KR101764128B1 - 식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 새우 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents
식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 새우 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101764128B1 KR101764128B1 KR1020160079150A KR20160079150A KR101764128B1 KR 101764128 B1 KR101764128 B1 KR 101764128B1 KR 1020160079150 A KR1020160079150 A KR 1020160079150A KR 20160079150 A KR20160079150 A KR 20160079150A KR 101764128 B1 KR101764128 B1 KR 101764128B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- primer
- shrimp
- seq
- dna
- species
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 식품 원료로 사용되는 새우 종(species)의 진위여부 판별용 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 식품 원료의 진위여부를 판별하는 방법 및 DNA 칩 및 키트에 대한 것으로, 새우의 종간에 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서 식품 내의 새우 원료의 종판별을 간단하고 용이하게 할 수 있는 것이다.
Description
본 발명은 식재료로 사용되는 새우 7종의 품종을 판별하기 위한 것으로, 특히 7종 새우의 종간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로, 식재료로 사용되는 새우에 대한 유전자형을 분석하고, 식품 중 새우 원료 판별용 프라이머 세트, 이를 이용하여 간단하고 신속하게 원료를 판별할 수 있는 방법 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
새우는 갑각류에 속하는 생물로서 약 2,500종이 존재한다고 알려져 있으며, 종에 따라 풍미가 다른 것으로 알려져 있다. 수산물은 흔하게 국제적으로 거래되고 있으며, 특히 새우는 수산 및 양식업 관련 분야에서 중요 자원으로, 세계 해산물 소비량의 17% 이상을 차지한다고 집계된 바 있다 (De Grave, Cai & Anker, 2008).
일반적으로, 식품에서 종을 확인하기 위하여 형태(외형)를 분석하는 방법을 이용해왔다. 하지만, 새우는 종간 표현형이 유사하며 가공 중에 껍질을 벗겨 이용하는 경우가 빈번하므로 기존의 방법을 사용하는 데에 어려움이 따른다. 이러한 특징들 때문에 새우를 식재료로 사용함에 있어서, 비의도적인 혼입이나 원재료 표기에 대한 오류가 일어날 수 있으며, 고품질의 재료를 유사한 저급의 재료로 고의적으로 대체하는 경우 역시 발생할 수 있다. 이러한 점들 때문에 신속하고 정확하게 새우의 종을 판별할 수 있는 방법이 필요하다 (Wanna, Chotigeat & Phongdara, 2006).
새우의 종을 판별하기 위한 몇몇 방법이 보고된 바 있다. Isoelectric focusing (IEF)는 종판별 시 사용하는 단백질 기반 실험방법 중 가장 흔하게 사용된다. IEF는 섞여있는 단백질을 겔 상에서 등전점에 따라 분리하고, 이를 이용해 종을 분석할 수 있는 방법이다. 하지만 이 방법은 시간 소모가 많고 힘들며, 열에 취약한 단백질의 경우 열가공시 안정성이 부족하여 제대로 적용하기 어렵다는 단점이 있다(Pineiro, Barros-Velazquez, Vazquez, Figueras & Gallardo, 2003).
Enzyme linked immunoassay (ELISA)는 항원-항체 반응을 이용해 종을 판별하는 방법이다. 이 방법은 비교적 간단하고, 특이적이며 민감도가 높지만, 근연종의 경우는 항체가 교차반응을 일으킬 수 있으며, 상업적으로 널리 이용되고 있는 항체는 종을 판별하는데 적용하기엔 어렵다 (Ortea, Pascoal, Canas, Gallardo, Barros- Velazquez, & Calo-Mata, 2012).
Matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight (MALDI-TOF)는 시료에 레이저를 조사해 이온화시켜, 전하를 띤 이온이 질량분석기를 통과하여 검출기까지 도달하는데 걸리는 시간을 측정해 분석하는 방법으로, 상대적으로 비용이 저렴하고 간단하지만, 고순도의 샘플이 필요하다 (Ortea, Canas, Calo-Mata, Barros-Velazquez, & Gallardo, 2009).
DNA는 단백질에 비해 가공식품에서의 안정성이 뛰어나고, 모든 생물조직에 존재하며, 소량의 샘플에서도 추출이 가능하다. 또한 미토콘드리아 DNA의 경우, 일반적으로 핵 DNA보다 진화속도가 빠르므로 근연종을 분석하는데 유리하며, 한 세포당 여러 카피의 DNA가 존재하므로 PCR을 이용해 증폭하기가 용이하다. 따라서 DNA를 이용한 PCR 기반 방법은 종판별에 있어 기존 방법을 대체하는 대안이 될 수 있다 (Lockley & Bardsley, 2000; Kochzius, Seidel, Antoniou, Botla, Campo, Cariani & Hreggvidsson, 2010).
종 특이 프라이머를 사용하는 PCR 분석법은 다양한 종류의 유제품, 해산물, 식육원료 등의 정확한 종 판별을 위해 사용되어져 왔다. 하지만, 새우류에서 종특이적 마커를 이용한 대부분의 연구들은 식품원료에 대한 진위판별을 위한 종 판별보다는 분류군의 계통 유연관계나 집단 유전적 다양성 분석을 목적으로 사용되는 경우가 많았다 (Nicole, Negrisolo, Eccher, Mantovani, Patarnello, Erickson & Barcaccia, 2012).
국내에서는 저렴한 수입새우가 대하로 판매되는 등 경제적 이득을 취하기 위해 외형이 유사한 새우를 판매하는 사례가 있었고, 일부 지역에서는 특정 새우종이 회로 소비되며 고가에 거래되는 등 새우의 경제적 가치가 높아지는 현실을 반영했을 때, 새우의 종을 정확히 판별하기 위한 방법의 필요성이 증대되는 실정이다.
하지만, 이러한 새우 원료의 진위여부 판별과 관련하여 가공처리된 식품에서도 분석이 가능하고, 섞여 있는 샘플에서도 여러 종을 판별할 수 있는 신속하고 일상적인 방법에 대한 분자 생물학적인 연구는 국내외에서 그 사례를 찾기 어려운 실정이다.
<참고문헌>
1. De Grave, S., Cai, Y., & Anker, A. (2008). Global diversity of shrimps (Crustacea: Decapoda: Caridea) in freshwater. Hydrobiologia, 595(1), 287-293.
2. Wanna, W., Chotigeat, W., & Phongdara, A. (2006). Sequence variations of the first ribosomal internal transcribed spacer of Penaeus species in Thailand. Journal of experimental marine biology and ecology, 331(1), 64-73.
3. Pineiro, C., Barros-Velazquez, J., Vazquez, J., Figueras, A., & Gallardo, J. M. (2003). Proteomics as a tool for the investigation of seafood and other marine products. Journal of proteome research, 2(2), 127-135.
4. Ortea, I., Pascoal, A., Canas, B., Gallardo, J. M., Barros-Velazquez, J., & Calo-Mata, P. (2012). Food authentication of commercially-relevant shrimp and prawn species: From classical methods to Foodomics. Electrophoresis, 33(15), 2201-2211.
5. Ortea, I., Canas, B., Calo-Mata, P., Barros-Velazquez, J., & Gallardo, J. M. (2009). Arginine kinase peptide mass fingerprinting as a proteomic approach for species identification and taxonomic analysis of commercially relevant shrimp species. Journal of agricultural and food chemistry, 57(13), 5665-5672.
6. Linacero, R., Ballesteros, I., Sanchiz, A., Prieto, N., Iniesto, E., Martinez, Y., ... & Burbano, C. (2016). Detection by real time PCR of walnut allergen coding sequences in processed foods. Food chemistry, 202, 334-340.
7. Lockley, A. K., & Bardsley, R. G. (2000). DNA-based methods for food authentication. Trends in Food Science & Technology, 11(2), 67-77.
8. Kochzius, M., Seidel, C., Antoniou, A., Botla, S. K., Campo, D., Cariani, A., ... & Hreggvidsson, G. (2010). Identifying fishes through DNA barcodes and microarrays. PLoS One, 5(9), e12620.
9. Nicole, S., Negrisolo, E., Eccher, G., Mantovani, R., Patarnello, T., Erickson, D. L., ... & Barcaccia, G. (2012). DNA barcoding as a reliable method for the authentication of commercial seafood products. Food Technology and Biotechnology, 50(4), 387.
10. Pereira, F., Carneiro, J., & Amorim, A. (2008). Identification of species with DNA-based technology: current progress and challenges. Recent patents on DNA & gene sequences, 2(3), 187-200.
11. Teletchea, F., Maudet, C., & Hanni, C. (2005). Food and forensic molecular identification: update and challenges. Trends in biotechnology, 23(7), 359-366.
12. Yamashita, M., Namikoshi, A., Iguchi, J., Takashima, Y., Hossain, M. A., Yabu, T., & Yamashita, Y. (2008). Molecular identification of species and the geographic origin of seafood. Fisheries for global welfare and environment. Terrapub, Tokyo, 297-306.
13. Gil, L. A. (2007). PCR-based methods for fish and fishery products authentication. Trends in Food Science & Technology, 18(11), 558-566.
14. Sotelo, C. G., Pineiro, C., Gallardo, J. M., & Perez-Martin, R. I. (1993). Fish species identification in seafood products. Trends in Food Science & Technology, 4(12), 395-401.
15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., & Madden, T. L. (2012). Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics, 13(1), 1.
16. Ballin, N. Z., Vogensen, F. K., & Karlsson, A. H. (2009). Species determination?Can we detect and quantify meat adulteration?. Meat science, 83(2), 165-174.
