовой принадлежности тканей животного в продовольственном сырье, кормах, включающий выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGAC CGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный (патент РФ №2726433, кл. C12Q 1/68, 2020 г.).
Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности идентифицировать ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах.
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности идентификации видовой принадлежности тканей рыб.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах, включающем выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red -для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК из ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и для положительного контрольного образца используют фрагмент генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) со следующей нуклеотидной последовательностью:
Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер
Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер
Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд.
Новизна заявляемого способа состоит в идентификации видовой принадлежности ткани рыб, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в сырых рыбных продуктах (частях туши, икре, полуфабрикатах и т.д.), в рыбных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке, а также в мясокостной рыбной муке и кормах.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических и сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах, осуществляют следующим образом.
Для исследования наличия ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в сырых рыбных продуктах (частях туши, икре, полуфабрикатах и т.д.), в рыбных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке, а также в мясокостной рыбной муке и кормах проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и Cy5/Red -для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Для повышения точности идентификации ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) для внутреннего контрольного образца используют бактериофага Т4 с концентрацией 5x103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер
Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер
Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд.
Использование бактериофага Т4 со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование бактериофага Т4 повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани рыб в продуктах, а также улучшает качество процесса идентификации.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.
Праймеры, специфичные японской скумбрии (Scomber japonicus) были отобраны на основе митохондриальной последовательности ДНК генома японской скумбрии (Scomber japonicus) ген цитохромоксидаза III (Scomber japonicus mitochondrial ATPase6, COIII genes for ATPase subunit 6, cytochrome oxidase subunit III, partial cds, haplotype: SjaATCOH9, GenBank: AB361466.1 участок между 25 и 179). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации были подобраны олигонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды Sj-Z (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Sj-F и Sj-R). Зонд был помечен красителем HEX (JOE/Yellow). Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей:
Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер
Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер
Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд, не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Пример конкретного осуществления способа идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах
Для подтверждения эффективности способа были использованы сырые рыбные продукты (части туши, икра, полуфабрикаты и т.д.), рыбные продукты, подвергшихся кулинарной обработке, а также мясокостная рыбная мука и корма.
От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.
Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.
Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-СКУМБРИЯ-1-ФАКТОР». Под словом «СКУМБРИЯ-1» авторы подразумевают набор реагентов используемых для выявления ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus). Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах:
1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР- СКУМБРИЯ -1-ФАКТОР» для определения ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-252-51062356-2021, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/. Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.
Исследования состоит из трех этапов:
- экстракция нуклеиновая кислота (НК);
- проведение реакции ПЦР РВ;
- учет результатов анализа.
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани японской скумбрии, в качестве которого, используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл.
Следующий этап, это подготовка образцов к проведению ПЦР.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) СКУМБРИЯ -1, ВКО СКУМБРИЯ -1 и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани японской скумбрии и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ СКУМБРИЯ-1;
10 мкл ПЦР БУФЕР СКУМБРИЯ-1;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.
Интерпретация результатов анализа. Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.
Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.
В образце обнаружена ДНК ткани японской скумбрии, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).
Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным.
Образец считается отрицательным (ДНК ткани японской скумбрии не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red - менее 35.
Для исследуемых образцов (сухой корм и рыбные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани японской скумбрии представлен в таблице 5.
Claims (8)
- Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах, включающий выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащей фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
- T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер,
- T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер,
- Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1, и
- измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, отличающийся тем, что выделяют ДНК из ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и для положительного контрольного образца используют фрагмент генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) со следующей нуклеотидной последовательностью:
- Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер,
- Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер,
- Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2814552C1 true RU2814552C1 (ru) | 2024-03-01 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003214306B2 (en) * | 2002-01-10 | 2008-07-10 | Bio Merieux | Method for the detection and/or identification of the original animal species in animal matter contained in a sample |
| RU2748058C1 (ru) * | 2020-10-13 | 2021-05-19 | Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит" | Способ видовой идентификации рыб семейства тресковых методом пцр в режиме реального времени |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003214306B2 (en) * | 2002-01-10 | 2008-07-10 | Bio Merieux | Method for the detection and/or identification of the original animal species in animal matter contained in a sample |
| RU2748058C1 (ru) * | 2020-10-13 | 2021-05-19 | Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит" | Способ видовой идентификации рыб семейства тресковых методом пцр в режиме реального времени |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2694713C1 (ru) | Способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| RU2700480C1 (ru) | Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| WO2004101815A1 (en) | Identification of clonal cells by repeats in (eg.) t-cell receptor v/d/j genes | |
| RU2645263C1 (ru) | Тест-система для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| CN113718063A (zh) | 同时检测asfv、pcv2和prv病毒的多重芯片数字pcr引物、试剂盒及检测方法 | |
| RU2726555C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2814552C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2725539C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2700479C1 (ru) | Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| CN107299145B (zh) | 用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒 | |
| RU2816210C1 (ru) | Тест-система идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2725216C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726248C1 (ru) | Способ выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2714287C1 (ru) | Способ определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2734035C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2725210C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728662C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726429C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726427C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728612C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2726433C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728382C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2725215C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2728639C1 (ru) | Тест-система для идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |