CN112481402B - 一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用 - Google Patents
一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112481402B CN112481402B CN202011597558.4A CN202011597558A CN112481402B CN 112481402 B CN112481402 B CN 112481402B CN 202011597558 A CN202011597558 A CN 202011597558A CN 112481402 B CN112481402 B CN 112481402B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- primer
- nucleotide sequence
- mycobacterium tuberculosis
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 56
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 21
- 101150081455 PKS5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101150062801 embB gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 49
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 42
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150043611 Rv2295 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 39
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108700043532 RpoB Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150110188 30 gene Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001636356 Irania Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- 108700035964 Mycobacterium tuberculosis HsaD Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFMNTAVTSIJODG-UHFFFAOYSA-N [N+](=O)([O-])C1=CC(=CC=2C(N=C(SC=21)N1CCC(CC1)CN1CCC(CC1)C(F)(F)F)=O)C(F)(F)F Chemical compound [N+](=O)([O-])C1=CC(=CC=2C(N=C(SC=21)N1CCC(CC1)CN1CCC(CC1)C(F)(F)F)=O)C(F)(F)F UFMNTAVTSIJODG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 208000015355 drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用，属于微生物基因分型技术领域。本发明以gyrA基因片段、rpoB基因片段、pks5基因片段、Rv2295基因片段、mbtF基因片段、leuB基因片段和embB基因片段串联构建MLST基因的系统发育树，能把25个不同来源的结核分枝杆菌样本全部区分开；同时采用上述各基因的引物对结核分枝杆菌样本进行PCR扩增，扩增的各基因片段通过与分型库比对，结果表明，所有检测样本均能够得到唯一的基因型和总的菌株ST型。说明该引物组达到对结核分枝杆菌准确分型的目的。因此，该引物组能够用于结核分枝杆菌MLST分型与溯源中。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因分型技术领域，具体涉及一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)引起的一种传染病，具有发病人数多，传染性强的特点。目前国家已经出台多项政策积极开展对结核病的控制，其中包括对某些结核病治疗药物的免费发放等。但因为耐药结核病的存在，尤其是耐多药结核菌株的存在，致使疾病的控制与药物的治疗变得更为复杂。
从基因水平上对结核分枝杆菌进行分析和了解，通过分子流行病学手段对结核分枝杆菌进行分型，有助于对结核分枝杆菌进行溯源研究，对于不同地域的结核分枝杆菌耐药性进行总结和评价，指导用药。
目前用于分子分型研究的主要方法是限制性片段长度多态性(RFLP)、多位点可变数目重复单元分析(VNTR)、细菌多位点序列分型(MLST)等，其中MLST是针对7～11个保守的持家基因进行分析，可以从保守基因上代表基因组的变异，尤其是对结核分枝杆菌这种基因组上变异位点较少的菌株。然而目前还没有有效的针对结核分枝杆菌的MLST分型检测用引物组。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用，能够有效区分结核分枝杆菌MLST不同基因型。
本发明提供了一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组，包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物；
所述gyrA基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
所述rpoB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物；
所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物；
所述Rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物；
所述mbtF基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的反向引物；
所述leuB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的反向引物；
所述embB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的反向引物。
本发明提供了所述引物组在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。
优选的，所述结核分枝杆菌MLST分型或溯源的方法，包括以下步骤：
1)提取待分型的菌体DNA；
2)以菌体的DNA为模板，用所述引物组中7对引物分别进行PCR扩增，得到7种PCR扩增产物；
3)将所述7种PCR扩增产物分别纯化后进行Sanger测序，得到7个基因片段的测序结果；
4)将所述7个基因片段的测序结果与分型库进行比较，确定结核分枝杆菌MLST基因型。
优选的，所述PCR扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。
本发明提供了一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用试剂盒，包括所述引物组。
优选的，还包括以下试剂：PCR扩增用缓冲液、dNTP和GXL聚合酶。
本发明提供的基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组，包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物。实验表明，本发明以gyrA基因片段、rpoB基因片段、pks5基因片段、Rv2295基因片段、mbtF基因片段、leuB基因片段和embB基因片段串联构建MLST基因的系统发育树(NJ)，能够把25个不同来源的结核分枝杆菌样本全部区分开；同时采用所述引物组对未知基因型的结核分枝杆菌进行PCR扩增，得到的各基因片段通过与建好的分型库进行比对，结果表明，所有检测样本均能够得到唯一的基因型和总的菌株ST型。说明本发明提供的所述引物组能够准确实现结核分枝杆菌MLST分型的目的。因此，所述引物组能够用于结核分枝杆菌MLST分型与溯源中。
附图说明
图1为25个样本全基因组构建的系统发育树；
图2为用最终选择的7个基因MLST构建系统发育树；
图3为待检测样本的各基因PCR扩增电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组，包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物；所述gyrA基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；所述rpoB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示的反向引物；所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物；所述Rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物；所述mbtF基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示的反向引物；所述leuB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的反向引物；所述embB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的反向引物。本发明对所述引物组的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的引物组的制备方法即可，例如人工合成。在本发明实施例中，所述引物组委托金唯智生物科技有限公司合成得到。
本发明提供了所述引物组在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。
在本发明中，所述试剂包括所述引物组中14条引物序列，所述14条引物序列优选独立分装。本发明对所述引物的形式不做具体限定，采用本领域所熟知的商品试剂的引物形式即可，例如以粉末形式存在更利于保存和运输。所述试剂盒包括含所述引物组形成的试剂外，还包括其他用于检测的试剂，例如PCR扩增用缓冲液、dNTP和GXL聚合酶等。本发明对所述试剂的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的试剂种类即可。
在本发明中，所述结核分枝杆菌MLST分型或溯源的方法，优选包括以下步骤：1)提取待分型的菌体DNA；
2)以菌体的DNA为模板，用所述引物组中7对引物分别PCR扩增，得到7种PCR扩增产物；
3)将所述7种PCR扩增产物分别纯化后进行Sanger测序，得到7个基因片段的测序结果；
4)将所述7个基因片段的测序结果与分型库进行比较，确定结核分枝杆菌MLST基因型。
本发明提取待分型的菌体DNA。本发明对提取待分型的结核分枝杆菌菌株的DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取细菌的DNA方法即可，例如CTAB法或采用商品化细菌DNA提取试剂盒均可。
得到菌体的DNA后，本发明以菌体的DNA为模板，用所述引物组中7对引物分别PCR扩增，得到7种PCR扩增产物。
在本发明中，所述PCR扩增的反应条件优选为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。
得到7种PCR扩增产物后，本发明将所述7种PCR扩增产物分别纯化后进行Sanger测序，得到7个基因片段的测序结果。
在本发明中，所述PCR产物纯化采用DNA纯化试剂盒即可，具体操作方法按照说明书进行，在此不做赘述。本发明对所述DNA纯化试剂盒的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的DNA纯化试剂盒即可。纯化后还优选包括回收。本发明对回收不做具体限定，采用本领域所熟知的回收方案即可，例如采用商品DNA回收试剂盒即可。本发明对所述Sanger测序的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的Sanger测序即可。在本发明实施例中，所述Sanger测序委托金维智生物科技有限公司进行。测序结果与构建的分型库进行比对，得到样本的MLST基因型。所述分型库的网址为(https://org.modao.cc/app/1e054fdb5b9e2ae41066584112a19cc56a44f707？simulator_type＝device&sticky)。比对
结果表明，所有样本都可以得到唯一的基因型及总的菌株ST型。
本发明提供了一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒优选还包括以下试剂：PCR扩增用缓冲液、dNTP和GXL聚合酶。本发明对所述试剂盒的使用方法没有特殊限制作用，具体方法可参见上述内容即可，在此不做赘述。
下面结合实施例对本发明提供的基于Sanger测序结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
靶标基因的确定
1.结核分枝杆菌溯源株信息获取
从NCBI的SRA数据库，下载已经发表的结核分枝杆菌的原始数据。每个地区选择一套illumina数据，排除覆盖度低和匹配比例少的原始数据，最后一共选择了25株结核分枝杆菌的原始数据用于分析，样品菌株共来自于4个洲，16个国家，样品菌株的具体地点和SRA号见表1。
表1.原始数据基本信息记录
2.SNP位点比对
把下载的fastq文件上传到服务器，每个国家的结核分枝杆菌数据与H37Rv的genome文件(NC_000962.fna)通过软件bowtie2进行比对，再通过samtools、bcftools等抽提出所有的SNP位点。然后按照每个SNP位点必须有10条以上的序列支持，并且SNP的比率为100％的标准，筛选得到每个样本最终的SNPs结果。平均每个样本得到1189个SNP位点。
3结核分枝杆菌系统发育树构建
将每个样本的SNP串联并使用mega5软件构建系统发育树，得到25个样品的全基因组的系统发育树(NJ)，具体见图1。
从结果来看，所有样本分成两枝，其中以来自中国的样本为主的东亚分枝中，还包含了爱沙尼亚，白俄罗斯、哈萨克斯坦和挪威等样本；而以非洲样本为主的另外一枝中，则包含一株中国、一株泰国，以及来自于美洲的美国、阿根廷等国家的样本。
通过对全基因组SNP的比较分析，即统计每个基因中发生SNP的数目，按SNP数量从高到低排列，确定了30个具有SNP位点较高的基因片段，仔细对比每个基因发现，虽然有些基因发生SNP的频率很高，但25个样品在这些基因中发生的SNP变化是一致的，所以使用高频SNP的基因并不能很好得区分不同地区的样本。因此，重新对SNP位点做了筛选，最后确定选择在同一个位点，有多种不同SNP形式的位点，表2中列举了9个核心位点，分布于7个基因中。将这7个基因进行串联，使用mega5软件得到25个样品的MLST基因的系统发育树(NJ)，具体见图2。可以看出，这7个基因能够把25个样本都区分开。
最终的MLST基因和位点见表2。
表2选择核心位点的SNP分布
实施例2
1.检测材料
结核分枝杆菌JH-1菌株、JH-20菌株、Jh-50菌株，其中JH-1菌株、JH-20菌株、Jh-50菌株来源于口岸检出菌，分离自口岸实验室，分离时间分别是2017年，2018年和2017年；
结核分枝杆菌阳性参比质粒为Pos-mt，是以结核分枝杆菌H37Rv菌株7个基因序列连接到Puc质粒上而成。
2.基于二代测序的试剂盒
引物：表4记载的引物组、阳性质粒，PCR mix，水。
3.分型基因
表3结核分枝杆菌分型管家基因
4.Sanger测序分型引物
结核分枝杆菌MLST分型管家基因的扩增(测序)引物序列见表4。
表4Sanger测序的7个管家基因的扩增(测序)引物
4.验证方法
4.1核酸提取
取收集的菌体，悬于400μL TE溶液中灭活后，加入5mg/ml溶菌酶，37℃孵育2h，然后加入2mg/ml蛋白酶K及1％SDS，50℃过夜，加入14μL冷5M醋酸钾溶液，慢慢混匀后置于冰上10min，离心，上清以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合，反复抽提，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，V/V)混匀，离心取上清，加3MNaCl溶液和2倍体积无水乙醇或异丙醇沉淀酸，离心。沉淀以70％乙醇和无水乙醇洗涤，室温干燥，溶于TE中，加1mg/mlRNaseA，37℃孵育30min。
4.2基于Sanger测序的分型方法
4.2.1PCR扩增
反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。
4.2.2产物纯化
将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化。PCR产物按照1:0.8加入已震荡混匀的AMPure beads，吹打混匀后室温静置5min，然后放入磁力架内约5min后溶液澄清，吸去上清后加入200ul 80％乙醇，静置1min后吸出乙醇，重复一次乙醇漂洗的步骤，在乙醇漂洗的过程中不要从磁力架上取下管子，第二次需要完全去除残留的乙醇并且静置5min待残留乙醇完全挥发后再取下磁力架加入12μL水，吹打混匀静置5min后放回磁力架上，静置2min溶液澄清后吸取10μL上清，即回收的DNA。
4.2.3测序及结果分析
回收的DNA送测序公司进行测序，结果参照委托单位提供的分型库(网址https://org.modao.cc/app/1e054fdb5b9e2ae41066584112a19cc56a44f707？simulator_type＝device&sticky))进行比较，确定分型。
5.重复性及稳定性验证
上述同样实验重复三次，都可以实现检测。
试剂盒冻融三次，每次放置在室温24h后用于检测，可以顺利完成检测。
6.验证结果
PCR扩增电泳结果见图3。JH-1菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ ID No：15，rpoB基因扩增片段为SEQ ID No：16，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：17，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：18，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：19，leuB基因扩增片段为SEQ ID No：20，embB基因扩增片段为SEQ ID No：21。Pos-mt菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ ID No：22，rpoB基因扩增片段为SEQ ID No：23，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：24，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：25，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：26，leuB基因扩增片段为SEQ IDNo：27，embB基因扩增片段为SEQ ID No：28。JH-20-1菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ IDNo：29，rpoB基因扩增片段为SEQ ID No：30，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：31，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：32，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：33，leuB基因扩增片段为SEQID No：34，embB基因扩增片段为SEQ ID No：35。JH-50-1菌株中gyrA基因扩增片段为SEQ IDNo：36，rpoB基因扩增片段为SEQ ID No：37，pks5基因扩增片段为SEQ ID No：38，Rv2295基因扩增片段为SEQ ID No：39，mbtF基因扩增片段为SEQ ID No：40，leuB基因扩增片段为SEQID No：41，embB基因扩增片段为SEQ ID No：42。
为了验证本发明扩增的片段与其他检测手段的检测结果一致性，将4个菌株的各基因片段与二代测序结果(二代测序MLST分型用引物组见表5)比对，并剪切成与二代序列的长度和位置一致的片段，将裁减后的片段上传到分型库后,比对结果如下表6。所有样本都可以得到唯一的基因型及总的菌株ST型。溯源结果表明，分离株JH-1来自中国，JH-20来自南非，Jh-50来自缅甸。
表5二代测序的7个管家基因的扩增(测序)引物
表6测序后比对结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部)
<120> 一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagctttatc acccgcaacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatattggt tgccatgccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaccgacga catcgaccac 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtccatgta gtccacctca g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggattctggg ctctggtgag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagacctac cagccacctc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtcacgtc ttcgggattg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actgccatct gcgatacacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggcgtggtg tcaatcatgt 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcagttggg cggatggtc 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcaataacg ccaccgaca 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctggatcac cacatcaacc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgatattcgg cttcctgctc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accgctcgat cagcacatag 20
<210> 15
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagctttatc acccgcaacg ccaaggatgt tcggttcctg gatgtctaac gcaaccctgc 60
gttcgattgc aaacgaggaa tagatgacag acacgacgtt gccgcctgac gactcgctcg 120
accggatcga accggttgac atccagcagg agatgcagcg cagctacatc gactatgcga 180
tgagcgtgat cgtcggccgc gcgctgccgg aggtgcgcga cgggctcaag cccgtgcatc 240
gccgggtgct ctatgcaatg ttcgattccg gcttccgccc ggaccgcagc cacgccaagt 300
cggcccggtc ggttgccgag accatgggca actaccaccc gcacggcgac gcgtcgatct 360
acgacaccct ggtgcgcatg gcccagccct ggtcgctgcg ctacccgctg gtggacggcc 420
agggcaactt cggctcgcca ggcaatgacc caccggcggc gatgaggtac accgaagccc 480
ggctgacccc gttggcgatg gagatgctga gggaaatcga cgaggagaca gtcgatttca 540
tccctaacta cgacggccgg gtgcaagagc cgacggtgct acccagccgg ttccccaacc 600
tgctggccaa cgggtcaggc ggcatcgcgg tcggcatggc aaccaatatc c 651
<210> 16
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaccgacga catcgaccac ttcggcaacc gccgcctgcg tacggtcggc gagctgatcc 60
aaaaccagat ccgggtcggc atgtcgcgga tggagcgggt ggtccgggag cggatgacca 120
cccaggacgt ggaggcgatc acaccgcaga cgttgatcaa catccggccg gtggtcgccg 180
cgatcaagga gttcttcggc accagccagc tgagccaatt catggaccag aacaacccgc 240
tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt cggcgctggg gcccggcggt ctgtcacgtg 300
agcgtgccgg gctggaggtc cgcgacgtgc acccgtcgca ctacggccgg atgtgcccga 360
tcgaaacccc tgaggggccc aacatcggtc tgatcggctc gctgtcggtg tacgcgcggg 420
tcaacccgtt cgggttcatc gaaacgccgt accgcaaggt ggtcgacggc gtggttagcg 480
acgagatcgt gtacctgacc gccgacgagg aggaccgcca cgtggtggca caggccaatt 540
cgccgatcga tgcggacggt cgcttcgtcg agccgcgcgt gctggtccgc cgcaaggcgg 600
gcgaggtgga gtacgtgccc tcgtctgagg tggactacat ggacg 645
<210> 17
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggattctggg ctctggtgag gttgcggacg aatgccgcga ccgtgttgat ctgttcgtcc 60
gagtccgggc cgtaggcgac gccggtcaga cctgccgact cgacgaactc gatcaggttg 120
ggcggcactg ccatatgaac tgcgtggcct cgccgccgca gctccacgcc aaccgcggcg 180
caaggttcga catcaccgcg ggttccgtgg accgccaaga caaacttcat cagcgccttc 240
ccgcgttcga cgtcaggcgg gtgccggcgc gtccctgtcg gccgccaact tgtcgcacat 300
cagatccgcc aggccacgaa cggtggtgtt gatttcggtg gcggaaatgc ggatcccggt 360
ttcggcttcg acccgcgcac gcagttcctg gctgctccgt gagtccaggc cgtactcgct 420
gagcagccgg tcggtgtcga tggtgcggcg taggattagg ccgacctgct tggagagtag 480
ccgccgcagc cggtctggcc attcctcgcg gggcaggtcc accagctcgg caaggaattt 540
gcttgtgcct gaacggtttt gccccaggga ttggaacttc tccgcgaatg ggctgtgctg 600
ggcgaaggct gtcagccagg gtgatccgat caccggggcg tagccgctgt aggcgcggtt 660
gtggcgcagc agggtctcga aggcgtaggc gccttcctcg ggggcgatgg cgtcgccggt 720
ttgttcggca aaggcgatcg cgcggccgat ctggccccag gcgccccagg cgatggaggt 780
ggctggtagg tcttg 795
<210> 18
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggtcacgtc ttcgggattg gcggtgccgg gcatgtgcgc atcaacttcg cgacctcccg 60
agccattctc atcgaggcgg tatcgcggat gagccggtca ctactcgagc gccggtagcg 120
cgtccagaga accgctagcg ccaacacgat cacctcgggt gacggtcttg tccgctcggc 180
ggcccttcag tgcccagcca atgcggccga ccccgcggcg gccgcattcg gtagacaaag 240
gaagtctgac accgtaggcg cctcgttgat cgcgttttcg ccgagaaacg tgaaggccgt 300
ttgcccgccc gtgcggatca gctacgatca aggcggccac atggaccagt cggccaacca 360
tgcgtgtctg cccaccccgc tggcgagcac aacagggcgc gggcaagatc atgagatgcc 420
tgtcgaagag acctccaccc cccagaagct gccccaattt cgttatcacc ccgatcccgt 480
cggcaccggc tcgatagtcg ccgacgaggt gagctgcgtg agctgcgagc aacgtcggcc 540
ctacacctac accggcccgg tgtatgcgga ggaggagctt aacgaggcca tctgtccttg 600
gtgtatcgca gatggcagt 619
<210> 19
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cggcgtggtg tcaatcatgt ccagaccgaa tcggtcgatc gcttcgacca gcgcccctgc 60
gtcccgctga cgatggtcgt cgacaatgtg caccgcgtgg ccgtcaagca gtgcgaccaa 120
cggctgccac gccgcgtcga aggtgaacga ccaggcatgc gcgattcgca gcgggcgccc 180
gagccgctgg gccgccggcc gcaacacgcg ctcgatgtgg tcgtcggcgt aggccgacag 240
cgcccgatgg gtgccgatga cacctttcgg ggtaccggtg gtgccggagg tgaaaatcac 300
gtaggccgcc tggtccaccg gcaccgtgat ggcacggtcg tcctcgagta tgtcagcgcc 360
aaccgaagcg gcgaacacgc cctcatcgat gaccaccgga gccgatgtct ggcgcaagat 420
ctcggcgaca cgctcaccgg gcatcgccgg gtccagcggc acgatcatgc cacccgcctt 480
gaggaccgcc agcatggcgg ccacgtagcg cggaccacgg gacagcgcga cggccaccgg 540
ggtctcgcga ctcacgtccg cgcggcgcag cccagtggcc agccggtcgg ccaatgcatc 600
cagctcccgg tacgtcagct gaccatccgc ccaactgac 639
<210> 20
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agcaataacg ccaccgacat gatcgccgcc gtcgggtcgg cgatgccctg accggcgatg 60
tccggcgcgc tgccatgcac cggctcgaac atcgacgggt tggcccgggt cgcgtcgata 120
ttcccactgg ccgccaagcc gataccgcca cataccgccg cggccagatc ggtgatgatg 180
tcgccgaaca ggttgtcggt gacgatcacg tcgaagcgac ccgggtcggt gatcatgtgg 240
atggtggcgg cgtcgacgtg ctggtaggcc acctcgacgt ccgggtagca ttcgccgacc 300
tcgtcgacgg tccgcaacca caatcccccg gcgaaggtca acacgttggt tttgtgcacc 360
aatgtcagat gcttgcgacg ccgtcgagcc cgctcgaacg cgtcggcaac cacacgccgc 420
acaccgaacg cggtgttcac gctgacttcg gtggccacct cgttgggcgt gccgacgcga 480
atcgccccgc cgttgccggt gtagggtccc tcggtgccct cgcgcaccac cacgaagtcg 540
atgccgggat tgccggacag cgggctggcc acccccggat acagccgggc cggacgcagg 600
ttgatgtggt gatccagc 618
<210> 21
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgatattcgg cttcctgctc tggcatgtca tcggcgcgaa ttcgtcggac gacggctaca 60
tcctgggcat ggcccgagtc gccgaccacg ccggctacat gtccaactat ttccgctggt 120
tcggcagccc ggaggatccc ttcggctggt attacaacct gctggcgctg atgacccatg 180
tcagcgacgc cagtctgtgg atgcgcctgc cagacctggc cgccgggcta gtgtgctggc 240
tgctgctgtc gcgtgaggtg ctgccccgcc tcgggccggc ggtggaggcc agcaaacccg 300
cctactgggc ggcggccatg gtcttgctga ccgcgtggat gccgttcaac aacggcctgc 360
ggccggaggg catcatcgcg ctcggctcgc tggtcaccta tgtgctgatc gagcggt 417
<210> 22
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagctttatc acccgcaacg ccaaggatgt tcggttcctg gatgtctaac gcaaccctgc 60
gttcgattgc aaacgaggaa tagatgacag acacgacgtt gccgcctgac gactcgctcg 120
accggatcga accggttgac atccagcagg agatgcagcg cagctacatc gactatgcga 180
tgagcgtgat cgtcggccgc gcgctgccgg aggtgcgcga cgggctcaag cccgtgcatc 240
gccgggtgct ctatgcaatg ttcgattccg gcttccgccc ggaccgcagc cacgccaagt 300
cggcccggtc ggttgccgag accatgggca actaccaccc gcacggcgac gcgtcgatct 360
acgacagcct ggtgcgcatg gcccagccct ggtcgctgcg ctacccgctg gtggacggcc 420
agggcaactt cggctcgcca ggcaatgacc caccggcggc gatgaggtac accgaagccc 480
ggctgacccc gttggcgatg gagatgctga gggaaatcga cgaggagaca gtcgatttca 540
tccctaacta cgacggccgg gtgcaagagc cgacggtgct acccagccgg ttccccaacc 600
tgctggccaa cgggtcaggc ggcatcgcgg tcggcatggc aaccaatatc c 651
<210> 23
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaaccgacga catcgaccac ttcggcaacc gccgcctgcg tacggtcggc gagctgatcc 60
aaaaccagat ccgggtcggc atgtcgcgga tggagcgggt ggtccgggag cggatgacca 120
cccaggacgt ggaggcgatc acaccgcaga cgttgatcaa catccggccg gtggtcgccg 180
cgatcaagga gttcttcggc accagccagc tgagccaatt catggaccag aacaacccgc 240
tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt cggcgctggg gcccggcggt ctgtcacgtg 300
agcgtgccgg gctggaggtc cgcgacgtgc acccgtcgca ctacggccgg atgtgcccga 360
tcgaaacccc tgaggggccc aacatcggtc tgatcggctc gctgtcggtg tacgcgcggg 420
tcaacccgtt cgggttcatc gaaacgccgt accgcaaggt ggtcgacggc gtggttagcg 480
acgagatcgt gtacctgacc gccgacgagg aggaccgcca cgtggtggca caggccaatt 540
cgccgatcga tgcggacggt cgcttcgtcg agccgcgcgt gctggtccgc cgcaaggcgg 600
gcgaggtgga gtacgtgccc tcgtctgagg tggactacat ggacg 645
<210> 24
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggattctggg ctctggtgag gttgcggacg aatgccgcga ccgtgttgat ctgttcgtcc 60
gagtccgggc cgtaggcgac gccggtcaga cctgccgact cgacgaactc gatcaggttg 120
ggcggcactg ccatatgaac tgcgtggcct cgccgccgca gctccacgcc aaccgcggcg 180
caaggttcga catcaccgcg ggttccgtgg accgccaaga caaacttcat cagcgccttc 240
ccgcgttcga cgtcaggcgg gtgccggcgc gtccctgtcg gccgccaact tgtcgcacat 300
cagatccgcc aggccacgaa cggtggtgtt gatttcggtg gcggaaatgc ggatcccggt 360
ttcggcttcc acccgcgcac gcagttcctg gctgctcagt gagtccaggc cgtactcgct 420
gagcagccgg tcggtgtcga tggtgcggcg taggattagg ccgacctgct tggagagtag 480
ccgccgcagc cggtctggcc attcctcgcg gggcaggtcc accagctcgg caaggaattt 540
gcttgtgcct gaacggtttt gccccaggga ttggaacttc tccgcgaatg ggctgtgctg 600
ggcgaaggct gtcagccagg gtgatccgat caccggggcg tagccgctgt aggcgcggtt 660
gtggcgcagc agggtctcga aggcgtaggc gccttcctcg ggggcgatgg cgtcgccggt 720
ttgttcggca aaggcgatcg cgcggccgat ctggccccag gcgccccagg cgatggaggt 780
ggctggtagg tcttg 795
<210> 25
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tggtcacgtc ttcgggattg gcggtgccgg gcatgtgcgc atcaacttcg cgacctcccg 60
agccattctc atcgaggcgg tatcgcggat gagccggtca ctactcgagc gccggtagcg 120
cgtccagaga accgctagcg ccaacacgat cacctcgggt gacggtcttg tccgctcggc 180
ggcccttcag tgcccagcca atgcggccga ccccgcggcg gccgcattcg gtagacaaag 240
gaagtctgac accgtaggcg cctcgttgat cgcgttttcg ccgagaaacg tgaaggccgt 300
ttgcccgccc gtgcggatca gctacgatca aggcgacaca tggaccagtc ggccaaccat 360
gcgtgtctgc ccaccccgct ggcgagcaca acagggcgcg ggcaagatca tgagatgcct 420
gtcgaagaga cctccacccc ccagaagctg ccccaatttc gttatcaccc cgatcccgtc 480
ggcaccggct cgatagtcgc cgacgaggtg agctgcgtga gctgcgagca acgtcggccc 540
tacacctaca ccggcccggt gtatgcggag gaggagctta acgaggccat ctgtccttgg 600
tgtatcgcag atggcagt 618
<210> 26
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cggcgtggtg tcaatcatgt ccagaccgaa tcggtcgatc gcttcgacca gcgcccctgc 60
gtcccgctga cgatggtcgt cgacaatgtg caccgcgtgg ccgtcaagca gtgcgaccaa 120
cggctgccac gccgcgtcga aggtgaacga ccaggcatgc gcgattcgca gcgggcgccc 180
gagccgctgg gccgccggcc gcaacacgcg ctcgatgtgg tcgtcggcgt aggccgacag 240
cgcccgatgg gtgccgatga cacctttcgg ggtaccggtg gtgccggagg tgaaaatcac 300
gtaggccgcc tggtccaccg gcaccgtgat ggcacggtcc tcctcgagta tgtcagcgcc 360
aaccgaagcg gcgaacacgc cctcatcgat gaccaccgga gccgatgtct ggcgcaagat 420
ctcggcgaca cgctcaccgg gcatcgccgg gtccagcggc acgatcatgc cacccgcctt 480
gaggaccgcc agcatggcgg ccacgtagcg cggaccacgg gacagcgcga cggccaccgg 540
ggtctcgcga ctcacgtccg cgcggcgcag cccagtggcc agccggtcgg ccaatgcatc 600
cagctcccgg tacgtcagct gaccatccgc ccaactgac 639
<210> 27
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agcaataacg ccaccgacat gatcgccgcc gtcgggtcgg cgatgccctg accggcgatg 60
tccggcgcgc tgccatgcac cggctcgaac atcgacgggt tggcccgggt cgcgtcgata 120
ttcccactgg ccgccaagcc gataccgcca cataccgccg cggccagatc ggtgatgatg 180
tcgccgaaca ggttgtcggt gacgatcacg tcgaagcgac ccgggtcggt gatcatgtgg 240
atggtggcgg cgtcgacgtg ctggtaggcc acctcgacgt ccgggtagca ttcgccgacc 300
tcgtcgacgg tccgcaacca caatcccccg gcgaaggtca acacgttcgt tttgtgcacc 360
aatgtcagat gcttgcgacg ccgtcgagcc cgctcgaacg cgtcggcaac cacacgccgc 420
acaccgaacg cggtgttcac gctgacttcg gtggccacct cgttgggcgt gccgacgcga 480
atcgccccgc cgttgccggt gtagggtccc tcggtgccct cgcgcaccac cacgaagtcg 540
atgccgggat tgccggacag cgggctggcc acccccggat acagccgggc cggacgcagg 600
ttgatgtggt gatccagc 618
<210> 28
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgatattcgg cttcctgctc tggcatgtca tcggcgcgaa ttcgtcggac gacggctaca 60
tcctgggcat ggcccgagtc gccgaccacg ccggctacat gtccaactat ttccgctggt 120
tcggcagccc ggaggatccc ttcggctggt attacaacct gctggcgctg atgacccatg 180
tcagcgacgc cagtctgtgg atgcgcctgc cagacctggc cgccgggcta gtgtgctggc 240
tgctgctgtc gcgtgaggtg ctgccccgcc tcgggccggc ggtggaggcc agcaaacccg 300
cctactgggc ggcggccatg gtcttgctga ccgcgtggat gccgttcaac aacggcctgc 360
ggccggaggg catcatcgcg ctcggctcgc tggtcaccta tgtgctgatc gagcggt 417
<210> 29
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cagctttatc acccgcaacg ccaaggatgt tcggttcctg gatgtctaac gcaaccctgc 60
gttcgattgc aaacgaggaa tagatgacag acacgacgtt gccgcctgac gactcgctcg 120
accggatcga accggttgac atccagcagg agatgcagcg cagctacatc gactatgcga 180
tgagcgtgat cgtcggccgc gcgctgccgg aggtgcgcga cgggctcaag cccgtgcatc 240
gccgggtgct ctatgcaatg ttcgattccg gcttccgccc ggaccgcagc cacgccaagt 300
cggcccggtc ggttgccgag accatgggca actaccaccc gcacggcgac gcgtcgatct 360
acgacaccct ggtgcgcatg gcccagccct ggtcgctgcg ctacccgctg gtggacggcc 420
agggcaactt cggctcgcca ggcaatgacc caccggcggc gatgaggtac accgaagccc 480
ggctgacccc gttggcgatg gagatgctga gggaaatcga cgaggagaca gtcgatttca 540
tccctaacta cgacggccgg gtgcaagagc cgacggtgct acccagccgg ttccccaacc 600
tgctggccaa cgggtcaggc ggcatcgcgg tcggcatggc aaccaatatc c 651
<210> 30
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaaccgacga catcgaccac ttcggcaacc gccgcctgcg tacggtcggc gagctgatcc 60
aaaaccagat ccgggtcggc atgtcgcgga tggagcgggt ggtccgggag cggatgacca 120
cccaggacgt ggaggcgatc acaccgcaga cgttgatcaa catccggccg gtggtcgccg 180
cgatcaagga gttcttcggc accagccagc tgagccaatt catggaccag aacaacccgc 240
tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt cggcgctggg gcccggcggt ctgtcacgtg 300
agcgtgccgg gctggaggtc cgcgacgtgc acccgtcgca ctacggccgg atgtgcccga 360
tcgaaacccc tgaggggccc aacatcggtc tgatcggctc gctgtcggtg tacgcgcggg 420
tcaacccgtt cgggttcatc gaaacgccgt accgcaaggt ggtcgacggc gtggttagcg 480
acgagatcgt gtacctgacc gccgacgagg aggaccgcca cgtggtggca caggccaatt 540
cgccgatcga tgcggacggt cgcttcgtcg agccgcgcgt gctggtccgc cgcaaggcgg 600
gcgaggtgga gtacgtgccc tcgtctgagg tggactacat ggacg 645
<210> 31
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggattctggg ctctggtgag gttgcggacg aatgccgcga ccgtgttgat ctgttcgtcc 60
gagtccgggc cgtaggcgac gccggtcaga cctgccgact cgacgaactc gatcaggttg 120
ggcggcactg ccatatgaac tgcgtggcct cgccgccgca gctccacgcc aaccgcggcg 180
caaggttcga catcaccgcg ggttccgtgg accgccaaga caaacttcat cagcgccttc 240
ccgcgttcga cgtcaggcgg gtgccggcgc gtccctgtcg gccgccaact tgtcgcacat 300
cagatccgcc aggccacgaa cggtggtgtt gatttcggtg gcggaaatgc ggatcccggt 360
ttcggcttcc acccgcgcac gcagttcctg gctgctccgt gagtccaggc cgtactcgct 420
gagcagccgg tcggtgtcga tggtgcggcg taggattagg ccgacctgct tggagagtag 480
ccgccgcagc cggtctggcc attcctcgcg gggcaggtcc accagctcgg caaggaattt 540
gcttgtgcct gaacggtttt gccccaggga ttggaacttc tccgcgaatg ggctgtgctg 600
ggcgaaggct gtcagccagg gtgatccgat caccggggcg tagccgctgt aggcgcggtt 660
gtggcgcagc agggtctcga aggcgtaggc gccttcctcg ggggcgatgg cgtcgccggt 720
ttgttcggca aaggcgatcg cgcggccgat ctggccccag gcgccccagg cgatggaggt 780
ggctggtagg tcttg 795
<210> 32
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tggtcacgtc ttcgggattg gcggtgccgg gcatgtgcgc atcaacttcg cgacctcccg 60
agccattctc atcgaggcgg tatcgcggat gagccggtca ctactcgagc gccggtagcg 120
cgtccagaga accgctagcg ccaacacgat cacctcgggt gacggtcttg tccgctcggc 180
ggcccttcag tgcccagcca atgcggccga ccccgcggcg gccgcattcg gtagacaaag 240
gaagtctgac accgtaggcg cctcgttgat cgcgttttcg ccgagaaacg tgaaggccgt 300
ttgcccgccc gtgcggatca gctacgatca aggcggccac atggaccagt cggccaacca 360
tgcgtgtctg cccaccccgc tggcgagcac aacagggcgc gggcaagatc atgagatgcc 420
tgtcgaagag acctccaccc cccagaagct gccccaattt cgttatcacc ccgatcccgt 480
cggcaccggc tcgatagtcg ccgacgaggt gagctgcgtg agctgcgagc aacgtcggcc 540
ctacacctac accggcccgg tgtatgcgga ggaggagctt aacgaggcca tctgtccttg 600
gtgtatcgca gatggcagt 619
<210> 33
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cggcgtggtg tcaatcatgt ccagaccgaa tcggtcgatc gcttcgacca gcgcccctgc 60
gtcccgctga cgatggtcgt cgacaatgtg caccgcgtgg ccgtcaagca gtgcgaccaa 120
cggctgccac gccgcgtcga aggtgaacga ccaggcatgc gcgattcgca gcgggcgccc 180
gagccgctgg gccgccggcc gcaacacgcg ctcgatgtgg tcgtcggcgt aggccgacag 240
cgcccgatgg gtgccgatga cacctttcgg ggtaccggtg gtgccggagg tgaaaatcac 300
gtaggccgcc tggtccaccg gcaccgtgat ggcacggtcg tcctcgagta tgtcagcgcc 360
aaccgaagcg gcgaacacgc cctcatcgat gaccaccgga gccgatgtct ggcgcaagat 420
ctcggcgaca cgctcaccgg gcatcgccgg gtccagcggc acgatcatgc cacccgcctt 480
gaggaccgcc agcatggcgg ccacgtagcg cggaccacgg gacagcgcga cggccaccgg 540
ggtctcgcga ctcacgtccg cgcggcgcag cccagtggcc agccggtcgg ccaatgcatc 600
cagctcccgg tacgtcagct gaccatccgc ccaactgac 639
<210> 34
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agcaataacg ccaccgacat gatcgccgcc gtcgggtcgg cgatgccctg accggcgatg 60
tccggcgcgc tgccatgcac cggctcgaac atcgacgggt tggcccgggt cgcgtcgata 120
ttcccactgg ccgccaagcc gataccgcca cataccgccg cggccagatc ggtgatgatg 180
tcgccgaaca ggttgtcggt gacgatcacg tcgaagcgac ccgggtcggt gatcatgtgg 240
atggtggcgg cgtcgacgtg ctggtaggcc acctcgacgt ccgggtagca ttcgccgacc 300
tcgtcgacgg tccgcaacca caatcccccg gcgaaggtca acacgttggt tttgtgcacc 360
aatgtcagat gcttgcgacg ccgtcgagcc cgctcgaacg cgtcggcaac cacacgccgc 420
acaccgaacg cggtgttcac gctgacttcg gtggccacct cgttgggcgt gccgacgcga 480
atcgccccgc cgttgccggt gtagggtccc tcggtgccct cgcgcaccac cacgaagtcg 540
atgccgggat tgccggacag cgggctggcc acccccggat acagccgggc cggacgcagg 600
ttgatgtggt gatccagc 618
<210> 35
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgatattcgg cttcctgctc tggcatgtca tcggcgcgaa ttcgtcggac gacggctaca 60
tcctgggcat ggcccgagtc gccgaccacg ccggctacat gtccaactat ttccgctggt 120
tcggcagccc ggaggatccc ttcggctggt attacaacct gctggcgctg atgacccatg 180
tcagcgacgc cagtctgtgg atgcgcctgc cagacctggc cgccgggcta gtgtgctggc 240
tgctgctgtc gcgtgaggtg ctgccccgcc tcgggccggc ggtggaggcc agcaaacccg 300
cctactgggc ggcggccatg gtcttgctga ccgcgtggat gccgttcaac aacggcctgc 360
ggccggaggg catcatcgcg ctcggctcgc tggtcaccta tgtgctgatc gagcggt 417
<210> 36
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cagctttatc acccgcaacg ccaaggatgt tcggttcctg gatgtctaac gcaaccctgc 60
gttcgattgc aaacgaggaa tagatgacag acacgacgtt gccgcctgac gactcgctcg 120
accggatcga accggttgac atcgagcagg agatgcagcg cagctacatc gactatgcga 180
tgagcgtgat cgtcggccgc gcgctgccgg aggtgcgcga cgggctcaag cccgtgcatc 240
gccgggtgct ctatgcaatg ttcgattccg gcttccgccc ggaccgcagc cacgccaagt 300
cggcccggtc ggttgccgag accatgggca actaccaccc gcacggcgac gcgtcgatct 360
acgacagcct ggtgcgcatg gcccagccct ggtcgctgcg ctacccgctg gtggacggcc 420
agggcaactt cggctcgcca ggcaatgacc caccggcggc gatgaggtac accgaagccc 480
ggctgacccc gttggcgatg gagatgctga gggaaatcga cgaggagaca gtcgatttca 540
tccctaacta cgacggccgg gtgcaagagc cgacggtgct acccagccgg ttccccaacc 600
tgctggccaa cgggtcaggc ggcatcgcgg tcggcatggc aaccaatatc c 651
<210> 37
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaaccgacga catcgaccac ttcggcaacc gccgcctgcg tacggtcggc gagctgatcc 60
aaaaccagat ccgggtcggc atgtcgcgga tggagcgggt ggtccgggag cggatgacca 120
cccaggacgt ggaggcgatc acaccgcaga cgttgatcaa catccggccg gtggtcgccg 180
cgatcaagga gttcttcggc accagccagc tgagccaatt catggaccag aacaacccgc 240
tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt cggcgctggg gcccggcggt ctgtcacgtg 300
agcgtgccgg gctggaggtc cgcgacgtgc acccgtcgca ctacggccgg atgtgcccga 360
tcgaaacccc tgaggggccc aacatcggtc tgatcggctc gctgtcggtg tacgcgcggg 420
tcaacccgtt cgggttcatc gaaacgccgt accgcaaggt ggtcgacggc gtggttagcg 480
acgagatcgt gtacctgacc gccgacgagg aggaccgcca cgtggtggca caggccaatt 540
cgccgatcga tgcggacggt cgcttcgtcg agccgcgcgt gctggtccgc cgcaaggcgg 600
gcgaggtgga gtacgtgccc tcgtctgagg tggactacat ggacg 645
<210> 38
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggattctggg ctctggtgag gttgcggacg aatgccgcga ccgtgttgat ctgttcgtcc 60
gagtccgggc cgtaggcgac gccggtcaga cctgccgact cgacgaactc gatcaggttg 120
ggcggcactg ccatatgaac tgcgtggcct cgccgccgca gctccacgcc aaccgcggcg 180
caaggttcga catcaccgcg ggttccgtgg accgccaaga caaacttcat cagcgccttc 240
ccgcgttcga cgtcaggcgg gtgccggcgc gtccctgtcg gccgccaact tgtcgcacat 300
cagatccgcc aggccacgaa cggtggtgtt gatttcggtg gcggaaatgc ggatcccggt 360
ttcggcttcc acccgcgcac gcagttcctg gctgctcagt gagtccaggc cgtactcgct 420
gagcagccgg tcggtgtcga tggtgcggcg taggattagg ccgacctgct tggagagtag 480
ccgccgcagc cggtctggcc attcctcgcg gggcaggtcc accagctcgg caaggaattt 540
gcttgtgcct gaacggtttt gccccaggga ttggaacttc tccgcgaatg ggctgtgctg 600
ggcgaaggct gtcagccagg gtgatccgat caccggggcg tagccgctgt aggcgcggtt 660
gtggcgcagc agggtctcga aggcgtaggc gccttcctcg ggggcgatgg cgtcgccggt 720
ttgttcggca aaggcgatcg cgcggccgat ctggccccag gcgccccagg cgatggaggt 780
ggctggtagg tcttg 795
<210> 39
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tggtcacgtc ttcgggattg gcggtgccgg gcatgtgcgc atcaacttcg cgacctcccg 60
agccattctc atcgaggcgg tatcgcggat gagccggtca ctactcgagc gccggtagcg 120
cgtccagaga accgctagcg ccaacacgat cacctcgggt gacggtcttg tccgctcggc 180
ggcccttcag tgcccagcca atgcggccga ccccgcggcg gccgcattcg gtagacaaag 240
gaagtctgac accgtaggcg cctcgttgat cgcgttttcg ccgagaaacg tgaaggccgt 300
ttgcccgccc gtgcggatca gctacgatca aggcggacac atggaccagt cggccaacca 360
tgcgtgtctg cccaccccgc tggcgagcac aacagggcgc gggcaagatc atgagatgcc 420
tgtcgaagag acctccaccc cccagaagct gccccaattt cgttatcacc ccgatcccgt 480
cggcaccggc tcgatagtcg ccgacgaggt gagctgcgtg agctgcgagc aacgtcggcc 540
ctacacctac accggcccgg tgtatgcgga ggaggagctt aacgaggcca tctgtccttg 600
gtgtatcgca gatggcagt 619
<210> 40
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cggcgtggtg tcaatcatgt ccagaccgaa tcggtcgatc gcttcgacca gcgcccctgc 60
gtcccgctga cgatggtcgt cgacaatgtg caccgcgtgg ccgtcaagca gtgcgaccaa 120
cggctgccac gccgcgtcga aggtgaacga ccaggcatgc gcgattcgca gcgggcgccc 180
gagccgctgg gccgccggcc gcaacacgcg ctcgatgtgg tcgtcggcgt aggccgacag 240
cgcccgatgg gtgccgatga cacctttcgg ggtaccggtg gtgccggagg tgaaaatcac 300
gtaggccgcc tggtccaccg gcaccgtgat ggcacggtcc tcctcgagta tgtcagcgcc 360
aaccgaagcg gcgaacacgc cctcatcgat gaccaccgga gccgatgtct ggcgcaagat 420
ctcggcgaca cgctcaccgg gcatcgccgg gtccagcggc acgatcatgc cacccgcctt 480
gaggaccgcc agcatggcgg ccacgtagcg cggaccacgg gacagcgcga cggccaccgg 540
ggtctcgcga ctcacgtccg cgcggcgcag cccagtggcc agccggtcgg ccaatgcatc 600
cagctcccgg tacgtcagct gaccatccgc ccaactgac 639
<210> 41
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agcaataacg ccaccgacat gatcgccgcc gtcgggtcgg cgatgccctg accggcgatg 60
tccggcgcgc tgccatgcac cggctcgaac atcgacgggt tggcccgggt cgcgtcgata 120
ttcccactgg ccgccaagcc gataccgcca cataccgccg cggccagatc ggtgatgatg 180
tcgccgaaca ggttgtcggt gacgatcacg tcgaagcgac ccgggtcggt gatcatgtgg 240
atggtggcgg cgtcgacgtg ctggtaggcc acctcgacgt ccgggtagca ttcgccgacc 300
tcgtcgacgg tccgcaacca caatcccccg gcgaaggtca acacgttcgt tttgtgcacc 360
aatgtcagat gcttgcgacg ccgtcgagcc cgctcgaacg cgtcggcaac cacacgccgc 420
acaccgaacg cggtgttcac gctgacttcg gtggccacct cgttgggcgt gccgacgcga 480
atcgccccgc cgttgccggt gtagggtccc tcggtgccct cgcgcaccac cacgaagtcg 540
atgccgggat tgccggacag cgggctggcc acccccggat acagccgggc cggacgcagg 600
ttgatgtggt gatccagc 618
<210> 42
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgatattcgg cttcctgctc tggcatgtca tcggcgcgaa ttcgtcggac gacggctaca 60
tcctgggcat ggcccgagtc gccgaccacg ccggctacat gtccaactat ttccgctggt 120
tcggcagccc ggaggatccc ttcggctggt attacaacct gctggcgctg atgacccatg 180
tcagcgacgc cagtctgtgg atgcgcctgc cagacctggc cgccgggcta gtgtgctggc 240
tgctgctgtc gcgtgaggtg ctgccccgcc tcgggccggc ggtggaggcc agcaaacccg 300
cctactgggc ggcggccatg gtcttgctga ccgcgtggat gccgttcaac aacggcctgc 360
ggccggaggg catcatcgcg ctcggctcgc tggtcaccta tgtgctgatc gagcggt 417
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acatccagca ggagatgcag 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gtagcaccgt cggctcttg 19
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcgagctgat ccaaaaccag 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cacgatctcg tcgctaacca 20
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gcgcaaggtt cgacatcac 19
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ccacaaccgc gcctaca 17
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gatgagccgg tcactactcg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gcctcgttaa gctcctcctc 20
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agtgcgacca acggctg 17
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cgggagctgg atgcattgg 19
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtcgatattc ccactggccg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
atcaccacat caacctgcgt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgatattcgg cttcctgctc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
accgctcgat cagcacatag 20
Claims (6)
1.一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组，其特征在于，包括gyrA基因扩增引物、rpoB基因扩增引物、pks5基因扩增引物、Rv2295基因扩增引物、mbtF基因扩增引物、leuB基因扩增引物和embB基因扩增引物；
所述gyrA基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
所述rpoB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物；
所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物；
所述Rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物；
所述mbtF基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的反向引物；
所述leuB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的反向引物；
所述embB基因扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的反向引物。
2.权利要求1所述引物组在制备结核分枝杆菌MLST分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌MLST分型或溯源的方法，包括以下步骤：
1)提取待分型的菌体DNA；
2)以菌体的DNA为模板，用权利要求1所述的引物组中7对引物分别进行PCR扩增，得到7种PCR扩增产物；
3)将所述7种PCR扩增产物分别纯化回收后进行Sanger测序，得到7个基因片段的测序结果；
4)将所述7个基因片段的测序结果与分型库进行比较，确定结核分枝杆菌MLST基因型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。
5.一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂：PCR扩增用缓冲液、dNTP和GXL聚合酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011597558.4A CN112481402B (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011597558.4A CN112481402B (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112481402A CN112481402A (zh) | 2021-03-12 |
| CN112481402B true CN112481402B (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=74915860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011597558.4A Active CN112481402B (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112481402B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112481399B (zh) * | 2020-12-21 | 2022-08-30 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌mlst分型的引物组及建库方法 |
| CN116356064A (zh) * | 2023-02-17 | 2023-06-30 | 首都医科大学附属北京世纪坛医院 | 一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101852694A (zh) * | 2010-04-09 | 2010-10-06 | 上海国际旅行卫生保健中心 | 用于能力验证活动中抗酸杆菌显微镜检查的痰涂片及其制备方法和用途 |
| CN102573896A (zh) * | 2009-05-13 | 2012-07-11 | 因波特医疗股份有限公司 | 结核分枝杆菌免疫优势抗原的组合物和方法 |
| WO2013175164A1 (en) * | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Discuva Limited | Characterization, classification and identification of microorganisms |
| EP3051450A1 (en) * | 2015-02-02 | 2016-08-03 | Applied Maths | Method of typing nucleic acid or amino acid sequences based on sequence analysis |
| CN108374042A (zh) * | 2012-05-09 | 2018-08-07 | 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 | 离子激流基因组测序 |
| CN109312409A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-02-05 | 金山大学,约翰内斯堡 | 耻垢分枝杆菌的遗传修饰株 |
| CN109468393A (zh) * | 2017-09-06 | 2019-03-15 | 上海新培晶医学检验所有限公司 | 检测MTB喹诺酮类药物耐药基因gyrA突变的试剂盒及其方法和用途 |
| CN111057783A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-04-24 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用 |
| CN111808978A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-10-23 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种用于副溶血弧菌mlst分型溯源的多重pcr引物组及其二代测序建库方法 |
| CN112481399A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-12 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌mlst分型的引物组及建库方法 |
-
2020
- 2020-12-29 CN CN202011597558.4A patent/CN112481402B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102573896A (zh) * | 2009-05-13 | 2012-07-11 | 因波特医疗股份有限公司 | 结核分枝杆菌免疫优势抗原的组合物和方法 |
| CN101852694A (zh) * | 2010-04-09 | 2010-10-06 | 上海国际旅行卫生保健中心 | 用于能力验证活动中抗酸杆菌显微镜检查的痰涂片及其制备方法和用途 |
| CN108374042A (zh) * | 2012-05-09 | 2018-08-07 | 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 | 离子激流基因组测序 |
| WO2013175164A1 (en) * | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Discuva Limited | Characterization, classification and identification of microorganisms |
| EP3051450A1 (en) * | 2015-02-02 | 2016-08-03 | Applied Maths | Method of typing nucleic acid or amino acid sequences based on sequence analysis |
| CN109312409A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-02-05 | 金山大学,约翰内斯堡 | 耻垢分枝杆菌的遗传修饰株 |
| CN109468393A (zh) * | 2017-09-06 | 2019-03-15 | 上海新培晶医学检验所有限公司 | 检测MTB喹诺酮类药物耐药基因gyrA突变的试剂盒及其方法和用途 |
| CN111057783A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-04-24 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用 |
| CN111808978A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-10-23 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种用于副溶血弧菌mlst分型溯源的多重pcr引物组及其二代测序建库方法 |
| CN112481399A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-12 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌mlst分型的引物组及建库方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 5种口岸重要媒介动物传播病原体微流控芯片检测方法的建立;周娴等;中国国境卫生检疫杂志;第45卷(第06期);摘要 * |
| Current Methods in the Molecular Typing of Mycobacterium tuberculosis and Other Mycobacteria;Tomasz Jagielski等;BioMed Research International;第2014卷;1-21 * |
| O'Toole, RF等.Development of a New Genome-Wide MLST Scheme for High-Resolution Typing of Diverse Mycobacterium tuberculosis Complex Strains.EBIOMEDICINE.2018,第34卷6-7. * |
| 类鼻疽伯克霍尔德菌适应定殖的比较基因组学研究;杨文波;中国硕士学位论文全文数据库;摘要 * |
| 致病性细菌微进化的研究进展;杨瑞馥;;生命科学;20090815(04);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112481402A (zh) | 2021-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2841060C (en) | Method and kit for dna typing of hla gene | |
| CN112481399B (zh) | 一种基于二代测序技术用于结核分枝杆菌mlst分型的引物组及建库方法 | |
| CN112481402B (zh) | 一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用 | |
| CN107988421B (zh) | 与大豆种子油分含量相关的分子标记、区间、引物及应用 | |
| CN107488725A (zh) | 适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法及其应用 | |
| CN111808978B (zh) | 一种用于副溶血弧菌mlst分型溯源的多重pcr引物组及其二代测序建库方法 | |
| CN107988422B (zh) | 与大豆种子油分含量相关的snp标记、区间、引物及应用 | |
| Azhaguvel et al. | Methodological advancement in molecular markers to delimit the gene (s) for crop improvement | |
| CN108642201B (zh) | 与谷子株高性状相关的snp标记及其检测引物和应用 | |
| CN111378781A (zh) | 一种快速高效鉴别水稻耐盐基因skc1的分子标记引物及应用 | |
| CN108707685B (zh) | 与谷子分蘖数性状相关的snp标记及其检测引物和应用 | |
| CN107937493B (zh) | 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物 | |
| KR101410329B1 (ko) | Ｔｓｗｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트 | |
| CN112226531B (zh) | 濒危物种崖柏ssr引物及其应用 | |
| CN112094931B (zh) | 一组扩增克罗诺杆菌mlst分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用 | |
| CN114891900A (zh) | 一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物 | |
| CN111549107B (zh) | 一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用 | |
| CN108642199B (zh) | 与谷子旗叶长性状相关的snp标记及其检测引物和应用 | |
| CN108715901B (zh) | 一种与谷子株高性状相关的snp标记及其检测引物和应用 | |
| CN112430675A (zh) | 利用snp标记kz288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法 | |
| CN112410441A (zh) | 利用snp标记kz288479.1_95621鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法 | |
| CN112029868A (zh) | 三疣梭子蟹微卫星标记及在生长性状关联分析中的应用 | |
| CN116103413B (zh) | 与地方鸡产蛋性状相关的snp标记及其检测方法和应用 | |
| CN116751868B (zh) | 与地方鸡产蛋性状相关的snp标记及其检测方法与应用 | |
| CN108642202B (zh) | 与谷子茎节数性状相关的snp标记及其检测引物和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |