CN107299145B

CN107299145B - 用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN107299145B
Application number: CN201710706956.7A
Authority: CN
Inventors: 杨庆利
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2037-08-17
Also published as: CN107299145A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒。所述引物组选自SEQ ID NO:1～4所示的核苷酸序列。该引物组具有特异性好、扩增效率高的优点，在PCR扩增过程中不会形成引物二聚体、非特异扩增和交叉反应，避免非目的产物的出现对结果的影响，同时扩增效率高，检测信号强。

Description

用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒。

背景技术

华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）寄生在人体肝内胆管，可引起华支睾吸虫病（clonorchiasis）甚至胆管癌。华支睾吸虫病的发生和流行主要与人群嗜食生的淡水鱼类等食物的饮食习惯有关。据调查，在华支睾吸虫病流行严重的广西，其人群华支睾吸虫平均感染率为9.76%；其中个别流行县的人群感染率甚至超过20%。扇棘单睾吸虫（Haplorchis taichui）是一种寄生在肠道的异形吸虫科的吸虫。扇棘单睾吸虫在广西等地的华支睾吸虫流行区人群中普遍感染。根据调查，广西某些肝吸虫病流行区人群，扇棘单睾吸虫感染率高达71.4%。华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫对人体的危害程度差别很大，前者对人体危害严重，且治疗较困难；而后者对人体危害轻微，治疗容易。因此，二者的鉴别诊断非常重要。

华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫的大小和形态差别很大，容易鉴别。目前，人体华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫感染的诊断主要依靠粪便虫卵检查。但二者的虫卵在大小和形态上非常接近，通过“Kato-Katz”法或“醛-醚”法等常规粪便虫卵检查很难从形态上区分，往往不能做出明确的鉴别诊断，严重影响临床治疗和疾病监测。

通过PCR法检测华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫DNA是一种高效、特异的鉴别诊断方法。目前，可通过基于华支睾吸虫核糖体 DNA ITS 区和/或COX1（cytochrome c oxidasesubunit 1）基因以及扇棘单睾吸虫5.8S rDNA的PCR法明确鉴别出这两种吸虫，但该技术的缺陷在于：需要针对不同检测靶基因，分别在2个PCR反应体系中进行PCR扩增反应；检测过程存在操作繁琐，效率低下的缺陷；由于针对不同基因进行PCR扩增，鉴别检测结果存在偏差的可能。综合认为，目前鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的PCR检测引物和方法不适合实际的临床诊断和疾病监测工作。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种引物组，并提供了包含该引物组的试剂盒以及其使用方法。所述引物组能够在同一个反应体系中高效、快速地对扩增华支睾吸虫及扇棘单睾吸虫的相关基因，并且可以根据扩增结果准确地对上述两种寄生虫进行鉴定位点进行检测鉴别。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组，选自SEQ ID NO: 1~4所示的核苷酸序列。

本发明通过大量研究分析对比，优选一个基因作为PCR法鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的靶基因；并通过优化引物设计，实现在单管PCR反应体系内同时检测这两种吸虫。本发明成功解决了针对不同基因进行华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫PCR鉴别诊断的偏差，以及分别进行PCR扩增反应的操作繁琐和效率低下等问题。

本发明提供的引物组通过巧妙的引物设计，避免华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的扩增产物在分子量大小上出现重叠，使扩增结果简单明确、一目了然，从而可以快速、准确地根据检测结果对两种寄生虫进行检测鉴别。本发明上述2对上下游引物具有特异性好、扩增效率高的优点，在PCR扩增过程中不会形成引物二聚体、非特异扩增和交叉反应，避免非目的产物的出现对结果的影响，同时扩增效率高，检测信号强。

本发明还提供了一种用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的试剂盒，试剂盒可以包括储存反应试剂（例如在合适容器中的引物、探针、酶等）和/或支持材料（例如缓冲液、试验检测的说明书等）。例如，所述试剂盒包括如上所诉的引物组以及PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。

本发明提供的试剂盒还可包含除本发明的引物组之外的其他任何引物组和/或探针，以上内容不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。

优选的，如上所述的试剂盒，所述引物组混合在一起；

更优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~4所示的引物的摩尔浓度比为（0.8~1.2）:（0.8~1.2）:（0.8~1.2）:（0.8~1.2）；

更优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~4所示的引物的摩尔浓度比为1:1:1:1。

本发明上述引物组对各引物的摩尔比进行限定，在该摩尔比范围内，PCR反应的扩增信号强。

优选的，如上所述的试剂盒，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶以及Klenow片段中的一种或多种。

优选的，如上所述的试剂盒，所述上样缓冲液选自甲酰胺和/或去离子甲酰胺。

本发明还涉及一种检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的方法，包括：

1）、提取待检样本的DNA；

2）、用权利要求1所述的引物组或权利要求2~5任一项所述的试剂盒对所述待检样本的DNA进行扩增；

3）、对扩增产物进行电泳检测；

若出现328bp的条带，则说明待检样本中含有华支睾吸虫；若出现200bp的条带，则说明待检样本中仅含有扇棘单睾吸虫。

所述方法为诊断和/或非诊断目的的检测鉴别。

其中，可选的，如上所述的方法，在步骤1）提取待检样本的DNA后，还可以通过本领域常规的纯化方法对DNA进行纯化。

优选的，如上所述的方法，提取待检样本的DNA的提取方法包括饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法。

基于引物Tm值选择合适的PCR反应条件的方法是本领域所公知的，本领域技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最佳条件。例如在步骤2）中，扩增时的退火温度为53℃~57℃，反应循环33~37次；更优选的，退火温度为55℃，反应循环35次。

优选的，如上所述的方法，在步骤2）中，扩增时的反应体系中所述引物组中各引物的浓度均为0.3µM~0.5µM；还可以选择0.4µM。

优选的，如上所述的方法，在步骤3）中，对扩增产物进行电泳检测时采用2%~3%质量分数的琼脂糖凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）、本发明所用引物特异性好，扩增效率高，灵敏度高，假阴性率低，所需模板量较少即可完成PCR反应。

2）、各条引物之间不会形成引物二聚体，且具有相同的Tm值，可在一个PCR反应中同时完成华支睾吸虫及扇棘单睾吸虫的鉴别，提高了检测鉴别效率，降低了检测鉴别成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为用单纯PCR法扩增华支睾吸虫DNA的电泳图；1~8为华支睾吸虫阳性DNA样品；9~12为阴性对照DNA样品；13为无DNA模板空白对照；M：100 bp DNA分子量标记；

图2为用单纯PCR法扩增扇棘单睾吸虫DNA的电泳图；1~8为扇棘单睾吸虫阳性DNA样品；9~12为阴性对照DNA样品；13为无DNA模板空白对照；M：100 bp DNA分子量标记；

图3为用单管PCR法同时扩增华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫DNA；1~8为华支睾吸虫阳性DNA样品；9~16为扇棘单睾吸虫阳性DNA样品；17~20为阴性对照DNA样品；21为无DNA模板空白对照；M：100 bp DNA分子量标记。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

根据我们长期的检测实践，对于DNA模板含量低（< 1.0 ng/µL）的标本，用COX1基因进行PCR扩增的灵敏度明显高于基于ITS1、ITS2区的PCR扩增。本项发明是基于从消化处理后的成虫、囊蚴和虫卵等标本中用常规方法提取纯化出的吸虫基因组DNA，通过前期大量对比实验优选出COX1基因作为PCR法鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的靶基因。通过优化引物设计，优选出2对高度特异性和灵敏性的PCR检测引物；通过优化PCR反应体系和条件成功地实现在单管内同时检测两种吸虫的DNA。

具体PCR检测过程如下：

1. DNA提取：取成虫、分离后的囊蚴和含虫卵粪便等标本，用常规试剂和方法提取DNA。

2 . PCR检测引物设计：分别基于华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫COX 1基因设计PCR引物。引物设计时分别使华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫PCR扩增产物长度在200~400 bp之间，并保证二者之间长度差别大于100 bp，目的是使其二者的电泳条带之间容易区分。检测引物如表1所示。

表1 华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫COX 1基因单管PCR检测引物

3. PCR反应体系：采用单管反应体系分别或同时检测华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫DNA。具体PCR反应体系如表2所示。

表2 华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫单管PCR反应体系

4. PCR反应条件：按照以下条件进行。

DNA模板预变性：94 °C，5 分钟；1个循环

PCR扩增：94 °C，30秒；

55°C，30秒；

72°C，30秒；共35个循环

延伸：72°C，5分钟，1个循环

反应结束。

5. PCR产物检测：PCR反应产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。每孔加样量为5~10 µL。用100 bp DNA分子量标记指示条带大小。

用华支睾吸虫特异性引物对8份华支睾吸虫DNA阳性标本进行PCR扩增，结果均出现明显的特异性阳性反应条带（如图1所示）。用扇棘单睾吸虫特异性引物对8份扇棘单睾吸虫DNA阳性标本进行PCR扩增，结果也出现明显的特异性阳性反应条带（如图2所示）。而对4份阴性对照DNA样品（为其它类吸虫杂囊蚴来源的DNA）的检测均未出现阳性反应（如图1、图2所示）。

然后，用华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫特异性引物在单管内，按照表2所示反应体系对上述20份DNA样品进行PCR扩增。结果显示：用此单管反应体系和反应条件可同时对华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫COX 1基因进行扩增，其相互间无任何交叉反应和干扰（如图3所示）。

6. 同时鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的单管PCR检测引物组合的应用：对于用形态学方法鉴别不清的华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫囊蚴（来源于淡水鱼类等）以及粪便原始标本（内含华支睾吸虫虫卵、扇棘单睾吸虫的成虫或虫卵），可首先用普通商用DNA提取试剂或其它经典方法提取DNA；然后用该2对优化的PCR检测引物组合，配合常规PCR扩增试剂，在单管内进行PCR扩增反应，可实现对华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫感染的快速鉴别诊断。该项发明专利对于临床疾病诊断和疾病预防控制均有重要价值和意义。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区疾病预防控制中心

<120> 用于检测鉴别华支睾吸虫和或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcctatagtg aaaagcacca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttaatattg ccggggtttg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgggttggat gttaagacg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagaagacaa cacaatcccg 20

Claims

1.一种用于同时检测鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的引物组，选自SEQ ID NO: 1~4所示的核苷酸序列。

2.一种用于同时检测鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物组以及PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组混合在一起；

核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~4所示的引物的摩尔浓度比为（0.8~1.2）:（0.8~1.2）:（0.8~1.2）:（0.8~1.2）。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组混合在一起；核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~4所示的引物的摩尔浓度比为1:1:1:1。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上样缓冲液选自甲酰胺和/或去离子甲酰胺。

7.一种用于非疾病诊断目的的检测鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的方法，其特征在于，包括：

1）、提取待检样本的DNA；

2）、用权利要求1所述的引物组或权利要求2~6任一项所述的试剂盒对所述待检样本的DNA进行扩增；

3）、对扩增产物进行电泳检测；

若出现328bp的条带，则说明待检样本中含有华支睾吸虫；若出现200bp的条带，则说明待检样本中含有扇棘单睾吸虫。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，提取待检样本的DNA的提取方法包括饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，扩增时的退火温度为53℃~57℃，反应循环33~37次。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，扩增时的反应体系中所述引物组中各引物的浓度均为0.3µM~0.5µM。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，对扩增产物进行电泳检测时采用2%~3%质量分数的琼脂糖凝胶。