17. Rasmussen, R. S., & Morrissey, M. T. (2008). DNA?based methods for the identification of commercial fish and seafood species. Comprehensive reviews in food science and food safety, 7(3), 280-295.
18. Woolfe, M., & Primrose, S. (2004). Food forensics: using DNA technology to combat misdescription and fraud. TRENDS in Biotechnology, 22(5), 222-226.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 식품원료 내에 존재하는 새우의 유전자형에 따라, 새우의 종을 구별하여, 간단하고 신속하게 상기 새우의 종을 판별할 수 있는 프라이머를 제공하는 것이 목적이다.
새우의 종을 판별함에 있어서, 염기서열의 차이가 밝혀졌다고 하더라도 이를 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 표준화된 방법이 있으면 많은 시간과 자원, 비용을 절약할 수 있다. 본 발명에서는 식품원료로 사용되는 새우의 주요 종 7종 염기서열의 차이를 파악하고, 이를 근거로 하여 각 종마다 차이가 나도록 폴리뉴클레오티드 프라이머를 제작하기 위한 것이며, 이를 포함하는 키트 또는 DNA칩을 이용하여 해당 종에 따른 염기서열 차이를 신속, 정확하게 분석할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 새우 종간에 염기서열 차이가 있는 부위를 포함하는 연속적인 뉴클레오티드로 구성되는 프라이머와 이것을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 형태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 다른 형태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 중합효소연쇄반응 시켜 증폭하는 단계; 및 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 식품 중 새우 품종의 진위여부를 확인하는 단계를 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별방법일 수 있다.
이와 함께, 본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 프라이머 세트를 포함하는 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 키트일 수도 있다.
본 발명은 식품 원료로 주로 사용되는 다양한 새우의 종 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로 대상 새우의 유전자형에 따라, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 DNA 칩이나 키트로 제작되어, 육안으로는 판별이 힘든 조미 가공물 또는 분말가루 등에 대해서도, 하나의 키트에 시료를 넣는 것만으로도 식품 중 새우 원료의 진위여부를 판별할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간이 크게 단축되어, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있다.
도 1 내지 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 종특이적 프라이머 디자인을 하기 위하여, 7종 새우의 미토콘드리아 유전자의 염기서열을 순서대로 배열한 것을 나타낸 것으로,
도 1은 대하의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 보리새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 바나나새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 블랙타이거새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 도화새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 6은 큰징거미새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 흰다리새우의 미토콘드리아 DNA 중 Cytochrome B 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 각각의 프라이머를 사용하여 혼합시료로부터 추출된 DNA의 증폭 산물의 크기를 나타낸 사진이다 (a는 대하 종특이 프라이머, b는 보리새우 종특이 프라이머, c는 바나나새우 종특이 프라이머, d는 블랙타이거새우 종특이 프라이머, e는 도화새우 종특이 프라이머, f는 흰다리새우 종특이 프라이머, g는 큰징거미새우 종특이 프라이머를 사용한 것).
도9a는 대하 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, 레인 6은 0.00005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9b는 보리새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9c는 바나나새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9d는 블랙타이거새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9e는 도화새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, 레인 6은 0.00005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9f는 흰다리새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, 레인 6은 0.00005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9g는 큰징거미새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 종특이적 프라이머 세트를 이용하여 수집한 시료(칵테일 새우) 속에 포함된 새우의 종을 판별한 사진이다(a,b 및 c는 각각 칵테일 새우 샘플 1, 2 및 3번 샘플의 결과를 나타낸 것이다).
도 1은 대하의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 보리새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 바나나새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 블랙타이거새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 도화새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 6은 큰징거미새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 흰다리새우의 미토콘드리아 DNA 중 Cytochrome B 유전자 부위의 염기서열과 다른 새우들의 유전자 서열을 비교하여 나열한 것이고, 밑줄은 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 각각의 프라이머를 사용하여 혼합시료로부터 추출된 DNA의 증폭 산물의 크기를 나타낸 사진이다 (a는 대하 종특이 프라이머, b는 보리새우 종특이 프라이머, c는 바나나새우 종특이 프라이머, d는 블랙타이거새우 종특이 프라이머, e는 도화새우 종특이 프라이머, f는 흰다리새우 종특이 프라이머, g는 큰징거미새우 종특이 프라이머를 사용한 것).
도9a는 대하 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, 레인 6은 0.00005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9b는 보리새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9c는 바나나새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9d는 블랙타이거새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9e는 도화새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, 레인 6은 0.00005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9f는 흰다리새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, 레인 5는 0.0005 ng/μDNA, 레인 6은 0.00005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도9g는 큰징거미새우 종특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 1은 5 ng/μDNA, 레인 2는 0.5 ng/μDNA, 레인 3은 0.05 ng/μDNA, 레인 4는 0.005 ng/μDNA, M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 종특이적 프라이머 세트를 이용하여 수집한 시료(칵테일 새우) 속에 포함된 새우의 종을 판별한 사진이다(a,b 및 c는 각각 칵테일 새우 샘플 1, 2 및 3번 샘플의 결과를 나타낸 것이다).
