CN111793704B

CN111793704B - 鉴别布鲁氏菌疫苗株s2和野毒株的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111793704B
Application number: CN202010945299.3A
Authority: CN
Inventors: 姜海; 张雯; 田国忠; 朴东日; 杨晓雯; 赵鸿雁
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2020-09-10
Filing date: 2020-09-10
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-09-10
Also published as: CN111793704A

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记及其应用。本发明提供用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记，其包含位于如SEQ ID NO.1所示序列第749位多态性为G/T的核苷酸序列，该SNP分子标记的多态性位点为G，对应于布鲁氏菌疫苗株S2，多态性位点为T，对应于野毒株。本发明的SNP分子标记及其检测引物和探针可实现布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的简便和高效鉴别，准确性较高，可应用于布鲁氏菌病病原监测和流行病学分析，为布鲁氏菌病防控提供高效的技术支撑。

Description

鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记及其应用。

背景技术

布鲁氏菌（Brucella）是一种细胞内寄生的革兰阴性球杆菌，引起布鲁氏菌病（简称布病）。2006年以前布鲁氏菌分为6个种，共19个生物型，包括牛种(Brucella abortus)8个生物型、羊种(Brucella melitensis)3个生物型、猪种(Brucella suis)5个生物型、犬种(Brucella canis)、绵羊附睾种(Brucella ovis)和沙漠森林野鼠种(Brucella neotomae)各1个生物型。目前布鲁氏菌增加了5个新种：Brucella ceti(分离自鲸鱼和海豚)、Brucella pinnipedialis(分离自鳍足类)、Brucella microti(分离自田鼠)、Brucellainopinata(分离自乳房移植病人的血液和伤口分泌液)和 Brucella papionis（分离自狒狒）。布鲁氏菌各生物型的G+C含量为55％～59％，DNA高度同源，同源性均在90％以上，基因组大小和组成相似。

免疫家畜既可保护牲畜不受布鲁氏菌感染，也间接地保护了人群。猪2号苗（S2菌苗）是免疫家畜常用的畜用疫苗。此疫苗用于免疫羊群（绵、山羊），免疫方法是口服饮水（口腔灌服）免疫。此疫苗免疫期后2年，保护力约在70-80%之间。牛群的免疫常用牛种布鲁氏菌19号菌株活菌苗（皮下注射）和猪种布鲁氏菌2号菌株活菌苗（S2菌苗）的免疫效果均很好。猪群中基本上不免疫。羊5号苗（M5菌苗）仅在个别地区用于羊的免疫。

布鲁氏菌野毒株和疫苗株的鉴别诊断一直是布鲁氏菌研究的热点。动物流行病学调查和疫情处置中，通过血清学检测来鉴别自然感染和疫苗感染往往不具有特异性，因此从分子生物学角度来寻找特异鉴别位点已迫在眉睫。比较基因组学不仅可以进行全基因组的比较和系统发生的进化关系分析，还可进行细菌基因组多态性的研究，从而揭示基因潜在的功能、阐明物种进化关系及基因组的内在结构。布鲁氏菌的比较基因组学研究不仅加快了新的功能基因和主要致病差异基因的发现，而且为临床实践中疫苗株和野毒株感染鉴别诊断提供了重要技术支撑。随着二代测序技术的发展，常见的疫苗株和亲本菌株的全基因组测序完成，利用比较基因组学分析疫苗株和野毒株在基因组水平的差异，有助于开发疫苗株和野毒株鉴别诊断的新方法。对羊种强毒株M28-12和羊种疫苗株M5、M111的比较基因组学研究发现M5、M28-12和M111共有1370个单核苷酸多态性，其中89个来自M5和Mlll以及M28-12，这些多核苷酸多态性位点可能来自于疫苗株的突变。这些突变位点的发现对设计新的更加安全的疫苗具有重要的启示。

最小核心基因组（minimum core genome, MCG）分型方法是一种基于全基因组数据进行的分析方法，该方法是将所有菌株共有的基因定义为MCG基因，然后查找MCG基因上的单核苷酸多态性位点（SNP）定义为MCG SNP，根据MCG SNP对所有菌株进行分组和聚类，进而对细菌的种群结构进行分析。

目前，实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法在布鲁氏菌检测、布鲁氏菌菌种鉴别、疫苗株与野毒株区分等方面得到了广泛应用，满足了检验检疫、流行病学调查、人和动物布病诊断等多方面的需求。

布鲁氏菌疫苗株S2可能造成人感染，且动物接种S2疫苗后产生的抗体很难和自然感染的野毒株产生的抗体进行鉴别诊断，影响了动物布病监测和疫情处置。因此，开发可区分鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的分子标记以及简便、快速、特异、而低成本的RT-PCR鉴定方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记及其引物探针组。本发明的另一目的是提供该SNP分子标记及其引物探针组的应用。

为实现上述目的，本发明首次基于最小核心组分型技术对布鲁氏菌全基因组信息进行系统的分析。具体地，从NCBI公开数据库下载布鲁氏菌所有种型（共334株）公开的Complete和Scaffold基因组，基于Blast方法，将GCA_000600055.1的基因与334株布鲁氏菌的基因组依次比对，如相似度大于60%且比对序列超过原序列的70%，则认为该基因存在于该基因组中。按照此分析策略，搜索出在所有菌株中存在的Core gene，共计1339个。利用Mummer程序，将Core gene序列与334个基因组依次比对，查找SNP位点，并构建SNP矩阵。将2株S2疫苗株定义为Group 1（疫苗组）；将332株布鲁氏菌野毒株定义为Group2。基于上一步获得的SNP矩阵，筛查可以区分两组菌株的单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism, SNP）位点。可区分两组菌株的SNP位点应具有在该位点组内各菌株间无差异，组间不同的特点。按照以上策略，共筛选出4个SNP位点。进一步在这4个位点中进行筛选，最终得到可准确区分布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记，并设计和筛选用于检测该SNP分子标记的引物和探针。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记，其包含位于如SEQ ID NO.1所示序列第749位多态性为G/T的核苷酸序列。

本发明所述的SNP分子标记的多态性位点位于布鲁氏菌BSS2_I1636基因的第749位，多态性为G/T。

布鲁氏菌不同菌株的BSS2_I1636基因序列可通过数据库获取，其中，布鲁氏菌疫苗株S2的BSS2_I1636基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的SNP分子标记具体可为序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段或者为序列如SEQ ID NO.6所示的DNA片段。

以上所述SNP分子标记的多态性位点为G，对应于布鲁氏菌疫苗株S2，多态性位点为T，对应于野毒株。

进一步地，本发明提供用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

SEQ ID NO.2：BSS2_I1636-F: 5’-TCGATGGCGATGCGGA-3’；

SEQ ID NO.3：BSS2_I1636-R: 5’-GCTGGTCGCCATCGATGA-3’。

本发明还提供与上述引物组配套使用的探针组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

SEQ ID NO.4：BSS2_I1636-G: 5’- CGTGTGCGTCTGG-3’；

SEQ ID NO.5：BSS2_I1636-T: 5’-CGTGTGCTTCTGG-3’。

SEQ ID NO.4-5所示探针分别配对于BSS2_I1636基因（SEQ ID NO.1所示）第749位的G/T多态性序列。

以上所述的探针为MGB探针。

优选地，SEQ ID NO.4所示探针与SEQ ID NO.5所示探针采用不同的荧光基团标记。荧光基团可选自FAM、VIC、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种。

作为本发明的一种实施方式，SEQ ID NO.4所示探针的5’端采用FAM标记，3’端采用BHQ1标记。SEQ ID NO.5所示探针的5’端采用VIC标记，3’端采用BHQ1标记。

本发明提供所述SNP分子标记或其检测试剂或所述引物组或所述探针组在鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记或其检测试剂或所述引物组或所述探针组在鉴别布鲁氏菌疫苗株S2感染和野毒株感染中的应用。

本发明还提供所述引物组或所述探针组在制备用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的试剂盒中的应用。

本发明提供鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的试剂盒，其包括SEQ ID NO.2-3所示的引物组，或者包括SEQ ID NO.2-3所示的引物组和SEQ ID NO.4-5所示的探针组。

以上所述的试剂盒还可包括用于RT-PCR检测的其他试剂，包括但不限于反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、ddH₂O、标准阳性质粒模板、阴性对照等。

具体地，所述试剂盒的工作程序包括如下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）以所述基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物组与SEQ ID NO.4-5所示探针组进行RT-PCR；

（3）根据扩增曲线判断待测样品是否为布鲁氏菌疫苗株S2。

以上步骤（2）中，RT-PCR的反应程序包括：95℃，5-10分钟；95℃，10-30秒，62℃，20-30秒，35-45个循环。

优选地， RT-PCR的反应程序为：95℃，10分钟；95℃，15秒，62℃，30秒，40个循环。

以上步骤（2）中，RT-PCR的反应体系中SEQ ID NO.2-3所示引物组的浓度为300-350nM，SEQ ID NO.4-5所示探针组的浓度为200-250nM。

以上步骤（3）中，若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.4所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株S2；若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ IDNO.5所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为野毒株。

本发明提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的方法，其包括如下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）以所述基因组DNA为模板，分别利用SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ IDNO.4所示的探针和SEQ ID NO.5所示的探针进行RT-PCR；

（3）根据扩增曲线判断待测样品是否为布鲁氏菌疫苗株S2。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明基于最小核心组分型技术进行布鲁氏菌疫苗株S2与野毒株的全基因组比对分析，分析覆盖了NCBI数据库所有公开的中国流行菌株、国际参考菌株和国际流行株，有效保证了筛选得到的SNP位点的高特异性和准确性。

（2）基于筛选得到的SNP分子标记，本发明开发了一对用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的引物和一对MGB探针，探针之间可相互验证，利用该引物对和探针对可实现布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的高效、准确的鉴别。

（3）本发明的SNP分子标记及其检测引物对和探针对可进行布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株快速同步检测和分析，有效提高了检测效率，可实现布鲁氏菌的快速检测和分型，对分离菌株进行简便和高效的鉴定，对于布鲁氏菌的快速识别和鉴定、布鲁氏菌病病原监测和流行病学分析具有重要的意义，为布鲁氏菌病防控提供高效的技术支撑。

附图说明

图1为本发明实施例1中用阳性质粒验证引物和探针特异性的评价结果。

图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9和图10分别为本发明实施例3中疫苗株S2、猪种1型标准株、猪种3型标准株、猪种3型野毒株、绵羊附睾种标准株63/290、沙林鼠种标准株5K33、犬种标准株RM6/66、牛种1型标准株544A和羊种1型标准株16M的扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和布鲁氏菌野毒株的核心SNP分子标记的获得

1、利用最小核心组分型方法对布鲁氏菌全基因组信息进行系统的分析

（1）从美国生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation, NCBI）GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov /genome/）下载布鲁氏菌所有种型（共334株）公开的Complete和Scaffold基因组。

（2）基于Blast方法，将GCA_000600055.1的基因与334株布鲁氏菌的基因组依次比对，如相似度大于60%且比对序列超过原序列的70%，则认为该基因存在于该基因组中。按照此分析策略，搜索出在所有菌株中存在的Core gene，共计1339个。

（3）利用Mummer程序，将Core gene序列与334个基因组依次比对，查找SNP位点，并构建SNP矩阵。将2株S2疫苗株定义为Group 1（疫苗组）；将332株布鲁氏菌野毒株定义为Group2。基于上一步获得的SNP矩阵，筛查可以区分两组菌株的SNP位点。可区分两组菌株的SNP位点应具有在该位点组内各菌株间无差异，组间不同的特点。按照以上策略，共筛选出多个候选靶基因SNP位点。

（4）在各候选SNP位点上下游设计引物和探针，对不同的布鲁氏菌野毒株以及S2疫苗株进行扩增验证，经筛选，最终得到可准确区分布鲁氏菌疫苗株S2和不同布鲁氏菌野毒株的SNP分子标记，该SNP分子标记位于布鲁氏菌BSS2_I1636基因的第749位（布鲁氏菌疫苗株S2的BSS2_I1636基因序列如SEQ ID NO.1所示序列），多态性为G/T，多态性位点为G，对应于布鲁氏菌疫苗株S2，多态性位点为T，对应于野毒株。

2、SNP分子标记的检测引物、探针以及检测方法

上述1中最终筛选得到的SNP分子标记的检测引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.2-5所示：

SEQ ID NO.2：BSS2_I1636-F: 5’-TCGATGGCGATGCGGA-3’；

SEQ ID NO.3：BSS2_I1636-R: 5’-GCTGGTCGCCATCGATGA-3’；

SEQ ID NO.4：BSS2_I1636-G: 5’-FAM-CGTGTGCGTCTGG- BHQ1-3’；

SEQ ID NO.5：BSS2_I1636-T: 5’-VIC-CGTGTGCTTCTGG- BHQ1-3’。

分别以含有布鲁氏菌疫苗株S2的BSS2_I1636基因的阳性质粒为和含有布鲁氏菌野毒株的BSS2_I1636基因的阳性质粒为模板，采用如SEQ ID NO.2-5所示的引物和探针进行RT-PCR扩增。

RT-PCR的20μl反应体系为：2×RT-PCR Mix 10μl，引物和探针混合液（SEQ IDNO.2-3所示引物和SEQ ID NO.4-5所示探针）2μl，去离子水 6μl，阳性质粒模板DNA 2μl。SEQ ID NO.2-3所示引物在反应体系中的终浓度为300nM，SEQ ID NO.4-5所示探针在反应体系中的终浓度为200nM。

RT-PCR的反应条件为： 95℃，10分钟；95℃，15秒，62℃，30秒，40个循环。

阳性质粒模板的扩增曲线如图1所示，利用该SNP分子标记的检测引物和探针可对布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株分别扩增得到特异性扩增曲线。

实施例2 SNP分子标记检测的特异性评价

以与布鲁氏菌存在血清学交叉反应或与布鲁氏菌种近缘的汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、金黄葡萄球菌以及布鲁氏菌作为待测样品，对实施例1筛选得到的SNP分子标记及其引物对和探针对进行检测特异性评价，具体方法如下：

1、基因组DNA的提取

采用北京天根生化试剂有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒内的说明书对汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、金黄葡萄球菌进行基因组DNA的提取。

2、RT-PCR

分别以步骤（1）提取得到的各细菌的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物和SEQ ID NO.4-5所示探针进行RT-PCR。

RT-PCR的20μl反应体系为：2×RT-PCR Mix10μl，引物和探针混合液（SEQ IDNO.2-3所示引物和SEQ ID NO.4-5所示探针）2μl，去离子水 6μl，基因组DNA 2μl。SEQ IDNO.2-3所示引物在反应体系中的终浓度为300nM，SEQ ID NO.4-5所示探针在反应体系中的终浓度为200nM。

3、根据RT-PCR扩增曲线，分析结果。

结果显示，除布鲁氏菌有阳性扩增外，其它各待测样品均没有扩增，表明本发明的SNP分子标记及其检测引物和探针对于布鲁氏菌具有较高的特异性。

实施例3 SNP分子标记在鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和地方布鲁氏菌菌株中的应用

利用实施例1筛选得到的SNP分子标记及其引物（SEQ ID NO.2-3）和探针（SEQ IDNO.4-5）对布鲁氏菌疫苗株S2、布鲁氏菌标准株以及121株地方分离的布鲁氏菌野毒株进行区分鉴别，基因组DNA的提取和RT-PCR同实施例2。

鉴定结果如表1、表2和表3所示，布鲁氏菌疫苗株S2的扩增曲线荧光信号为FAM，对应SNP位点为G，各标准株的扩增曲线荧光信号为VIC，对应SNP位点为T ，121株野毒株的扩增曲线荧光信号为VIC，对应SNP位点为T。

其中，布鲁氏菌疫苗株S2、猪种1型标准株1330S、猪种3型标准株686、菌株编号为114的猪种3型野毒株、绵羊附睾种标准株63/290、沙林鼠种标准株5K33、犬种标准株RM6/66、牛种1型标准株544A和羊种1型标准株16M的扩增曲线分别如图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9和图10所示，结果显示，仅有疫苗株S2可产生SEQ ID NO.2-3所示引物和SEQ IDNO.4所示探针扩增得到的特异性扩增曲线（FAM荧光信号），其它菌株均未获得该特异性扩增曲线；猪种1型参考菌株1330S、猪种3型参考菌株、猪种3型野毒株以及绵羊附睾种标准株63/290、沙林鼠种标准株5K33、犬种标准株RM6/66、牛种1型标准株544A和羊种1型标准株16M可产生SEQ ID NO.2-3所示引物和SEQ ID NO.5所示探针扩增得到的特异性扩增曲线（VIC荧光信号），而疫苗株S2未获得该特异性扩增曲线。

以上结果表明，本发明的SNP分子标记可实现布鲁氏菌疫苗株S2和地方布鲁氏菌菌株的特异性区分鉴别，特异度为100%。

表1 布鲁氏菌野毒株扩增结果

表2 布鲁氏菌野毒株和疫苗株扩增结果

表3 布鲁氏菌标准株扩增结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的SNP分子标记及其应用

<130> KHP201115500.5YS

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacacgga aattttttgg aaccgatggc attcgcggac aggcaaacag ctttccgatg 60

acaccggaaa tcgccatgaa agtgggtatg gccgttggct atatcttccg tcgcaaaggt 120

caggcctctc gcgtggtgat cggcaaggat acacgccgct ccggctatat gctggaaaat 180

gcgctggtgg ccggttttac cgctgccggc atggacgtgt tcctgctggg cccgatcccg 240

acccctgccg tcgccatgct ctgccgctcg ctgcgcgctg atatcggggt gatgatttcc 300

gcgtcgcata atcccttcta cgataacggc atcaagcttt tcggccccga tggcttcaag 360

ctttcggacc agatcgagct tcagatcgag gcgatgatcg aaggcgatat gacgcctttt 420

cttgcgagcc atggcgatgt tggccgcgcc aagcgcgtgg acggcgatat ttatcgctat 480

atcgaatttg ccaagcgcac attgccgcgc aacatctcgc tcaatgggct gcgcgttgtg 540

gtcgattgcg cgaatggcgc gggttacaag gttgcgccgg ctgcgctgtg ggaactgggc 600

gcggaagtca ttaccatcaa caacgagccg aatggcatca atatcaacga ggattgcggc 660

tcgacgcatc ccatcggcct tatgaagaaa gtgcatgagg tgcgcgccga tgtgggtatc 720

gcgctcgatg gcgatgcgga tcgtgtgcgt ctggtcgatg aaaacggcac cgtcatcgat 780

ggcgaccagc tcatggctgt catcgccgaa agctgggctg cgagcaatcg cctggaaggc 840

ggcggcattg tcgccactgt catgtccaat ctcggcctgg agcgtttctt ggccgaccgt 900

aatctgacgc ttgcccgtac caaggttggc gaccgctatg tggtcgagca catgcgcgag 960

catggtttca atgtgggtgg cgagcagtcg ggccatatcg ttctgtcgga ttttgcgacg 1020

actggcgacg gtcttatctc cgcgctccag atacttgccg tggcgcagga acagaacaag 1080

ccgatcagcg atgtatgccg caaattccag ccggtgccgc aattgttgaa gaatgtccgc 1140

accacaggcg gcaaaccact tgaaaacaaa cgcgtgaaat cagcgatcga tgaggccaag 1200

gaacgccttg gcggtcaggg gcgactggtt atccgcccgt cgggcacgga gccgctcatc 1260

cgcgtcatgg cggaaggtga cgaccgtggc ctggtcgaaa aagtggtgaa cgacatcatt 1320

gatgtaatct cttcggaaag cagtgctgcg gcctga 1356

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgatggcga tgcgga 16

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctggtcgcc atcgatga 18

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtgtgcgtc tgg 13

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtgtgcttc tgg 13

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgatggcga tgcggatcgt gtgcgtctgg tcgatgaaaa cggcaccgtc atcgatggcg 60

accagc 66

Claims

1.SNP分子标记的检测引物探针组在制备用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的试剂盒中的应用，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，其第749位的多态性为G/T，多态性位点为G，对应于布鲁氏菌疫苗株S2，多态性位点为T，对应于布鲁氏菌野毒株；所述引物探针组中引物的序列如SEQ ID NO.2-3所示，探针的序列如SEQ ID NO.4-5所示。

2.用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组中引物的序列如SEQ ID NO.2-3所示，探针的序列如SEQ ID NO.4-5所示。

3.鉴别布鲁氏菌疫苗株S2和野毒株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物探针组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序包括如下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（3）根据扩增曲线判断待测样品是否为布鲁氏菌疫苗株S2。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR的反应程序包括：95℃，5-10分钟；95℃，10-30秒，62℃，20-30秒，35-45个循环。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR的反应体系中，SEQ IDNO.2-3所示引物组的浓度为300-350nM，SEQ ID NO.4-5所示探针组的浓度为200-250nM。

7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.4所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株S2；若SEQ IDNO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.5所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为野毒株。