CN112481399B - 一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌mlst分型的引物组及建库方法 - Google Patents

一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌mlst分型的引物组及建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组及建库方法，属于微生物分型技术领域。基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物。该引物组是通过扩增7个管家基因中450bp核心片段的核苷酸序列，对其组合索引编号，使不同菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性，实现MLST分型及溯源。该基因组能把不同来源的25个样本全部区分开。所述引物组在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。

Description

一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组 及建库方法
技术领域
本发明属于微生物分型技术领域，具体涉及一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组及建库方法。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)引起的一种传染病，据世界卫生组织(WHO)报道，全球结核病潜伏感染人群众多，我国也存在结核病发病率高的现状。
目前国家已经出台多项政策积极开展对结核病的控制，其中包括对某些结核病治疗药物的免费发放等。但因为耐药结核病的存在，尤其是耐多药结核菌株的存在，致使疾病的控制与药物的治疗变得更为复杂。
从基因水平上对结核分支杆菌进行分析和检测，采用分子流行病学手段对结核进行分型，有助于对结核分枝杆菌进行溯源研究，对于不同地域的结核分枝杆菌耐药性进行总结和评价，指导用药。
目前，用于分子分型研究的主要方法是限制性片段长度多态性(RFLP)、多位点可变数目重复单元分析(VNTR)、细菌多位点序列分型(MLST)等，其中MLST是针对7～11个保守的管家基因进行分析，可以从保守基因上代表基因组的变异。然而现有技术中针对结核分枝杆菌，缺乏用于MLST分型的管家基因种类及组合，因此，不能快速准确的判断结核分枝杆菌的具体基因型。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供扩增MLST分型基因的引物组在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用，经过筛选和组合得到用于MLST分型的基因。
本发明的目的还在于提供一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组及结核分枝杆菌MLST分型的二代测序建库方法，采用所述引物组能够准确区分不同种类结核分枝杆菌菌株的基因型。
本发明提供了扩增MLST分型基因的引物组在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用，所述MLST分型基因包括gyrA基因、rpoB基因、pks5基因、Rv2295基因、mbtF基因、leuB基因和embB基因。
本发明提供一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组，包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物；
所述gyrA基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的反向引物；
所述rpoB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的反向引物；
所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：6所示的反向引物；
所述Rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：8所示的反向引物；
所述mbtF基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：10所示的反向引物；
所述leuB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：12所示的反向引物；
所述embB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：14所示的反向引物。
本发明提供了一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的试剂盒，包括所述引物组。
优选的，还包括以下试剂：多重PCR扩增用缓冲液、dNTP和GXL聚合酶。
本发明提供了所述引物组在制备结核分枝杆菌的MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了一种结核分枝杆菌MLST分型的二代测序建库方法，包括以下步骤：
1)提取待分型的结核分枝杆菌菌株的DNA；
2)以提取的DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR产物；
3)将所述多重PCR产物纯化、回收、定量后构建Illumina文库。
优选的，步骤2)中多重PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。
优选的，步骤2)中多重PCR扩增的反应体系为20μL：5×PCR缓冲液4μL、10mmol/LdNTP 2μL、10μmol/L多重引物对0.4μL、1.25U/μL GXL聚合酶0.2μL、模板DNA 0.5μL、ddH2O13.5μL。