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에서, 프라이머는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만, 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명자들은 가공식품에서는 열처리로 인한 DNA의 손상도가 분석에 있어 문제가 될 수 있기 때문에 증폭산물의 크기를 되도록 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하여 이를 해결하고자 하였다(Woolfe, M & Primrose, 2004).
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 대하 판별용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 보리새우 판별용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 바나나새우 판별용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 블랙타이거새우 판별용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 도화새우 판별용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 흰다리새우 판별용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 큰징거미새우 판별용일 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해, 171bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해, 181bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해, 300bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해, 172bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해, 112bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해, 169bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해, 140bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 식품 중 새우 원료의 진위여부를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 식품 중 새우 원료의 진위여부를 판별하는 방법은 (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 추출한 게놈 DNA를 중합효소연쇄반응 시켜 증폭하는 단계 및 (c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 식품 중 새우 품종의 진위여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직 혹은 다양한 가공물 등으로부터 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 종을 판별하기 위한 것이므로, 상기 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지, 어떤 방법으로 추출하는지는 특별히 제한되지 않는다.
상기 추출한 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘리기 위한 것이므로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 증폭방법 또한 본 발명의 범주에 속함은 명백하다.
본 발명자들은 새우의 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자(대하, 보리새우, 바나나새우, 블랙타이거새우, 도화새우, 큰징거미새우)와 Cytochrome B(흰다리새우) 유전자를 선택하였고, 종 특이 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 새우에서 종에 따라 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서, 종 판별을 간단하고 용이하게 하고자 하였다.
특히 본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에, 식품 원료로 많이 사용되는 새우 7종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 또는 Cytochrome B 유전자에서 서열번호 1 내지 서열번호 14에 해당하는 DNA서열이 각 생물종을 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 이를 사용하면 종래의 다른 어떤 방법보다 종 특이적이고 민감도가 현저하게 우수하게 각 해당 생물종을 판별할 수 있음을 알 수 있었다.
도1 내지 도7은 각각 주요 식품 원료인 대하(GenBank Accession No. NC_009679), 보리새우(GenBank Accession No. KC789233), 바나나새우(GenBank Accession No. HQ148669), 블랙타이거새우(GenBank Accession No. KM528138), 도화새우(GenBank Accession No. AB211295), 큰징거미새우(GenBank Accession No. NC_006880)의 미토콘드리아 Cytochrome oxidase subunit I 유전자, 흰다리새우(GenBank Accession No. DQ534543)의 미토콘드리아 cytochrome B 유전자 부위의 염기서열과 그 위치를 연속적으로 나타내고 있는 것이다. 이를 바탕으로 본 발명자들은 새우 7종간에 서로 구별이 가능한 임의의 DNA 서열을 도출하였고(하기 표 1의 서열번호 1 내지 서열번호 14), 이러한 임의의 DNA 서열은 각각 다양한 종의 새우를 검출하기 위한 마커(marker)로 사용될 수 있다.
상기 마커는 새우의 종 판별을 위한 정방향 프라이머(forward primer) 또는 역방향 프라이머(reverse primer)로 이용될 수 있고, 도 1 내지 7에는 이러한 마커가 결합될 수 있는 유전자 상의 위치를 표시하였다.
본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에 새우 DNA의 COI 유전자 또는 Cytochrome B 유전자 중에서 종간에 서로 구분되는 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 새우의 종을 구별하기에 가장 적합한 임의의 DNA 서열을 만들어 내었으며, 이러한 DNA 서열을 포함하는 프로브를 이용하여 새우의 종을 구별할 수 있다는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명은 후술하는 서열번호 1 내지 서열번호 14 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인 염기서열을 프로브로 이용한 것이다.
이러한 프로브는 새우가 속하는 종에 따라 다른 DNA 서열을 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 새우에 속하는 PCR 증폭 산물과는 결합하지만 이외에 다른 종에 속하는 새우의 그것과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 14의 DNA 서열은 하기의 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1
본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 14 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인 염기서열을 각각 포함하도록 다수의 프로브를 제작할 수 있고, 이러한 프로브 중 적어도 하나 이상을 상기에서 얻은 PCR 산물과 결합시킴으로서, 그 결합 여부에 따라 새우의 종을 판별할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 프로브는 새우의 미토콘드리아 DNA 중 COI 또는 Cytochrome B 유전자 부위에 존재하는 서열번호 1 내지 14의 각 DNA 서열과 결합하고, 상기 결합은 상기 새우의 종에 따라 다르게 이루어지는 것이 바람직하다.
