CN112501320B - 一种蛇源成分快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蛇源成分快速检测试剂盒及其应用，涉及生物物种鉴定技术领域。本发明首先筛选出一个蛇源通用内标准基因JUN(Gen bank No.EF144048.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其位于染色体上，在蛇物种中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，可作为鉴定蛇源的靶基因。以该基因为靶序列设计了恒温扩增引物，恒温扩增反应产物用于胶体金核酸试纸条检测。恒温扩增反应结合胶体金核酸试纸条检测构成快速检测试剂盒，可快速、灵敏地检测蛇源成分，检测灵敏度可达0.8%（w/w）。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于现场实时检测。

Description

一种蛇源成分快速检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物物种鉴定技术领域，具体的说涉及一种检测蛇源成分的环介导等温扩增技术（LAMP）结合胶体金核酸试纸条检测试剂盒。
背景技术
我国以蛇做药有着悠久的历史，早在明朝医药学家李时珍所著的《本草纲目》就记述了关于蛇类的药用知识，到目前为止，可供药用的蛇类品种多达70余种。随着经济社会的发展，其药用和商用价值日益突出，蛇类资源的社会需求和应用逐年递增。一些不法商贩为了获取暴利，将伪品及混淆品掺杂在蛇类药材、制剂、皮革等制品之中，仅依据蛇类的外部形状很难进行正确判断。因此，为保证蛇类资源的安全使用，严厉打击蛇类药品掺假行为，加强蛇类物种的保护和管理，亟需开发快速、准确、低成本的蛇源成分快速检测方法。
近年来，蛇源鉴别的方法不断发展，除了传统的性状、显微、理化鉴定方法，许多新的鉴定技术和仪器设备被引入，如色谱鉴定、高光谱鉴定等，随着分子生物学的迅猛发展，涌现了一批分子鉴定技术，如各种分子遗传标记技术、测序技术等。
在脂肪酸、蛋白质检测鉴定领域，许靖等采用毛细管电泳指纹图谱技术，对蛇类药材进行指纹图谱研究，结果发现建立的指纹图谱有9个共有峰，并将其作为鉴别的特征性指纹峰。熊学敏等采用薄层色谱法对蛇粉胶囊中的乌梢蛇成分进行筛查，为定性鉴别提供依据，但该方法的局限性在于需要同对照样品反复比较，当无对照品时，难以鉴别。在核酸检测领域，王义权等根据线粒体基因Cytb基因的序列发现，该基因片段能区分鉴定金钱白花蛇与其他蛇种，结果表明，在对金钱白花蛇的PCR鉴别中，该引物的检出率为100%。Dubey等利用DNA mini-barcoding 技术对印度濒危蛇类物种进行分类研究和鉴定，在所研究的11种蛇类中都扩增出175 bp，在10种物种中扩增出245 bp，结果证实该技术的有效性。赵雪静等通过对金钱白花蛇及其他蛇类的Cytb基因序列进行比对分析，设计了一对能准确鉴别金钱白花蛇及其他伪品的引物，采用两步法PCR进行鉴别。陈康等通过对PCR反应退火温度与时间、变性温度与时间、循环数等因素的优化，并在产物中加入SYBR Green I染料，进行可视化检测，该检测方法可在30—40 min内完成。孙清萍等基于环介导等温扩增方法，以乌梢蛇12SrRNA基因序列为基础设计了一套LAMP 引物，实验结果表明，该方法在62 ℃孵育45min，即可完成扩增，实现了乌梢蛇的快速检测。
本申请以核酸为对象对蛇源内标准基因进行分子检测关键技术的研究，首先筛选蛇类物种染色体上低拷贝数基因作为内标准基因序列，然后将筛选出的特异序列通过环介导等温扩增—胶体金核酸试纸条联用，实现蛇源成分快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测蛇源成分的蛇源通用内标准基因。
本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测蛇源成分的LAMP结合胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒。
一种用于检测蛇源成分的基因，其为内标准基因JUN(Gen bank No. EF144048.1)，具有SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明提供了上述内标准基因JUN在检测蛇源成分中的应用。
本发明提供了一种用于检测上述内标准基因JUN的特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物：
<i>JUN</i>-1-F3 5’-TGCTCCGCCTACGAACTC-3’
<i>JUN</i>-1-B3 5’- ATGCTGCACTGGCATCTG -3’；
<i>JUN</i>-1-FIP 5’-TAGACGGGCGGCTCACTGTGTCTCTTCCATGGCTGGAAAC -3’；
<i>JUN</i>-1-FIP 5’-AGCGCACTCAATACAGTGCCTTGATGCTGTGGAGGAAAGC -3’；
其中内引物FIP的5’端标记生物素（Biotin），BIP的5’端标记荧光素（FITC）。
本发明提供了上述特异性LAMP引物组合在蛇源成分鉴定中的应用。
本发明提供了上述特异性LAMP引物组合在制备蛇源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。
进一步地，本发明提供一种含有上述特异性LAMP引物组合的检测蛇源成分的快速检测试剂盒。
本发明提供一种检测食品中蛇源成分的方法，包括以下步骤：
（1）蛇源内标准基因的确定；
（2）提取基因组作为模板，采用针对内标准基因设计的特异性LAMP引物组合进行LAMP检测；
（3）结果判断：采用胶体金核酸试纸条进行结果判断，检测T线和质控C线均有红色条带，含有目的基因；质控C线有红色条带，而检测T线无条带，不含有目的基因；
所述内标准基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物：
<i>JUN</i>-1-F3 5’-TGCTCCGCCTACGAACTC-3’
<i>JUN</i>-1-B3 5’- ATGCTGCACTGGCATCTG -3’；
<i>JUN</i>-1-FIP 5’-Biotin-TAGACGGGCGGCTCACTGTGTCTCTTCCATGGCTGGAAAC -3’；
<i>JUN</i>-1-FIP 5’-FITC-AGCGCACTCAATACAGTGCCTTGATGCTGTGGAGGAAAGC -3’；
所述胶体金核酸试纸条包含胶体金核酸试纸条测试T线与质控C线，测试线标记有Digoxin抗体，质控线标记有生物素二抗，结合垫有胶体金-生物素抗体标记物。
上述方法中，步骤（2）所述LAMP检测，其25 μL LAMP检测体系的具体配置为：1×Bst Thermal buffer，0.6 mM dNTP，3.6 mM MgSO4，0.6 M 甜菜碱，1.6μM 引物JUN-1-FIP，1.6 μM引物JUN-1-BIP，0.2 μM引物JUN-1-F3，0.2 μM引物JUN-1-B3，8 U Bst DNA聚合酶大片段。
上述方法中，LAMP检测反应条件为：在65 ℃反应1 h，在85 ℃反应 5 min使酶灭活。
本发明首次在染色体上筛选出蛇源内标准基因。本发明用多个品种蛇验证内标准基因，证明该内标准基因稳定，不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本发明选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数低，易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。
胶体金核酸试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。本发明通过将蛇肉与非蛇肉（猪肉）进行5倍梯度等质量的混合，然后按照基因组提取方法进行基因组的提取，接着按照优化后的LAMP反应体系进行扩增，再与胶体金核酸试纸条相结合以探究胶体金核酸试纸条检测方法的灵敏性。结果显示，当混合梯度为125倍即为初始质量的0.8%时，检测T线特别浅，几乎与阴性对照相似。结果显示，本发明检测试剂盒的检测极限为0.8%（w/w）。
基于本发明确定的用于检测食品中蛇源成分的内标准基因JUN基因，本发明设计了用于检测该基因的LAMP引物组合，应用LAMP反应结合胶体金核酸试纸条可检测待测样品中是否有蛇源成分，此反应快速，费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层监督检验使用。
本发明具有的技术效果为：
（1）筛选出蛇源通用内标准基因JUN基因。
（2）针对蛇JUN基因序列设计了LAMP反应引物并优化了反应体系，确定了优化的LAMP体系：甜菜碱浓度为1 M，dNTP浓度为0.4 mM，Mg2+浓度为3 mM，时间为30 min，温度为60℃。
（3）成功将蛇源LAMP反应与胶体金核酸试纸条联用，该方法在30 min内能特异性的鉴别蛇肉，灵敏度为0.8%（w/w）。
（4）该方法反应快速，费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层监督检验使用。
附图说明
图1 JUN基因同源性分析和BLAST结果信息
图2 LAMP引物筛选实验电泳结果。泳道1-8：1-2，JUN-1；3-4，JUN-2；5-6， JUN-3；7-8，JUN-4。
图3 蛇特异性基因序列LAMP实验验证结果。泳道1-20：1-2,蛇；3-4,猪；5-6,牛；7-8,羊；9-10,鸡；11-12,马；13-14,驴；15-16,骆驼；17-18,鱼；19-20,蜥蜴；M：Maker DL2000。
图4 3种蛇肉LAMP电泳结果。泳道1-6:1-2,游蛇;3-4,赤链蛇;5-6,水蛇。
图5 LAMP反应的灵敏性探究。泳道1-12：1-2, 100 ng/μL；3-4, 10 ng/μL；5-6, 1ng/μL；7-8, 0.1 ng/μL；9-10, 10 pg/μL；11-12, 1 pg/μL；13-14, 0.1 pg/μL。
图6 Mg2+浓度的优化。泳道1-10:1-2, 1.0 mmol/L ;3-4, 2.0 mmol/L;5-6, 3.0mmol/L;7-8, 4.0 mmol/L;9-10, 5.0 mmol/L。
图7 反应温度的优化。泳道1-12:1-2, 60℃;3-4, 61℃;5-6, 62℃;7-8, 63℃;9-10,64℃;11-12,65℃。
图8 dNTP浓度的优化。泳道1-10:1-2, 0.2 mmol/L ;3-4, 0.4 mmol/L;5-6,0.6mmol/L;7-8, 0.8mmol/L;9-10, 1.0 mmol/L。
图9 Betaine浓度的优化。泳道1-8:1-2, 0.5 mol/L ;3-4, 1 mol/L;5-6, 1.5mol/L;7-8, 2 mol/L。
图10 反应时间的优化。泳道1-8:1-2, 30 min ;3-4, 40 min;5-6, 50 min;7-8,60 min。
图11 LAMP-胶体金核酸试纸条的特异性探究。试纸条1-10:1,蛇;2,猪;3,牛;4,羊;5,鸡;6,马;7,驴;8,骆驼;9,鱼;10,蜥蜴。
图12 LAMP-胶体金核酸试纸条的灵敏性探究。试纸条1-6： 1：混合梯度0倍，即为原始质量的100%；2：混合梯度5倍，即为原始质量的20%；3：混合梯度25倍，即为原始质量4%；4：混合梯度125倍，即为原始质量0.8%；5：混合梯度625倍，即为原始质量0.16%；6：阴性。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
dNTPs（含dATP、dGTP、dCTP和dTTP）、DNA Marker DL2000、Bst DNA polymeraselarge fragment购自New England Bio labs（NEB）公司，MgSO4、甜菜碱（Betaine）购自Sigma公司；所用的引物由北京睿博兴科生物有限公司合成，PAGE级纯化。选取猪、牛、羊、鸡、马、驴、骆驼、鱼、蜥蜴、蛇共10种动物肉样进行特异性检测。
实施例1 蛇源通用内标准基因JUN的筛选
通过搜索Gen Bank中关于蛇的基因信息，并用BLAST软件进行同源性、特异性分析，筛选出JUN (Gen bank No. EF144048.1 )基因。
内标准基因筛选流程如下：
Step 1.在NCBI数据库中查询目标物种的基因组信息，并对其完整性进行分析，选择并下载测序信息完整的物种基因组，并存储为“.FASTA”格式。限定需要与目标物种进行筛选区分的物种种类，即为“比对物种”，一般为与目标物种近缘的常见物种。比对物种的选取会直接影响筛选比对的速率与准确率，即比对物种数类多，比对速率慢，因此需要结合研究目的灵活的选择。同样在NCBI数据库中查询比对物种的基因组信息，选择并下载测序信息完整的比对物种基因组，并存储为“.FASTA”格式。
Step 2.在目标物种与比对物种中每种物种均选择一个代表性物种，代表性物种的选取一般参考NCBI默认设定。对选取的代表性物种的基因组序列数量进行分析并统计每个代表性物种基因组的序列总量。自编写程序“get_artificial_reads_for_whole_genome.pl”基于每个物种的代表性基因组序列抓取人工 reads，人工reads片段长度为100bp且在染色体上连续选取，当100 bp 人工reads中存在重复序列或“N”时，剔除不要，分别保存统计的结果。
Step 3.每个代表性基因组获得的人工reads全部用来与目标物种和比对物种基因组进行比对，设置BLASTN参数为0.00001。将比对的结果文件进行保存。当人工reads与自身基因组比对时，只提取hit ≤3的低拷贝情况，以此输出≤3低拷贝内标准基因。
Step 4.提取物种种内共有序列。在目标物种基因组的比对文件中，提取比对序列，合并比对文件，并抽取重复出现的比对序列，进行统计汇总保存。
Step 5.提取物种种间共有序列。将目标物种的代表性基因组序列人工reads分别与比对物种基因组序列进行比对，提取共有的序列，并汇总整理后保存。
Step 6.种内共有、种间特异序列的获得。将step 4获得序列减去step 5获得序列，即得目标物种种内共有、种间特异序列。如某序列只存在于step 5而不存在于step 4序列，则舍去该序列，以避免假阳性结果的出现。
Step 7.种内共有、种间特异序列的验证。将step 6获得的种内共有、种间特异序列再逆向比对到目标物种的代表性基因组序列。抽取step 6结果中与目标物种代表性基因组中的共有序列，汇总后并保存。
Step 8.筛选比对结果全基因组注释。由于先使用的GenBank assemblyaccession（GCA）下载的基因组，后续又需要RefSeq assembly accession（GCF）版本内的gff3注释信息，所以需要关联两套数据库中的gene ID，使用*_assembly_report.txt文件。genome.fa与GFF3文件均使用RefSeq assembly accession（GCF）版本，产出结果是基于RefSeq assembly accession（GCF）版本。自编写程序“annotate_species_specific_reads.pl”，基于基因组注释信息，获取每一个step 7结果中的人工reads的位置，统计每一个基因的覆盖情况并统计汇总。
Step 9.结果输出。目标物种的筛选模型结果输出为3个注释文件，分别为对每一个基因特异序列（人工reads）覆盖情况统计文件；基于注释文件，对全部人工reads的基因组座位进行统计（仅统计基因）文件；基因中存在特异序列覆盖（> 1 人工 reads）的方向特异性序列文件。
Step 10.NCBI数据库在线BLASTN。利用NCBI数据库在线BLASTN功能对step 9获得比对结果进行在线比对，筛选并抽取特异性的序列，汇总后保存。对汇总的数据进行分类，并按匹配度对数据进行降序排列。选取匹配度高的序列进行实际验证。
Step 11.实验验证。对step 10获得的结果进行实验验证，以获得可实际应用的基因序列。
JUN位于染色体上，相比线粒体上的基因，染色体上的基因拷贝数少，不易发生等位基因变异且容易定量。由比对结果图1可知，该基因与猪、牛、羊、鸡、马、驴、骆驼、鱼、蜥蜴具有较低的同源性。最后通过对序列进行整合，确定最终的特异性目标基因JUN基因可以作为内标准基因。该JUN片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2 蛇源成分LAMP检测方法的建立
针对JUN基因（Genbank No. EF144048.1）,采用日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件，共设计4对引物，分别命名为JUN-1、JUN-2、JUN-3、JUN-4（表1）。利用这4对引物对蛇源基因组DNA进行LAMP扩增，并用2%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析（图2），结果表明：引物JUN-1的条带最清晰明亮，选择JUN-1进行后续实验。
表1 LAMP引物序列
Figure 79551DEST_PATH_IMAGE001
利用LAMP快速检测蛇样品，反应体系25 μL ，包括1×Bst Thermal buffer，0.6mM dNTP，3.6 mM MgSO4，0.6 M 甜菜碱，1.6μM 引物JUN-1-FIP，1.6 μM引物JUN-1-BIP，0.2μM引物JUN-1-F3，0.2 μM引物JUN-1-B3，8 U Bst DNA聚合酶大片段。反应程序为65 ℃恒温1 h，85 ℃ 5min。扩增结束后，利用2%琼脂糖凝胶电泳进行产物判定，出现阶梯状条带证明扩增成功，含有目的基因。
本研究利用设计的引物对JUN-1对蛇、猪、牛、羊、鸡、马、驴、骆驼、鱼、蜥蜴进行LAMP扩增并用2%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析。结果显示，除蛇肉外，其它9种非蛇物种均无特异性扩增条带（图3）。这表明该基因以及对应的引物可以用来特异性地检测蛇源性产品。
实施例3 蛇内标准基因LAMP的通用性鉴定
本申请利用设计的引物JUN-F/R对三种蛇进行LAMP扩增并用2%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析。结果表明，三个物种的蛇肉均有明亮的扩增条带（图4）。这表明该基因以及对应的引物可以用来通用性地检测蛇源性产品。
实施例4 蛇内标准基因LAMP的灵敏度鉴定
为了评定LAMP体系检测蛇源物种的灵敏性，本申请将蛇肉的基因组从100 ng/μL10倍稀释7个浓度梯度，100 ng/μL, 10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 0.1 pg/μL，进行环介导等温扩增，结果如图5所示，当DNA模板浓度最低至0.1 ng时，有明亮的条带扩增出来，当浓度低至10 pg/μL时则没有条带出现，也就是说检测限是0.1 ng/μL DNA,这表明基于JUN基因的环介导等温快速检测体系检测蛇源物种的检测限是0.1 ng/μL DNA。
实施例5 LAMP反应体系优化
对LAMP反应条件进行优化，从而获得最佳反应体系来保证LAMP的高效扩增。本实验选择了反应温度、反应时间、Mg2+浓度、dNTP浓度、Betaine浓度作为主要反应条件进行优化。
（1）最适Mg2+ 浓度的优化
Mg2+是影响LAMP 扩增效率的重要因素，游离的镁离子对 Bst DNA 聚合酶的活性，以及对引物退火都有影响，调整Mg2+的加入量使得反应体系中的Mg2+浓度分别为1.0 mmol/L，2.0 mmol/L，3.0 mmol/L，4.0 mmol/L，5.0 mmol/L，反应体系及其他条件不变，根据扩增产物的电泳结果，找出最佳Mg2+浓度。结果显示当反应体系中Mg2+ 浓度低于3.0 mmol/L时，电泳条带亮度较浅，说明核酸的扩增效率较低，当Mg2+ 浓度为3.0—5.0 mmol/L时，均可以看到明显的梯状条带，说明此浓度范围下Bst DNA 聚合酶的活性好，LAMP扩增效率高。选取3.0 mmol/L为Mg2+ 的最适浓度（图6）。
（2）最适反应温度的优化
在LAMP 扩增反应中，温度对引物和模板之间的结合起决定性的作用。为了获得LAMP扩增效率最适合的反应温度，设计梯度温度依次为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，进行扩增，反应体系及其他条件不变，根据扩增产物的电泳结果，选择扩增效率最适的温度作为本实验的最佳反应。LAMP反应温度优化实验结果如图7所示，60℃—65℃之间产生了明显的条带，说明此温度范围内都能发生高效率的扩增。选取60℃为最低反应温度。
（3）最适dNTP浓度的优化
过低浓度的dNTP无法满足LAMP的高效扩增，产生较少的核酸，dNTP浓度过高则会在一定程度上抑制LAMP反应，调整LAMP体系中dNTP的加入量，使体系中dNTP浓度依次为0.2mmol/L，0.4 mmol/L，0.6 mmol/L，0.8 mmol/L，1.0 mmol/L，反应体系及其他条件不变，根据扩增产物的电泳结果，找出最佳dNTP浓度。结果如图8所示，0.4 mmol/L的dNTP为本实验的最优反应浓度。
（4）最适甜菜碱（Betaine）浓度的优化
调整LAMP体系中甜菜碱（Betaine）的加入量，使体系中甜菜碱（Betaine）浓度依次为0.5 M，1.0 M，1.5 M，2.0 M，反应体系及其他条件不变，根据扩增产物的电泳结果，找出最佳甜菜碱（Betaine）浓度。甜菜碱可以促进DNA模板与核酸的结合，有助于高GC含量的模板进行DNA扩增，电泳结果如图9所示，当体系中甜菜碱浓度为1 M时，梯形条带亮度最高，明亮清晰，因此，最终选择1 M的甜菜碱为本实验的最优反应浓度。
（5）最适反应时间的优化
为了获得LAMP扩增效率最适合的反应时间，设计反应时间依次为30 min、40 min、50 min、60 min，进行扩增，反应体系及其他条件不变，根据扩增产物的电泳结果，选择扩增效率最适的反应时间作为本实验的最佳反应。实验结果如图10所示，反应进行到30 min时，就能观察到明显梯形条带，随着反应时间的增加，当反应进行到50 min时，能够观察到明亮的梯形条带，因此，本实验的最短反应时间为30 min。
实施例6 蛇源成分LAMP产物胶体金核酸试纸条检测方法的建立
将LAMP反应产物与缓冲液充分混合后滴加在胶体金核酸试纸条的样品垫上，此时混合液在毛细管动力下经过结合垫与NC膜，并继续向吸水垫方向移动，3 min后即可观察检测结果。测试T线与质控C线均有红色条带则证明为阳性样品，只有质控C线有红色条带则为阴性样品。
选取蛇、猪、牛、羊、鸡、马、驴、骆驼、鱼、蜥蜴的基因组对LAMP联用胶体金核酸试纸条的特异性进行验证。结果显示只有蛇源阳性样本有明亮的检测T线和质控C线，其余9种样本只有质控C线，说明该胶体金核酸试纸条具有较强的特异性。具体结果见图11。
胶体金核酸试纸条的原理是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。将蛇肉与非蛇肉（猪肉）进行5倍梯度等质量的混合，然后按照基因组提取方法提取基因组，根据优化后的LAMP反应体系进行扩增，最后与胶体金核酸试纸条相结合以探究胶体金核酸试纸条检测方法的灵敏性。结果显示，当混合梯度为125倍即为初始质量的0.8%时，检测T线特别浅，几乎与阴性对照相似，故构建的传感器检测限为0.8%（w/w）。具体结果见图12。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
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<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtcaccgatg agcaagaagg ttttgctgaa ggctttgtca gggcactcgc agagctacac 60
aatcaaaaca ccatgccgaa tgttacctcc gctgctccgc ctacgaactc cggcatggcc 120
cctgtctctt ccatggctgg aaacagtggc ttcagtgcta acatgcacag tgagccgccc 180
gtctatgcta atctcagtaa cttcaatcct agcgcactca atacagtgcc ttcctacaat 240
gcaaacaacc tgggctttcc tccacagcat catataaacc cccagatgcc agtgcagcat 300
ccgcgccttc aagctctgaa agaagagcct cagactgtcc cagaaatgcc cggggagact 360
cctcccctg 369
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgctccgcct acgaactc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgctgcact ggcatctg 18
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tagacgggcg gctcactgtg tctcttccat ggctggaaac 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agcgcactca atacagtgcc ttgatgctgt ggaggaaagc 40
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gctttctcat ctgtgatcca t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ggtaattaat agagcggttc c 21
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
agtgatgcgc taattgcatg aaattatacg tgacgtaccc tat 43
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gcatttatat ccatattgca cgaggtgata atcagacttc tttattgagg 50
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtaccctatg gatgaaccat 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atttgtcctc atgggagg 18
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cctcgtgcaa tatggatata aatgcacaaa atattcatgc aattagcg 48
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aagaagtctg attatcagga accgcgtagc caaagaaagc tgt 43
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
agctttctca tctgtgatcc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ccaaagaaag ctgttgctat 20
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gcaaataaag aatagtgatg cgctacgtac cctatggatg aac 43
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tattgcacga ggactatact atggtttaat agagcggttc ctgat 45

Claims (8)

1.一种检测蛇源成分的LAMP检测引物组合，其特征在于，
包括以下4条引物：
Figure 2
。
2.一种检测蛇源成分的快速检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）提取样品基因组；
（2）采用权利要求1所述LAMP检测引物组合进行LAMP检测；
（3）采用胶体金核酸试纸条进行结果判断。
3.如权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于，所述胶体金核酸试纸条包含胶体金核酸试纸条测试线与质控线，测试线标记有Digoxin抗体，质控线标记有生物素二抗，结合垫有胶体金-生物素抗体标记物。
4.如权利要求2或3所述的快速检测方法，其特征在于，所述胶体金核酸试纸条进行结果判断，检测T线和质控C线均有红色条带，含有目的基因；质控C线有红色条带，而检测T线无条带，不含有目的基因。
5.如权利要求4所述的快速检测方法，其特征在于，蛇源成分样品的靶标检测序列如SEQ ID NO：1所示。
6.如权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于，LAMP检测反应条件为：在60-58℃反应20-90 min，在80-90℃反应2-10 min使酶灭活。
7.如权利要求1所述的检测蛇源成分的LAMP检测引物组合在检测蛇源成分中的应用。
8.如权利要求1的LAMP检测引物组合以及权利要求2-6任一的快速检测方法在蛇源成分鉴定中的应用。
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