优选的，步骤3)中构建Illumina文库的方法是将定量后的多重PCR产物依次末端补平和加dA尾，连接接头，分离连接产物和文库扩增。
优选的，所述末端补平和加dA尾的反应条件为20℃，15min；65℃，15min；
所述末端补平和加dA尾的反应条件为10ng/μL浓度的PCR产物10μL、15μL EndPrep Mix4，用ddH2O补至50μL。
优选的，所述文库扩增的反应体系为50μL：所述引物组5μL、VAHTS HiFiAmplification Mix 25μL、模板DNA 20μL；
所述文库扩增的反应条件为：95℃3min；98℃20sec，60℃15sec，72℃30min，8个循环；72℃5min。
本发明提供的基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组，本发明通过生物信息学手段，对全球已知来源的序列进行全基因组的比较，找到变异稳定具有代表性的位点和基因片段作为靶标基因(包括gyrA基因、rpoB基因、pks5基因、Rv2295基因、mbtF基因、leuB基因和embB基因)，以这7个靶标基因为模板设计用于二代测序的引物组。实验表明，采用本发明提供的7个靶标基因设计的7对引物能够将25个样本全部区分开，而且经验证采用二代测序的引物组分型结果与Sanger测序的分型结果完全一致，说明本发明提供的引物组能准确快速实现结核分枝杆菌的MLST分型目的。
本发明还提供了本发明提供了一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的试剂盒，包括所述引物组。所述引物组是通过扩增7个管家基因(包括gyrA基因、rpoB基因、pks5基因、Rv2295基因、mbtF基因、leuB基因和embB基因)中长度约为494bp(416bp～500bp)核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。同时，本发明提供的试剂盒是基于二代测序技术设计，能够实现同一样本同时多基因扩增，大大节约了分型分析的时间，简化了操作，而且检测结果准确可靠，为商业快速进行结核分枝杆菌MLST分型奠定基础。
本发明提供了所述引物组在制备结核分枝杆菌的MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。本发明根据现有的结核分枝杆菌菌株建立了含有100个序列的溯源库(分型库)，并将溯源库(分型库)上传至溯源(分型)网站中，在进行结核分枝杆菌的MLST分型或溯源时，将所述引物组扩增后产物构建Illumina文库，经测序得到的测序结果与溯源库(分型库)进行比较，准确得到结核分枝杆菌菌株的基因型。同时本发明通过精细分析选取来自16个国家和地区的25株菌，通过本发明方法可以将16个国家和地区的菌株进行溯源。
附图说明
图1为构建的25株菌样品全基因组系统发育树；
图2为选择的7个靶标基因MLST系统发育树；
图3为采用本发明提供引物组进行二代测序电泳图。
具体实施方式
本发明提供了扩增MLST分型基因的引物在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源中的应用，所述MLST分型基因包括gyrA基因、rpoB基因、pks5基因、Rv2295基因、mbtF基因、leuB基因和embB基因。本发明通过对来自4个洲，16个国家的25株结核分枝杆菌菌株的全基因组比对，分析统计每个基因的SNP数量，选择30个具有SNP位点较高的基因片段，经进一步筛选确定选择在同一个位点，有多种不同SNP形式的核心位点，共9个位点(如表2所示)，分布于7个基因(包括gyrA基因、rpoB基因、pks5基因、Rv2295基因、mbtF基因、leuB基因和embB基因)中，将这7个基因片段进行串联构建系统发育树(NJ)，结果表明这7个基因能够把25个样本都区分开。
本发明提供一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组，包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物。所述gyrA基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：1(ACATCCAGCAGGAGATGCAG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：2(GTAGCACCGTCGGCTCTTG)所示的反向引物。所述rpoB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQID No：3(GCGAGCTGATCCAAAACCAG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：4(CACGATCTCGTCGCTAACCA)所示的反向引物。所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQID No：5(GCGCAAGGTTCGACATCAC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：6(CCACAACCGCGCCTACA)所示的反向引物。所述Rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQID No：7(GATGAGCCGGTCACTACTCG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：8(GCCTCGTTAAGCTCCTCCTC)所示的反向引物。所述mbtF基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQID No：9(AGTGCGACCAACGGCTG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：10(CGGGAGCTGGATGCATTGG)所示的反向引物。所述leuB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQID No：11(GTCGATATTCCCACTGGCCG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：12(ATCACCACATCAACCTGCGT)所示的反向引物。所述embB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQID No：13(TGATATTCGGCTTCCTGCTC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：14(ACCGCTCGATCAGCACATAG)所示的反向引物。本发明对所述引物组的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的引物组的制备方法即可，例如人工合成。在本发明实施例中，所述引物组委托金唯智生物科技有限公司合成得到。
本发明提供了一种结核分枝杆菌MLST分型的二代测序建库方法，包括以下步骤：
1)提取待分型的结核分枝杆菌菌株的DNA；
2)以提取的DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR产物；
3)将所述多重PCR产物纯化、回收、定量后构建Illumina文库。
本发明提取待分型的结核分枝杆菌菌株的DNA。
本发明对提取待分型的结核分枝杆菌菌株的DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取细菌的DNA方法即可，例如CTAB法或采用商品化细菌DNA提取试剂盒均可。
得到菌株的DNA后，本发明以提取的DNA为模板，用所述引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR产物。
在本发明中，多重PCR扩增的反应程序优选如下：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。多重PCR扩增的反应体系优选为20μL：5×PCR缓冲液4μL、10mmol/L dNTP 2μL、10μmol/L多重引物对0.4μL、1.25U/μL GXL聚合酶0.2μL、模板DNA 0.5μL、ddH2O 13.5μL。其中多重引物对中14条引物的浓度分别为10μmol/L。
得到多重PCR产物后，本发明将所述多重PCR产物纯化、回收、定量后构建Illumina文库。
在本发明中，所述多重PCR产物纯化采用DNA纯化试剂盒即可，具体操作方法按照说明书进行，在此不做赘述。本发明对所述DNA纯化试剂盒的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的DNA纯化试剂盒即可。本发明对回收不做具体限定，采用本领域所熟知的回收方案即可，例如采用商品DNA回收试剂盒即可。所述定量后，调整多重PCR产物的浓度至5ng/μL～50ng/μL，用于后续Illumina文库的构建。
在本发明中，构建Illumina文库的方法优选是将定量后的多重PCR产物依次末端补平和加dA尾，连接接头，分离连接产物和文库扩增。所述末端补平和加dA尾的反应条件优选为20℃，15min；65℃，15min；所述末端补平和加dA尾的反应条件优选为10ng/μL浓度的PCR产物10μL、15μL End Prep Mix4，用ddH2O补至50μL。所述文库扩增的反应体系优选为50μL：所述引物组5μL、VAHTS HiFi Amplification Mix 25μL、模板DNA 20μL。所述文库扩增的反应条件优选为：95℃3min；98℃20sec，60℃15sec，72℃30min，8个循环；72℃5min。
在本发明中，所述文库扩增后还优选包括分离文库片段。所述分离文库片段的方法优选采用磁珠吸附的方法进行。
本发明提供了一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒优选还包括以下试剂：多重PCR扩增用缓冲液、dNTP和GXL聚合酶。所述试剂盒的检测方法是以样本的DNA为模板，以所述引物组作为扩增引物进行多重PCR扩增，得到多重PCR产物依次经过纯化、回收、定量后构建Illumina文库，将得到的Illumina文库进行二代测序，得到的测序结果与构建的分型网站进行比对，得到样本的MLST基因型。所述分型网站的网址为(https://org.modao.cc/app/1e054fdb5b9e2ae41066584112a19cc56a44f707？simulator_type＝device&sticky)。
本发明还提供了所述引物组在制备结核分枝杆菌的MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。本发明对所述结核分枝杆菌的MLST分型或溯源的方法没有特殊限制，采用所述试剂盒的检测方法即可，在此不做赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组及结核分枝杆菌MLST分型的二代测序建库方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
靶标基因的确定
1.结核分枝杆菌溯源株信息获取
从NCBI的SRA数据库，下载已经发表的结核分枝杆菌的原始数据。每个地区选择一套illumina数据，排除覆盖度低和匹配比例少的原始数据，最后一共选择了25株结核分枝杆菌的原始数据用于分析，样品菌株共来自于4个洲，16个国家，样品菌株的具体地点和SRA号见表1。
表1.原始数据基本信息记录
Figure BDA0002849425550000081
Figure BDA0002849425550000091
2.SNP位点比对
把下载的fastq文件上传到服务器，每个国家的结核分枝杆菌数据与H37Rv的genome文件(NC_000962.fna)通过软件bowtie2进行比对，再通过samtools、bcftools等抽提出所有的SNP位点。然后按照每个SNP位点必须有10条以上的序列支持，并且SNP的比率为100％的标准，筛选得到每个样本最终的SNPs结果。平均每个样本得到1189个SNP位点。
3结核分枝杆菌系统发育树构建
将每个样本的SNP串联并使用mega5软件构建系统发育树，得到25个样品的全基因组的系统发育树(NJ)，具体见图1。
从结果来看，所有样本分成两枝，其中以来自中国的样本为主的东亚分枝中，还包含了爱沙尼亚，白俄罗斯、哈萨克斯坦和挪威等欧洲样本；而以非洲样本为主的另外一枝中，则包含一株中国、一株泰国，以及来自于美洲的美国、阿根廷等国家的样本。
通过对全基因组SNP的比较分析，即统计每个基因中发生SNP的数目，按SNP数量从高到低排列，确定了30个具有SNP位点较高的基因片段，仔细对比每个基因发现，虽然有些基因发生SNP的频率很高，但25个样品在这些基因中发生的SNP变化是一致的，所以使用高频SNP的基因并不能很好得区分不同地区的样本。因此，重新对SNP位点做了筛选，最后确定选择在同一个位点，有多种不同SNP形式的位点，表2中列举了9个核心位点，分布于7个基因中。将这7个基因进行串联，使用mega5软件得到25个样品的MLST基因的系统发育树(NJ)，具体见图2。可以看出，这7个基因能够把25个样本都区分开。
最终的MLST基因和位点见表2。
表2选择核心位点的SNP分布
Figure BDA0002849425550000101
实施例2
1.检测材料
结核分枝杆菌JH-1菌株、Jh-50菌株、JH-20菌株，其中JH-1菌株、JH-20菌株、Jh-50菌株来源于口岸检出菌，分离自口岸实验室，分离时间分别是2017，2018和2019年；
结核分枝杆菌阳性参比质粒为Pos-mt，是以结核分枝杆菌H37Rv菌株7个基因序列连接到Puc质粒上而成。
2.基于二代测序的试剂盒
引物：实施例1记载的引物组、阳性质粒，PCR mix，水。
3.分型基因
表3结核分枝杆菌分型管家基因
Figure BDA0002849425550000111
4.二代测序分型引物
结核分枝杆菌MLST分型管家基因的扩增(测序)引物序列见表4。
表4 7个管家基因的扩增(测序)引物
Figure BDA0002849425550000112
Figure BDA0002849425550000121
4.验证方法
4.1核酸提取
取收集的菌体，悬于400μL TE溶液中灭活后，加入5mg/ml溶菌酶，37℃孵育2h，然后加入2mg/ml蛋白酶K及1％SDS，50℃过夜，加入14μL冷5M醋酸钾溶液，慢慢混匀后置于冰上10min，离心，上清以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合，反复抽提，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，离心取上清，加3M NaCl溶液和2倍体积无水乙醇或异丙醇沉淀酸，离心。沉淀以70％乙醇和无水乙醇洗涤，室温干燥，溶于TE中，加1mg/ml RNase A，37℃孵育30min。
4.2基于二代测序的结核分枝杆菌MLST分型
4.2.1多重PCR扩增
多重PCR扩增的反应体系为20μL：5×PCR缓冲液4μL、dNTP(10mmol/L)2μL、多重引物对(10μmol/L)0.4μL、GXL聚合酶(1.25U/μL)0.2μL、模板DNA 0.5μL、水13.5μL。多重PCR扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。
将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化(见图3)。
4.2.2PCR产物纯化
PCR产物按照体积比1:0.8加入已震荡混匀的AMPure beads，吹打混匀后室温静置5min，然后放入磁力架内约5min后溶液澄清，吸去上清后加入200μL 80％乙醇溶液，静置1min后吸出乙醇，重复一次乙醇漂洗的步骤，在乙醇漂洗的过程中不要从磁力架上取下管子，第二次需要完全去除残留的乙醇并且静置5min待残留乙醇完全挥发后再取下磁力架加入12μL水，吹打混匀静置5min后放回磁力架上，静置2min溶液澄清后吸取10μL上清，即回收的DNA。
4.2.3回收片段定量
先制作标准曲线：取199μL的buffer加入1μL染料，混匀后取出10μL再加入10μL的S1混匀，标记为S1；取199μL的buffer加入1μL染料，混匀后取出10μL再加入10μL的S2混匀，标记为S2，S1和S2避光静置5min使染料充分结合DNA，在Qubit仪器上选择高敏感的双链DNA中的制作标准曲线，先后放入S1和S2，读数后标准曲线即制作完成。
然后制作待测样本：取199μL的buffer加入1μl染料，混匀后取出1μL再加入1μL的样本混匀，避光静置5min使染料充分结合DNA，在Qubit仪器上选择样本定量，放入样本后，选择样本为1μL，读数既得样本浓度。
4.2.4Illumina文库构建
回收的DNA片段通过Qubit定量后用水定容至50μL，加入15μL的End Prep Mix4，吹打混匀后按照下述反应条件反应进行末端补平和加dA尾：20℃15min，65℃15min。补平完成后直接加入25μL的Rapid Ligation buffer2，5μL的Rapid DNA ligase，5μL的接头吹打混匀后按照下述反应条件反应进行连接：20℃，15min。连接产物加入60μL已震荡混匀的AMPure beads，吹打混匀后室温静置5min，然后放入磁力架内约5min后溶液澄清，吸去上清后加入200μL 80％乙醇溶液，静置1min后吸出乙醇，重复一次乙醇漂洗的步骤，在乙醇漂洗的过程中不要从磁力架上取下管子，第二次需要完全去除残留的乙醇并且静置5min待残留乙醇完全挥发后再取下磁力架加入22.5μL水，吹打混匀静置5min后放回磁力架上，静置2min溶液澄清后吸取20μL上清后进行文库扩增。其中文库扩增的反应体系体积为50μL：所述引物组5μL、VAHTS HiFi Amplification Mix 25μL、模板DNA 20μL。文库扩增的反应条件为：95℃3min；98℃20sec，60℃15sec，72℃30min，8个循环；72℃5min。
PCR产物加入45μL已震荡混匀的AMPure beads，吹打混匀后室温静置5min，然后放入磁力架内约5min后溶液澄清，吸去上清后加入200μL 80％乙醇，静置1min后吸出乙醇，重复一次乙醇漂洗的步骤，在乙醇漂洗的过程中不要从磁力架上取下管子，第二次需要完全去除残留的乙醇并且静置5min待残留乙醇完全挥发后再取下磁力架加入22.5μL水，吹打混匀静置5min后放回磁力架上，静置2min溶液澄清后吸取20μL上清后得到文库。
4.2.5DNA序列测定
文库通过Qubit定量后，根据产物大小加上接头130bp，确定文库大小约为550bp，将文库稀释到2nM的DNA体系，取10μL加入10μL的0.2N NaOH，5min变性后加入980μL HT1稀释至20pmol/μl的DNA，取600μL加入400μL的HT1，得到上样浓度为12pmol/μl的上样DNA，加入测序kit的样本孔内，按照Miseq测序仪操作上机测序。
4.2.6序列测定及分析
获得的序列结果参照委托单位提供的分型库进行比较，确定分型。
5.重复性及稳定性验证
上述同样实验重复三次，都可以实现检测。
试剂盒冻融三次，每次放置在室温24h后用于检测，可以顺利完成检测。
6.验证结果
将测序结果上传到网站(https://org.modao.cc/app/1e054fdb5b9e2ae41066584112a19cc56a44f707？simulator_type＝device&sticky)后，比对结果见表5，所有样本都可以得到唯一的基因型及总的菌株ST型。
表5测序后比对结果
Figure BDA0002849425550000141
结果表明，分离株JH-1来自中国，JH-20来自南非，Jh-50来自美国。
JH-1菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ ID No：15，rpoB基因扩增片段为SEQ ID No：16，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：17，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：18，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：19，leuB基因扩增片段为SEQ ID No：20，embB基因扩增片段为SEQ IDNo：21。
Pos-mt菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ ID No：22，rpoB基因扩增片段为SEQ IDNo：23，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：24，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：25，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：26，leuB基因扩增片段为SEQ ID No：27，embB基因扩增片段为SEQID No：28。
JH-20-1菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ ID No：29，rpoB基因扩增片段为SEQ IDNo：30，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：31，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：32，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：33，leuB基因扩增片段为SEQ ID No：34，embB基因扩增片段为SEQID No：35。
JH-50-1菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ ID No：36，rpoB基因扩增片段为SEQ IDNo：37，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：38，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：39，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：40，leuB基因扩增片段为SEQ ID No：41，embB基因扩增片段为SEQID No：42。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海国际旅行卫生保健中心（上海海关口岸门诊部）
<120> 一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组及建库方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acatccagca ggagatgcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtagcaccgt cggctcttg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgagctgat ccaaaaccag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgatctcg tcgctaacca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgcaaggtt cgacatcac 19