상기한 바와 같이 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 14 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 이용하는 것이 특징이고, 이에 따라 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 프로브를 포함하는 DNA 칩 및 키트일 수 있다. 상기 칩 및 키트에는 프로브와의 결합 및 검출의 정확성을 높이기 위하여 특정한 염기서열로 표시되는 별도의 위치마커가 추가되는 것도 가능하다.
본 발명의 상기 식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 키트는 중합효소연쇄반응에 통상적으로 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
이러한 본 발명은 DNA 마이크로어레이 기술에 따라 하나의 슬라이드 위에서 다수 새우의 종을 동시에 판별할 수도 있고, 각 튜브에 각각의 프라이머를 독립적으로 사용하여 식품 내 새우 원료의 진위여부를 판별할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 새우 시료의 수집
종 특이 PCR 조건을 최적화하기 위해 사용된 DNA를 추출하기 위해, 대하, 바나나새우, 블랙타이거새우, 흰다리새우는 현지 시장에서 구매했으며, 큰징거미새우는 충남내수면연구소에서, 보리새우와 도화새우는 국립생물자원관에서 시료를 분양받아 이용하였다.
실시예 2: 새우 시료로부터 DNA 추출
모든 새우 시료의 유전자 추출은 DNA Blood and Tissue Kit (Qiagen, Germany)를 이용하였으며, 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 아래와 같이 수행하였다.
약 30 mg의 시료에 ATL 버퍼 180 L 및 Proteinase K 20 μL를 넣어 혼합한 후 56℃에서 시료가 버퍼에 의해 모두 용해될 때까지 충분히 반응시켰다. 이후 반응액에 AL 버퍼 200 μL를 넣고 혼합한 뒤, 에탄올(96-100%) 200 μL를 넣고 혼합하였다. 섞인 혼합물은 DNeasy Mini spin 컬럼에 넣고 6,000 x g로 1분간 원심분리하였다. 원심분리 후 하층액을 제거한 뒤, AW1 버퍼 500 μL를 컬럼에 넣고, 6,000 x g에서 1분간 원심분리하여 DNeasy Mini spin 컬럼을 세척하였다. 하층액을 제거한 뒤, AW2 버퍼 500 μL를 컬럼에 넣고 20,000 x g으로 3분간 원심분리하여 DNeasy Mini spin 컬럼을 다시 한 번 세척하였다. AE 버퍼 100 μL를 컬럼에 넣고 5분간 방치한 후, 6,000 x g로 1분간 원심 분리하여 용출하였다. 추출한 DNA의 농도 및 순도는 NANODROP 2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 확인했으며, 종 특이 프라이머를 이용한 마커 유전자 증폭에 주형 DNA로 사용하였다.
실시예 3. 목적 유전자의 선택과 프라이머 설계
종 특이적으로 특정 종의 DNA를 증폭하기 위해서는 유전자의 복제수(copy number), 증폭할 부위의 크기나 특이성 등을 고려하여야 하며, 미토콘드리아는 세포질에 존재하는 소기관으로, 핵 DNA에 비해 세포당 복제수가 높고, 염기서열 변이성이 높아 근연관계가 밀접한 종 간 감별에 효율적으로 이용할 수 있는 유용한 분자지표라 할 수 있다 (Ballin, Vogensen& Karlsson, 2009).
본 연구에서는 프라이머 설계를 위하여, 미국 국립생물정보센터의 유전자은행에 등록되어 있는 새우 7종 (대하(GenBank Accession No. NC_009679), 보리새우(GenBank Accession No. KC789233), 바나나새우(GenBank Accession No. HQ148669), 블랙타이거새우(GenBank Accession No. KM528138), 도화새우(GenBank Accession No. AB211295), 큰징거미새우(GenBank Accession No. NC_006880)의 미토콘드리아 Cytochrome oxidase subunit I 유전자, 흰다리새우(GenBank Accession No. DQ534543)의 미토콘드리아 cytochrome B 유전자)에 대한 엽록체의 유전정보를 확인하였고, 염기서열 정보가 없는 경우에는 일반 프라이머(universial primer)를 이용하여 유전자를 증폭하여 염기서열을 확보한 후, 프라이머를 설계하였다. 프라이머 설계는 아래와 같은 조건이 충족되도록 설계하였으며 염기서열과 프라이머의 위치는 도 1에, 프라이머 정보는 표 1에 각각 나타내었다.
프라이머를 설계할 때는 길이는 20~30 bp가 되고, G+C %가 45~60 %로 구성 되도록, 한 쌍의 프라이머가 부분적으로 서로 상보적이지 않도록 위치를 선정하고, 프라이머의 3' 말단에 G+C가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 하여, hair pin loop 형성을 피하였다. 또한 두 프라이머의 melting temperature (Tm) 값이 동일하도록 했다. 다른 종과의 특이성이 높아야 하므로 종 특이적이면서 위의 조건을 최대한 충족하도록 했고, 증폭산물의 크기는 되도록 200 bp 내외가 되도록 하였으며, NCBI Primer-BLAST 검색 기능을 이용하여 비교종과의 교차여부를 확인하였다.
