CN106701980A

CN106701980A - 用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心snp标记及其应用

Info

Publication number: CN106701980A
Application number: CN201710064639.XA
Authority: CN
Inventors: 姜海; 张雯; 赵娜; 崔步云; 朴东日; 赵鸿雁; 田国忠; 狄栋栋; 范伟兴
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2017-02-04
Filing date: 2017-02-04
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2037-02-04
Also published as: CN106701980B

Abstract

本发明提供一种用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用。本发明基于最小核心基因组(minimum core genome,MCG)分型技术，通过筛选每个MCG Group中特有的单核苷酸多态性(SNP)位点，获得用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记，所述核心SNP标记分别位于布鲁氏菌基因BOV_0551和基因BOV_A0392上，并设计引物对分离菌株进行简便和高效的鉴定，可应用于布病病原监测和流行病学分析，为布病防控提供新的技术支撑。

Description

用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用。

背景技术

布鲁氏菌是一种细胞内寄生的革兰阴性球杆菌，引起布鲁氏菌病(简称布病)。布病是一个世界范围内重要的人兽共患病，给流行地区和国家造成巨大的经济损失并严重危害人类健康。2006年以前布鲁氏菌分为6个种，共19个生物型，包括牛种(Brucellaabortus)8个生物型、羊种(Brucella melitensis)3个生物型、猪种(Brucella suis)5个生物型、犬种(Brucella canis)、绵羊附睾种(Brucella ovis)和沙漠森林野鼠种(Brucellaneotomae)各1个生物型。目前布鲁氏菌种增加了5个新种：Brucella ceti(分离自鲸鱼和海豚)、Brucella pinnipedialis(分离自鳍足类)、Brucella microti(分离自田鼠)、Brucella inopinata(分离自乳房移植病人的血液和伤口分泌液)和Brucella papionis(分离自狒狒)。在国内，引起人(动物)布病的病原体主要是羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌，病原体的准确鉴定是控制与根除布病的关键。传统的布鲁氏菌种及生物型的鉴定是依据菌株生长CO₂的需求试验、硫化氢产生试验、噬菌体裂解试验、硫堇和碱性复红染料抑菌试验和单项特异性血清(A、M和R血清)凝集试验，这种生物分型方法是金标准，其缺点是操作复杂，需要的时间长。基于敏感、特异、快速的PCR技术的分子生物学方法具有广阔的应用前景。目前文献报道的PCR方法很多，其中主要是以BCSP3l、Bp26和VirB8基因为依据而设计的属水平鉴定用PCR方法，种内生物型水平上的鉴定主要有AMOS—PCR方法、多重PCR方法和多位点串联重复序列分析方法(MLVA)。近10年的布鲁氏菌分离鉴定显示，羊种菌仍然是当前的主要流行菌，其次是牛种菌。这两种菌是我国人(畜)间布病流行的主要病原菌，为了更好地加强我国布病病原监测能力，提高病原检测水平，设计一种简便、快速、特异、而低费用的PCR方法对布鲁氏菌进行鉴定，最终为判定和处置疫情提供强有力的技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用。

本发明基于以下构思：随着测序技术的发展，全基因组在布鲁氏菌的进化和分类研究中已得到越来越多的应用。尽管如此，由于布鲁氏菌各个种之间DNA的高度相似性，不同布鲁氏菌种间的关系以及进化顺序等问题一直没有统一的观点。现在已有许多学者应用布鲁氏菌的全基因组测序数据和方法对布鲁氏菌进行毒力、进化等方面的分析，但是中国布鲁氏菌的测序数量和分析仍然稀缺，我国作为全球布鲁氏菌病疫情较为严重的国家之一，对我国布鲁氏菌株的全基因组测序和方法的探索显得尤为迫切和重要。最小核心基因组(minimum core genome,MCG)分型方法是一种基于全基因组数据进行的分析方法，该方法是将所有菌株共有的基因定义为MCG基因，然后查找MCG基因上的单核苷酸多态性位点(SNP)定义为MCG SNP，根据MCG SNP对所有菌株进行分组和聚类，进而对细菌的种群结构进行分析。本发明通过筛选每个MCG Group中特有的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)位点，用于我国布鲁氏菌流行株的鉴别，对于布鲁氏菌的快速识别和鉴定具有重要的意义。目前国内外尚未有将最小核心组分型方法系统应用于布鲁氏菌分型研究的报道，本发明为布鲁氏菌的分型分析提供了新思路。

为了实现本发明目的，本发明提供的用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记，其特征在于，所述核心SNP标记分别位于布鲁氏菌基因BOV_0551和基因BOV_A0392上；其中布鲁氏菌基因BOV_0551序列的第565962、566005、566081和566095处碱基分别为T、A、C和A鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为C、G、T和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQ ID NO:1-2所示；布鲁氏菌基因BOV_A0392序列的第413407、413580、413581和413597处碱基分别为C、A、G和G鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为T、G、A和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQ ID NO:3-4所示。以上位点的参考序列为绵羊副睾种布鲁氏菌。

本发明还提供用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，包括正向引物BOV_0551-F5’-CGGTACTGGAAGGCTTCGATAAAG-3’和反向引物BOV_0551-R 5'-TCAGAAAGATTTCAATGCGGATGT-3'。

本发明还提供用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，包括正向引物BOV_A0392-F 5’-ATGCTTGCCCATGACCTCATCC-3’和反向引物BOV_A0392-R 5'-TCAAATCCCAGCCAGTCTTTTC-3'。

本发明还提供所述核心SNP标记在鉴别羊种和牛种布鲁氏菌中的应用，包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)以上述提取的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，和/或利用EQID NO:3-4所示引物，通过PCR反应分别扩增出含有所述核心SNP标记的DNA片段；

3)检测PCR扩增产物。

PCR反应的扩增体系(20μl)：100nM DNA模板0.5μl，10μM正向引物和反向引物各0.4μl，2×PCR MIX 10μl，余量为水。

PCR反应的扩增程序为：95℃2分钟；95℃2分钟，58℃30秒，72℃30秒，30个循环。

步骤3)中检测PCR扩增产物采用测序法。

本发明还提供含有所述引物对BOV_A0392-F/R和/或BOV_0551-F/R的用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。

更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明首次基于布鲁氏菌全基因组SNP信息，筛选得到羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌鉴定用SNP，并设计引物对分离菌株进行简便和高效的鉴定，可应用于布病病原监测和流行病学分析，为布病防控提供新的技术支撑。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(一)所选靶序列是根据中国流行菌株和国际参考菌株全基因组比教获得的，保证筛选得到的SNP位点更特异。

(二)筛选得到了两对用于鉴别羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌的引物，使鉴定具有选择性。

(三)一次PCR反应经测序，可以获得丰富的SNP位点信息，使鉴定更高效。

附图说明

图1为本发明实施例2中两对引物检测敏感性评价结果。

图2为本发明实施例3中两对引物检测地方布鲁氏菌菌株结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记的获得

1、布鲁氏菌菌株选择

研究对象选取中国疾病预防控制中心布传染病预防控制所布鲁氏菌菌种保藏库保存的20株布鲁氏菌。其中羊种15株，牛种3株，猪种2株。采集分离于内蒙古自治区、黑龙江省、山东省、甘肃省等10个省(自治区)，并经形态和生化鉴定核实确定菌株的种型。本实施例中另外55菌(含一株参考菌株)下载于美国生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)。

2、布鲁氏菌基因组DNA提取

应用北京天根生化试剂有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒内的说明书对20株布氏菌进行全基因组DNA提取。用Nanodrop紫外分光光度计测定提取出的布氏菌基因组DNA吸光度值(OD值)和浓度(结果见表1)，确定DNA的浓度是否满足测序标准，满足标准的菌株标注并记录信息后-20℃保存备用测序。

表1测序用20株布鲁氏菌全基因组DNA浓度和OD值

3、布鲁氏菌全基因组建库和测序

DNA浓度满足标准的20株布鲁氏菌的核酸样品编号，送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行全基因组建库和测序。使用超声剪切的方法使布氏菌DNA片段化，然后用构建平均长度为500bp的双末端全基因组DNA小片段文库，最后使用Illumina GA IIx进行双末端全基因组测序。

4、布鲁氏菌基因组注释和组装

测序产生的初始数据(raw data)使用SOAP denovo http://soap.genomics.org.cn)进行组装，然后应用SolexaQA程序中的DynamicTrim和LengthSortPerl脚本对raw data的质量进行分析，去除不理想的数据，最后应用SOAP GapCloser程序对序列进行拼接。注释阶段，应用Glimmer的基因预测程序对基因进行识别，并根据GenBank数据库应用BLASTP(e-value<1e-10,identity>80and>100aa)对基因功能进行注释，以Interpro，GO和COG数据库为基础，对编码序列(Coding sequence,CDS)中的开放阅读框架(open reading frame，ORF)序列进行分类。

5、核心基因组(core genome)分析和SNP的识别

通过OrthoMCL程序识别直系同源基因，将BLAST的E值设为1e-5，膨胀系数(inflation parameter)为1.5构建基因组构成的矩阵。所有75株布鲁氏菌菌株都包含的基因被视为核心基因组基因(core genome genes)。使用随机选择的基因组的中位数对核心基因进行计算，应用双指数曲线对所有菌株和核心基因进行回归分析。应用SOAPsnp和Mummer程序对布鲁氏菌基因组进行比对，识别布鲁氏菌基因组全部SNP，并用Mummer程序包中的Nucmer程序对完成图的全基因组序列中的SNP进行挑选，用SOAPsnp程序对草图中SNP位点上质量大于等于20的reads的SNP进行挑选，去除SNP位点上质量小于20的reads。查找SNP的标准为：(a)SNP位点的质量值大于等于20的reads；(b)两个SNP位点的距离大于等于5bp；(c)杂合SNP的先验概率为0。

6、最小核心基因(MCG)和MCG SNPs数量

经计算，每1株布氏菌的基因数目是3199到3273。对75株全基因组数据进行比较，共1,089个基因为所有布氏菌所共有，我们将这些共有的基因视为最小核心基因(minimumcore genome，MCG)。经75株布氏菌的全基因组数据与参考菌株Ochrobactrum anthropiATCC49188比对，结果显示75株布氏菌共有156,097个SNPs，其中，MCG SNPs 52,030个，并且29,041个位于MCG基因上。所有MCG SNPs随机分布在整个基因组中。

7、进化分析、组内特有SNP识别

通过Structure软件对75株布氏菌的种群结构进行分析，并设定一个以种群遗传学位基础的亚群作为菌株的识别和分型依据。将75株菌共设为2～15个MCG亚群分别进行迭代分析，最终结果显示，分为6个亚群(即MCG Group)的结果最优，每个MCG Group中分别包括25，23，23，2，1，1个布氏菌。6个群组中，MCG Group 1的多样性程度最高，这可能是由于MCG Group 1中每种布氏菌的菌株数量较少造成的。

6个MCG group的具体分组情况如下：

(MCG Group 1)B.pinnipedialis,B.ceti,B.ovis,B.sp.NVSL07-0026,B.suis,B.canis,B.neotomae,B.microti group；

(MCG Group 2)B.abortus group；

(MCG Group 3)B.melitensis group；

(MCG Group 4)B.sp.NF 2653and B.sp.83/13；

(MCG Group 5)B.inopinata BO1；

(MCG Group 6)B.inopinata BO2。

尽管羊种和牛种布鲁氏菌的DNA序列同源性较高，但是本发明结果显示两者能够明确的分为两个进化分支，一个分支全部为羊种布氏菌，而另一分支全部为牛种布氏菌。此前的布氏菌全基因组比较分析证实过羊种和牛种布氏菌同属一个进化谱系。然而，对全部3个羊种和8个牛种布氏菌所有生物型的进化分析，本发明尚属首次。我们构建的进化树中，羊种布氏菌分支最上部的18株菌分离地均为中国，不仅验证了这些菌株进化距离很近，也从另一方面体现了此分析方法的合理性。牛种布氏菌分支中的后8株菌的遗传距离较近，遗传多样性较小，这是由于这些菌株全部为牛种1型布氏菌，该型是牛种布氏菌流行最广泛的生物型之一。

对布鲁氏菌的MCG Group的分类同样具有重要的公共卫生学意义。尽管羊种、牛种和猪种布鲁氏菌均能够引起人的感染，但是MCG Group 2和3中的羊种和牛种布鲁氏菌是两种主要的引起人类感染的布鲁氏菌种。因此，从6个MCG Group内分别挑选出一定数量的组内特异性SNP，可构成布氏菌快速识别的SNP集合，可用于布鲁氏菌的快速识别和鉴定，并对流行病学研究提供一定的依据。这个方法对于全基因组分析技术不成熟的地区，以及由于各方面条件限制全基因组分析无法实现的实验室，提供了一种简便、快速、低成本的、可靠的分析方法。

根据大量SNP筛选，最终拟对两个靶基因SNP进行验证和评估。第一个靶基因ORF为BOV_0551，第二个靶基因ORF为BOV_A0392，参考序列为绵羊副睾种布鲁氏菌。本发明设计的引物序列位置(下划线)和SNP位点(斜体加粗)信息如下(表2)：

BOV_551：

ATGAAACCCACAGTTCATGATATAGCCAGAACAGCGGGCGTAAGCCTCGCCACGGTCGACCGCGTTTTGAATGACCGTCCCGGTGTCAGAGCCAAAACGCGTGATCGCGTAATGGCCGCAATGAATATGCTGGGCTATGTGGGCGCGGCAAATCTTGCGCGCGGGTGGCTCTATCAGTTCGATTTCATTTTGCCGGACAACGAAAACACCTTCATGCTGAGCCTGCGTTCGGAATTATATGCGGCGAGCGAGCGTGCGCTTGCCGAGCGTGTGCGCATCAACCTGCGGCTGGTTCCAGCCTTCGATGAAGCAGCACTTGTTGCTGCGCTGGATGAAAGTGCGGCGCGCAAACCGGACGGCGTAGCCTTTGTTGCCCTCGATACCGATCCGGTACGCGAGGGCTGCGCGCGGTTTGCTGAAAAGGGCATCCATGCGGTTACGCTCGTTTCCGATCTCGGCCAATCTGCGCGCGAGCATTATGTCGGCGTGGATAACGGGGCTGCGGGCCGCACGGCGGCACGGCTTCTGGGTCTTTTTGCCAATGGAACGGAGGGCTCGATTGCCGTCGTTGCTGGTTCGCTGAAAGTGCGCGACCACCGCGAACGTTTCGACGGATTCAGGGCGGCGATGCAGGCGGATTTTCCGGACCGGGAAATATTGCCGGTACTGGAAGGCTTCGATAAAGACCCGCAGGTCGAAAAACTGGTTGGCGAGTGCTGGCAAAACGAGCGATATTGCAGGCATTTACAGTCTGGGCGCGGGCAATAGCGGGCTTGTGGCTGCCCTTTCGGCACACAAGGCCACCACCCGCTCGTCATTGCGCATGAGCGCGACGAGATAACCTAAAGGCGCTTGAAGACGGCATCATCCACGCCATTCTGGCGCAGGATGCGGGCCACGAAATCTGCAGCGCCATCCGGGTGCTCAAAGCCTCGGCCGACCGGCTCGCCATCGTGCCGGGGCAAGAATACATCCGCATTGAAATCTTTCTGAAAGACAACCTGCCCCGCTTCAACTGA

BOV_A0392：

ATGTCCAAGAGCGATCCTATTGTCATCGTCGGTGCTTCGCGCACCCCCATGGGCGGTTTTCAGGGTGACTTCACAAATGCGCAGGCAACCGACCTTGGCGCTTCCGCCATCGGCGGCGCGCTTGCCGGTGCAGGCCTTGCCCCGGAAGCCGTCGAGGAGGTTATCATGGGCTGTGTCCTGCCTGCTGGTCAGGGTCAGGCGCCTGCGCGTCAGGCCTCGCTCAAGGCCGGGCTGCCGCTTGGCACCGGTGCCACGACCGTCAACAAGATGTGCGGCTCGGGCATGAAGGCCGCGATGCTTGCCCATGA CCTCATCCTTGCCGGTTCCGCCGATGTCATCGTCGCGGGCGGCATGGAAAGCATGACAAATGCCCCCTATCTTCTGCCCAAGGCGCGCGGGGGCTATCGCATGGGCCATGGACAGGTGCTCGACCATATGTTCCTCGATGGGCTGGAAGATGCCTATGACAAGGGGCGCCTGATGGGCACGTTTGCGGAAGATTGCGCCGAGGCCTACCAGTTCACGCGCGAGGCGCAGGACGCATTTGCGATATCCTCCCTGACCCGCGCGCAGAACGCGATCAAGGATGGTCTTTTTGCGGCGGAAATCACGCCGGTCAAGGTCAAGTCCGGCCGCGCCGAGGTGGAAGTTACATTGACGAGCAGCCGCAAGGCAAAGCTGGACAAGATCCCCACGCTGCGCCCCGCCTTCCGCGAAGGCGGCACGGTAACGGTGGCCAATTCCTCTTCCATTTCCGATGGCGCGGCAGCACTTCTGCTCATGCGCGCATCGGAGGCAGAAAAACGTGGCCTCACCCCGCGCGCGGTCATCACCGGCCAGCAACCTATGCCGACAAGCCAAATCTCTTCTCCACGGCCCCCATTGGCGCGATCCGCAAACTGTCTGAAAAGACTGGCTGGGATTTGAAGGATGTCGATCTCTTCGAGATCAATGAAGCCTTTGCCGTTGTTGCCATGGCCGCCATGCGCGATCTCGACCTGCCGCACGACAAGGTCAATATTCATGGCGGCGCCTGTGCACTTGGCCACCCCATCGGCGCATCGGGCGCACGTATTCTTGTAACCCTGCTGGCGGCACTTGAAACACATGGCCTGAAGCGCGGCATCGCGGGCATCTGCCTTGGCGGCGGCGAGGCAACCGCAATGGGTATCGAAAGGATCATCTGA

表2牛种和羊种布鲁氏菌SNP位点信息

8、验证与评估

20μl扩增体系：100nM DNA模板0.5μl，10μM正向引物和反向引物各0.4μl，2×PCRMIX 10μl，余量为水。

PCR反应程序为：95℃2分钟；95℃2分钟，58℃30秒，72℃30秒，30个循环。

PCR产物纯化与测序：

序列比对：下载所有布鲁氏菌参考菌株靶基因序列，用MEGA5.1软件将待测菌株序列与参考菌株比对，根据4个SNP特征综合判断是羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌或其它种布鲁氏菌。

实施例2两对引物检测敏感性及特异性评价

1、两对引物检测敏感性评价

将标准菌株羊种布鲁氏菌16M和牛种布鲁氏菌544A核酸分别进行倍比稀释，浓度依次为1:1、1:10、1:100、1:1000,1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸。分别用两对引物扩增，扩增结果见图1(上方是BOV_A0392引物，下方是BOV_0551引物)。结果显示：BOV_0551引物敏感性高于BOV_A0392，优先作为鉴定用引物(表3)。

表3

2、两对引物检测特异性评价

将与布鲁氏菌有血清学交叉反应或与布鲁氏菌种近缘的汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、金黄葡萄球菌作为对照进行特异性检验，结果显示除布鲁氏菌有阳性扩增外，其它均没有扩增条带。

实施例3两对引物检测地方布鲁氏菌菌株中的应用

分别对分离于不同年代和地域的已经用生化鉴定的100株布鲁氏菌地方菌株(60株羊种菌、50株牛种菌、30株猪种菌和20株犬种菌)DNA进行PCR扩增后测序评价。所有羊种菌和牛种菌都出现了特有的SNP信息，特异度为100％。部分待测菌株扩增产物序列比对结果见图2。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用

<130> KHP171110669.2TQ

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggtactgga aggcttcgat aaag 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcagaaagat ttcaatgcgg atgt 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcttgccc atgacctcat cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcaaatccca gccagtcttt tc 22

Claims

1.用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记，其特征在于，所述核心SNP标记分别位于布鲁氏菌基因BOV_0551和基因BOV_A0392上；其中布鲁氏菌基因BOV_0551序列的第565962、566005、566081和566095处碱基分别为T、A、C和A鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为C、G、T和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQ ID NO:1-2所示；布鲁氏菌基因BOV_A0392序列的第413407、413580、413581和413597处碱基分别为C、A、G和G鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为T、G、A和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQ ID NO:3-4所示；

以上位点的参考序列为绵羊副睾种布鲁氏菌。

2.用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，其特征在于，包括正向引物BOV_0551-F5’-CGGTACTGGAAGGCTTCGATAAAG-3’和反向引物BOV_0551-R 5'-TCAGAAAGATTTCAATGCGGATGT-3'。

3.用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，其特征在于，包括正向引物BOV_A0392-F5’-ATGCTTGCCCATGACCTCATCC-3’和反向引物BOV_A0392-R 5'-TCAAATCCCAGCCAGTCTTTTC-3'。

4.权利要求1所述核心SNP标记在鉴别羊种和牛种布鲁氏菌中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)以上述提取的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，和/或利用EQ IDNO:3-4所示引物，通过PCR反应分别扩增出含有所述核心SNP标记的DNA片段；

3)检测PCR扩增产物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：100nM DNA模板0.5μl，10μM正向引物和反向引物各0.4μl，2×PCR MIX 10μl，余量为水；

PCR反应使用的条件为：95℃2分钟；95℃2分钟，58℃30秒，72℃30秒，30个循环。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物采用测序法。

7.含有权利要求2或3所述引物对的用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。