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccacaaccgc gcctaca 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatgagccgg tcactactcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcctcgttaa gctcctcctc 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtgcgacca acggctg 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgggagctgg atgcattgg 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcgatattc ccactggccg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcaccacat caacctgcgt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgatattcgg cttcctgctc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accgctcgat cagcacatag 20

Claims (9)

1.一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的引物组，其特征在于，包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物；
所述gyrA基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的反向引物；
所述rpoB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的反向引物；
所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：6所示的反向引物；
所述Rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：8所示的反向引物；
所述mbtF基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：10所示的反向引物；
所述leuB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：12所示的反向引物；
所述embB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID No：13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No：14所示的反向引物。
2.一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌MLST分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂：多重PCR扩增用缓冲液、dNTP和GXL聚合酶。
4.权利要求1所述引物组在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。
5.一种结核分枝杆菌MLST分型的二代测序建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待分型的结核分枝杆菌菌株的DNA；
2）以提取的DNA为模板，用权利要求1所述引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR产物；
3）将所述多重PCR产物纯化、回收、定量后构建Illumina文库。
6.根据权利要求5所述二代测序建库方法，其特征在于，步骤2）中多重PCR扩增的反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，58 ℃ 40 sec，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min；
步骤2）中多重PCR扩增的反应体系为20 μL：5×PCR缓冲液4 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L多重引物对0.4 μL、1.25 U/μL GXL聚合酶0.2 μL、模板DNA 0.5 μL、ddH2O13.5 μL。
7.根据权利要求5或6所述二代测序建库方法，其特征在于，步骤3）中构建Illumina文库的方法是将定量后的多重PCR产物依次末端补平和加dA尾，连接接头，分离连接产物和文库扩增。
8.根据权利要求7所述二代测序建库方法，其特征在于，所述末端补平和加dA尾的反应条件为20℃，15min；65℃，15min；
所述末端补平和加dA尾的反应体系为10ng /μL浓度的PCR产物10μL、15 μL End PrepMix4，用ddH2O补至50 μL。
9.根据权利要求7所述二代测序建库方法，其特征在于，所述文库扩增的反应体系为50μL：权利要求1所述引物组 5 μL、VAHTS HiFi Amplification Mix 25 μL、模板DNA 20 μL；
所述文库扩增的反应条件为：95 ℃ 3 min；98 ℃ 20 sec，60 ℃ 15 sec，72 ℃ 30min，8个循环；72 ℃ 5 min。
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