실시예 4: 유전자 증폭 및 염기서열 분석
PCR 반응은 10 ng의 주형 DNA와 각각 1 μM의 프라이머, 1x PCR 버퍼, 0.2 mM dNTPs, 2.0 mM MgCl2, 1 U rTaq polymerase와 멸균증류수를 포함하여 총 20.0 μL 로 수행되었다. 또한, 결합 최적 온도(annealing temperature)를 찾기 위한 온도별 실험, 최적 PCR cycle을 결정하기 위한 cycle 실험, 최소검출한계를 확인하기 위한 검출한계 실험을 진행하여 종 특이 프라이머의 PCR 최적조건을 표 2와 같이 확립하였다.
표 2
새우 표준시료 7종으로부터 추출한 DNA를 이용해 표 2의 최적화된 조건으로 PCR을 수행한 결과, 교차반응에 의한 비특이적 밴드는 생성하지 않았으며 특이적으로 해당 종에 대해서만 증폭됨을 확인할 수 있었다.
개발된 종 특이 프라이머를 이용해 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 확인하기 위해, 증폭산물을 아가로오스 젤에서 순수하게 분리하여 pGEM-T easy 벡터에 클로닝했다. 플라스미드 DNA는 정제한 뒤, Bioneer Corp (Seoul, South Korea)로 보내 염기서열을 분석했으며 그 분석 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3
새우 표준시료 7종으로부터 추출한 DNA를 이용해 표 2의 최적화된 조건으로 PCR을 수행한 결과, 교차반응에 의한 비특이적 밴드는 생성하지 않았으며 특이적으로 해당 종에 대해서만 증폭됨을 확인할 수 있었다. 도 8 에서와 같이, 각 프라이머는 해당 DNA를 대상으로 예상한 크기의 PCR 산물을 생성했고, 그 크기는 각각 다음과 같았다 (대하 특이 프라이머: 176 bp, 보리새우 특이 프라이머: 172 bp, 바나나새우 특이 프라이머: 300 bp, 블랙타이거새우 특이 프라이머: 172 bp, 도화새우 특이 프라이머: 112 bp, 흰다리새우 특이 프라이머: 169 bp, 큰징거미새우 특이 프라이머: 140 bp).
실시예 5: 각 종 특이 프라이머의 검출한계 실험
개발된 프라이머의 민감도 실험은 표준시료(대하, 흰다리새우, 보리새우, 바나나새우, 도화새우, 블랙타이거새우 및 큰징거미새우)로부터 추출한 DNA 5 ng/μ 를 사용하여 측정하였다. 각 종(種)의 검출한계는 표준시료에서 추출한 DNA의 농도를 감소시켜가며 5~0.00005 ng/μL 범위에서 수행했다. 각 특이 프라이머의 검출한계는 표 4와 같았고, 새우 종에 따라 다소 차이가 있었으나 0.05~0.0005 ng/μL로 확인되었다. 대하, 도화새우, 흰다리새우 종특이 프라이머의 검출한계는 0.0005 ng/μ였으며, 보리새우 및 흰다리새우 종특이 프라이머는 검출한계가 이보다 높은 0.005 ng/μ를 나타냈다. 바나나새우 및 블랙타이거 새우의 종특이 프라이머의 경우,0.05 ng/μ였다 (도 9a 내지 도 9g). 기존 새우의 종을 판별하기 위한 IEF, ELISA 및 MALDI-TOF 방법에 의한 경우와 비교할 때, 소량의 샘플에서도 새우의 종을 판별할 수 있을 뿐만 아니라, PCR 분석법에 사용되는 기존의 프라이머와 비교할 때도 더 높은 검출한계로 새우의 종을 판별할 수 있다.
표 4
실시예 6: 종특이적 프라이머를 사용한 현장시료 종 판별
국내 대형 마트에서 유통 중인 칵테일 새우의 종 판별을 실시예 2 및 실시예 4의 방법에 의해 수행하였다. 도 10 에서와 같이, 흰다리새우 특이 밴드만을 형성하여 칵테일 새우는 흰다리새우로 판명되었다.
본 발명에 의하면, 종 특이 프라이머를 이용하여 시료 원물 뿐 만 아니라, 육안 확인이 어려운 가공식품 등을 대상으로 간단하고 정확하게 사용 원료의 진위 여부를 확인할 수 있으며, 종래 프라이머가 가지고 있는 식품 적용 한계를 극복할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.
<110> Ministry of Food and Drug Safety
<120> Primer set for determining identity of shrimp material in food,
method of determining identity of shrimp material in food using
the same and kit comprising the same
<130> 16-10472
<160> 21
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for detecting Fenner openaeus chinensis
<400> 1
gacttattat ccgtgcagaa ctag 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for detecting Fenner openaeus chinensis
<400> 2
caggagcacc taatatcaga ggg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for detecting Marsupenaeus japonicus
<400> 3
ttcgtgctga gttaggtcaa c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for detecting Marsupenaeus japonicus
<400> 4
aatgccatat caggtgctcc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for detecting Fenner openaeus merguiensis
<400> 5
tccctcgcta actctacttc t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for detecting Fenner openaeus merguiensis
<400> 6
atagctcctg ctaaaaccgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for detecting Penaeus monodon
<400> 7
gctcatgcag gtgcttcagt 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for detecting Penaeus monodon
<400> 8
gtagggctgt aataaacact gct 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for detecting Pandalus hypsinotus
<400> 9
ccctttatca gcagggatcg c 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for detecting Pandalus hypsinotus
<400> 10
agtggttatg aaattaacag cacc 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for detecting Litopenaues vannamei
<400> 11
gacctagttc aatgaatttg agga 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for detecting Litopenaues vannamei
<400> 12
catttcttac aatcccaaga gga 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for detecting Macrobrachium rosenbergii
<400> 13
gtttatccac cactagcggc 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for detecting Macrobrachium rosenbergii
<400> 14
ggggctcgta tgttaatcac t 21
<210> 15
<211> 171
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 15
gacttattat ccgtgcagaa ctaggtcaac caggaagtct tattggagac gaccaaattt 60
acaatgttgt agttacagcc cacgcttttg ttataatttt ctttatagtt atgcctatca 120
taattggagg atttggaaat tgattagtcc ctctgatatt aggtgctcct g 171
<210> 16
<211> 181
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 16
taataaagac tgctcagacg aataacggta ttcggtctat agtcatacct gtagatcgta 60
tattaattac agttgttata aaatttacgg cccctaaaat tgatgaaacc cctgctaaat 120
gtaatgaaaa aattcctaaa tctacagagg cccctgcatg tgcgattcca gctgataaag 180
g 181
<210> 17
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 17
tccctcgcta actctacttc tttctagagg tatagtcgaa agaggagtag gaacaggatg 60
aactgtttac cctcctctat ctgccagcat tgcccatgca ggagcatctg tagatctagg 120
aatcttctca ttacatttag caggggtttc ttcaattcta ggggctgtaa attttataac 180
taccgttatc aatatacgat caacagggat aactatagac cgaatacctc ttttcgtctg 240
agcggtattt attacagcct tactactttt actatcatta ccggttttag caggagctat 300
300
<210> 18
<211> 172
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 18
gctcatgcag gtgcttcagt tgatctaggt attttttcat tacatttagc aggggtctca 60
tcaatcttag gagctgtaaa ctttataacg accgttatca atatacgatc tacagggata 120
actatagacc gaataccact ttttgtttga gcagtgttta ttacagccct ac 172
<210> 19
<211> 112
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 19
ccctttatca gcagggatcg ctcatgccgg ggcttcagtc gaccttggaa tcttttcact 60
tcacctagca ggagtttctt ctattttagg tgctgttaat ttcataacca ct 112
<210> 20
<211> 169
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 20
gacctagttc aatgaatttg aggagggttc gccgtagaca acgctaccct aacccgcttc 60
ttcacttttc atttcctatt cccatttatt gtagctgccg ctactatcat tcatattctt 120
tttattcacc aaacaggttc taataatcct cttgggattg taagaaatg 169
<210> 21
<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 21
gtttatccac cactagcggc cggtaccgcc cacgccgggg catcggtaga tctaggtatt 60
ttttccctcc acctagcagg agtttcttca atcttagggg ctgtcaactt tattaccaca 120
gtgattaaca tacgagcccc 140
Claims (11)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 대하 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 보리새우 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 바나나새우 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 블랙타이거새우 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 도화새우 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 흰다리새우 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 큰징거미새우 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
- (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 제1항, 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 중합효소연쇄반응 시켜 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 식품 중 새우 품종의 진위여부를 확인하는 단계를 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별방법. - 제1항, 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 식품 중 새우 원료의 진위여부 판별용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160079150A KR101764128B1 (ko) | 2016-06-24 | 2016-06-24 | 식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 새우 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160079150A KR101764128B1 (ko) | 2016-06-24 | 2016-06-24 | 식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 새우 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101764128B1 true KR101764128B1 (ko) | 2017-08-04 |
Family
ID=59654312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160079150A KR101764128B1 (ko) | 2016-06-24 | 2016-06-24 | 식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 새우 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101764128B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102155967B1 (ko) * | 2019-09-24 | 2020-09-15 | 재단법인 게놈연구재단 | 미토콘드리아 삽입 마커에서 유래한 가시배새우 종 판별용 유전자 마커 조성물 및 이를 이용한 가시배새우 판별방법 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4439426B2 (ja) | 2005-03-31 | 2010-03-24 | 日清食品ホールディングス株式会社 | プライマー及び特定動物の検出方法 |
| JP4436438B2 (ja) | 2009-08-24 | 2010-03-24 | 日清食品ホールディングス株式会社 | プライマー及び特定動物の検出方法 |
| JP2011092141A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Tokyo Univ Of Marine Science & Technology | エビ類検出用プライマーセット |
| JP5065689B2 (ja) | 2006-01-12 | 2012-11-07 | ハウス食品株式会社 | エビ検出用プライマーセット |
-
2016
- 2016-06-24 KR KR1020160079150A patent/KR101764128B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4439426B2 (ja) | 2005-03-31 | 2010-03-24 | 日清食品ホールディングス株式会社 | プライマー及び特定動物の検出方法 |
| JP5065689B2 (ja) | 2006-01-12 | 2012-11-07 | ハウス食品株式会社 | エビ検出用プライマーセット |
| JP4436438B2 (ja) | 2009-08-24 | 2010-03-24 | 日清食品ホールディングス株式会社 | プライマー及び特定動物の検出方法 |
| JP2011092141A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Tokyo Univ Of Marine Science & Technology | エビ類検出用プライマーセット |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Biochemical Genetics. 2004, 42, 9/10, 331-345 |
| Food Technology and Biotechnology. 2012, 50(4), 387 |
| Marine Biology. 2000, 137, 435-446 |
| MEDITERRANEAN MARINE SCIENCE., Vol.16, No.1, pp.36~45 (2014.10.30.). |
| Mol Biol Rep 2009, 36, 1733-1740 |
| Molecular Pylogenetics and Evolution. 2004, 31, 39-49 |
| Russian Journal of Genetics. 2012, 48, 2, 208-223 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102155967B1 (ko) * | 2019-09-24 | 2020-09-15 | 재단법인 게놈연구재단 | 미토콘드리아 삽입 마커에서 유래한 가시배새우 종 판별용 유전자 마커 조성물 및 이를 이용한 가시배새우 판별방법 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shabani et al. | Halal authenticity of gelatin using species-specific PCR | |
| Ballin et al. | Species determination–Can we detect and quantify meat adulteration? | |
| EP3356976A1 (en) | Immunorepertoire normality assessment method and its use | |
| JP5279049B2 (ja) | 特異的遺伝子の多重検出によるＳａｌｍｏｎｅｌｌａＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの迅速同定法 | |
| Liu et al. | A multiplex PCR assay mediated by universal primers for the detection of adulterated meat in mutton | |
| Lin et al. | A multiplex PCR assay for species identification of raw and cooked bonito | |
| CN110373473B (zh) | 一种鉴定猪肉成分的分子标记及其应用 | |
| CN103290103A (zh) | 一种地沟油鉴定方法及其应用 | |
| KR101764128B1 (ko) | 식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 새우 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 | |
| KR101843430B1 (ko) | Dna 복제수 변이를 이용한 한우와 중국 연변우 품종 식별 마커 및 이의 식별방법 | |
| Xie et al. | Rapid identification of escolar (Lepidocybium flavobrunneum) and oilfish (Ruvettus pretiosus) species based on recombinase polymerase amplification | |
| JP5566018B2 (ja) | カニ検出用プライマーセット | |
| JP2007174973A (ja) | Ｓｓｒプライマーを用いるマルチプレックスｐｃｒによる品種識別法。 | |
| CN107299145B (zh) | 用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒 | |
| Chen et al. | A novel multiplex xMAP assay for generic detection of avian, fish, and ruminant DNA in feed and feedstuffs | |
| KR101817107B1 (ko) | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 참홍어의 동정 방법 | |
| CN112501320B (zh) | 一种蛇源成分快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN105543350B (zh) | 一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法 | |
| KR101918124B1 (ko) | 식품 중 게 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 게 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 | |
| Članjak–Kudra et al. | An overview of most commonly used methods for detection of fish mislabeling | |
| KR101906217B1 (ko) | 돼지 젤라틴 검출 키트 및 이를 이용한 돼지 젤라틴 검출 방법 | |
| KR101749545B1 (ko) | 참서대과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법 | |
| Laknerová et al. | Interlaboratory Identification of Black Seabream (S pondyliosoma cantharus) as a Model Species on Basis of Polymerase Chain Reaction Targeting the Second Intron of the Parvalbumin Gene | |
| Cho et al. | Development of molecular detection kit for Larimichthys crocea and Larimichthys polyactis | |
| CN110894544A (zh) | 鲑鱼甲病毒（sav）的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |