CN111808978A

CN111808978A - 一种用于副溶血弧菌mlst分型溯源的多重pcr引物组及其二代测序建库方法

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Publication number: CN111808978A
Application number: CN202010748999.3A
Authority: CN
Inventors: 张子龙; 田桢干; 张威; 周娴; 李深伟; 杜鹃
Original assignee: Shanghai International Travel Health Care Center Shanghai Customs Port Outpatient Department
Current assignee: Shanghai International Travel Health Care Center Shanghai Customs Port Outpatient Department
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN111808978B

Abstract

本发明提供了一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组及其二代测序建库方法，属于微生物检测技术领域。用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组，包括gyrB基因扩增用引物、dnaE基因扩增用引物、dtdS基因扩增用引物、pyrC基因扩增用引物、tnaA基因扩增用引物和pntA基因扩增用引物以及recA‑1基因扩增用引物或recA‑2基因扩增用引物中的一种。本发明针对这7个基因进行多重PCR扩增，建立基于二代测序的建库方法，针对两种类型的RecA基因都可以实现扩增及测序，且测序结果与一代测序结果较为一致；同时一次PCR可以实现所有基因的扩增，直接用于建库，操作简单。

Description

一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组及其二代测序建库方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组及其二代测序建库方法。

背景技术

随着交通和贸易的发展，人口和货物的流动越来越频繁，大量的跨境生物在口岸被截获检测到，其中包括大量食源性致病细菌，其中副溶血弧菌是常见的腹泻细菌。

副溶血弧菌弧菌科弧菌，常见于近海岸的海水、海底沉积物、海产品及盐渍食品中；多见于日本、东南亚、美国及中国台北地区，是引起食源性疾病的重要病原之一；该菌引起的食物中毒在日本占细菌性食物中毒的40-60％，居首位；1998年以来，该菌引发的食物中毒事件规模呈明显上升趋势，已超过沙门菌和志贺菌，跃居首位。

副溶血弧菌分型方法包括血清学分型和噬菌体分型等传统分型方法，以及PFGE、RFLP、RAPD、ERIC-PCR、Ribotyping、MLST、MLVA、Rep-PCR等基因分型方法，但是各种方法都有一定的局限性。MLST分型方法结果数字化；分析数据可通过互联网在全球范围进行比对，在检测全球流行病上具有强大优势；

1998年，多位点测序分型溯源(MLST)技术作为一种以核苷酸序列分析为基础的病原菌分型方法被首次提出，他是高通量测序技术和成熟的群体遗传学相结合的产物。该方法简单易行，重复性强，能够反映病原菌的群体进化生物学，在流行病学调查和病原菌的分型鉴定中发挥了巨大作用，目前该技术已应用于多种原核及真核病原微生物的分子分型、检测鉴定、来源追踪等领域。

MLST是通过测定多个管家基因中长度约470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。

目前，MLST分型技术已被应用于20多种病原细菌及3种病原真菌的分型鉴定中，脑膜炎奈瑟(Neisseriameningitidis)是最早用于评价MLST的病原菌，研究发现MLST比MLEE分析生成的遗传进化树更为合理，而且能够清晰覆盖全球大多数侵袭性脑膜炎奈瑟菌，MLST技术现在已被许多实验室用于脑膜炎奈瑟菌的分型鉴定。

目前MLST技术尚未广泛的用于高频跨境细菌的溯源分型研究，MLST技术从原理上来说是最适合应用于细菌溯源的技术，但是因为测序仪器的不方便，所以没有广泛推广。而随着分子生物学的发展，基因测序日新月异，越来越普及到普通的实验室。当前的MLST技术多是对现有数据库已经存在的序列的分析，对于口岸高频跨境细菌不一定适合，因此通过深度测序结合生物信息学的方式分析适应于跨境细菌的持家基因具有很大的必要性。

针对副溶血弧菌的MLST分型技术早有研究，其行业标准更是已经颁布，但是采用的一代测序的方法还有一定的局限性，本发明针对口岸截获的副溶血弧菌株进行分析，在现有的MLST分型标准基础上，建立新的测序建库方法，可以更方便的开展测序工作，加快MLSR分型的速度，减少工作量。

目前已经颁布的行业标准《SNT 4525.3-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第3部分：副溶血性弧菌》里规定了7个管家基因用于副溶血弧菌的MLST分型，但是针对这7个基因的扩增采用普通PCR的方法，测序采用一代测序的方法，一代测序需要针对同一个细菌多次扩增，测序需要外送到第三方公司，操作复杂，工作量大。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组及其二代测序建库方法，针对两种类型的RecA基因可以实现扩增及测序，且同时一次PCR可以实现7个管家基因的扩增，可直接用于建库，大大简化操作。

本发明提供了一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组，包括gyrB基因扩增用引物、dnaE基因扩增用引物、dtdS基因扩增用引物、pyrC基因扩增用引物、tnaA基因扩增用引物和pntA基因扩增用引物以及recA-1基因扩增用引物和recA-2基因扩增用引物中的一种，所述gyrB基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的gyrB-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的gyrB-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的gyrB-R1；

所述recA-1基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的recA-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的recA-F2、核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的recA-R2和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的recA-R1；

所述recA-2基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的recA-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的recA-F3、核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的recA-R3和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的recA-R1；

所述dnaE基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的dnaE-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的dnaE-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的dnaE-R1；

所述dtdS基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的dtdS-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的dtdS-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的dtdS-R1；

所述pyrC基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的pyrC-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的pyrC-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的pyrC-R1；

所述tnaA基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的tnaA-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的tnaA-R2；

所述pntA基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的pntA-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的pntA-R2。

本发明提供了一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的试剂盒，包括所述多重PCR引物组。

优选的，还包括多重PCR扩增反应用试剂。

本发明提供了所述引物组或所述试剂盒在副溶血弧菌MLST分型溯源在副溶血弧菌建库中的应用。

本发明提供了一种副溶血弧菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，包括以下步骤：

1)提取待检测副溶血弧菌的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，用所述多重PCR引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR产物；

3)将所述多重PCR产物两端添加高通量测序接头，得到高通量测序文库。

优选的，步骤2)中所述多重PCR扩增的反应程序为95℃2min；95℃15sec，56℃30sec，72℃30sec，15个循环；72℃5min。

优选的，步骤2)中所述多重PCR扩增的反应体系为模板5ng、扩增反应混合液12.5μL、多重引物Mix，用ddH₂O补充至25μL；

所述多重引物Mix中各条引物在所述反应体系的终浓度如下：

优选的，步骤2)中所述多重PCR扩增或步骤3)中所述添加高通量测序接头后，还包括分别对反应产物进行纯化。

本发明提供的用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组，包括行业标准《SNT 4525.3-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第3部分：副溶血性弧菌》里规定了7个管家基因的多重PCR引物，针对这7个基因进行多重PCR扩增，建立基于二代测序的建库方法，测序结果与一代测序结果较为一致；同时一次PCR可以实现所有基因的扩增，直接用于建库，操作简单。

附图说明

图1为本发明提供的二代测序建库方法所得文库的电泳结果，其中泳道从左向右依次表示Marker、组1、组2、组3和组4。

具体实施方式

本发明提供了一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组，包括gyrB基因扩增用引物、dnaE基因扩增用引物、dtdS基因扩增用引物、pyrC基因扩增用引物、tnaA基因扩增用引物和pntA基因扩增用引物以及recA-1基因扩增用引物和recA-2基因扩增用引物中的一种，具体的核苷酸序列及扩增片段信息见表1：

表1多重PCR引物组信息

本发明提供的引物组能够在同一体系中成功扩增上述7个基因，满足多重PCR扩增要求，避免传统一代测序中对同一样本进行多次扩增的繁琐操作，提供了简便快速且准确度高的建库基础。本发明对所述引物组的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物组的来源即可，例如委托基因合成公司合成。

本发明提供了一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的试剂盒，包括所述多重PCR引物组。所述试剂盒优选还包括多重PCR扩增反应用试剂。本发明对所述多重PCR扩增反应用试剂的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的多重PCR扩增反应用试剂即可。

1)提取待检测副溶血弧菌的DNA；

本发明对提取待检测副溶血弧菌的DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的微生物DNA提取方法即可，例如采用商品微生物DNA提取试剂盒提取。

在本发明中，所述多重PCR扩增的反应程序优选为95℃2min；95℃15sec，56℃30sec，72℃30sec，15个循环；72℃5min。所述多重PCR扩增的反应体系优选为模板5ng、扩增反应混合液12.5μL、多重引物Mix，用ddH₂O补充至25μL；

所述多重引物Mix中各条引物在所述反应体系的终浓度见表2：

表2各引物在反应体系的终浓度

在本发明中，所述多重PCR扩增或所述添加高通量测序接头后，优选还包括分别对反应产物进行纯化和纯化产物的浓度测定。

本发明对所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方法即可，例如使用翊圣DNA SelctionBeads(Cat#12601)纯化。

本发明对所述添加高通量测序接头的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的添加高通量测序接头的方法即可。在本发明实施例中，采用PCR反应的方法添加高通量测序接头，引物使用翊圣96Single Index Primers Kit(Cat#12611)。

得到高通量测序文库后，如果想要进一步了解待检测副溶血弧菌的基因型，需要进行测序，将测序结果匹配到相应的基因编号，比对测序数据与一代测序结果一致性。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组及其二代测序建库方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、7种管家基因基本信息及建库引物见表1。

2、建库方案

2.1一轮引物合成

一轮引物中包括除用于多重PCR扩增的序列之外，还会带有一段用于二轮引物结合扩增的通用序列，以tnaA基因引物为例：

F1：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGGTATCGATGGAAAACATGC(SEQ IDNO.23)；

R1：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGCAATATTTTCGCCGCATCAAC(SEQ IDNO.24)；

其中，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.25)为F端引物的通用序列：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC(SEQ ID NO.26)为R端引物的通用序列。

2.2待测样本的DNA提取方法

从口岸样本中得到的副溶血弧菌分离株，编号为1269和1177，具体是从人腹泻样本中分离到的。采用微生物DNA提取试剂盒按照操作说明进行提取，得到DNA溶液。

2.3利用上述一轮引物，以1269和1177两个分离株的DNA为模板，分别对recA-1或recA-2在内的7个管家基因进行多重PCR扩增，具体反应体系见表2和表3，反应程序见表4。

表2各引物在反应体系的终浓度

表3反应体系

注:组1和组3分别针对1269和1277样本的recA基因，在建库时选用了recA-1引物；组2和组4分别针对1269和1277样本的recA基因,在建库时选用了recA-2引物；其余各基因引物一致。

表4反应程序

2.4扩增产物纯化(1×beads)

使用翊圣DNA Selction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。最后使用21μL水洗脱。

2.5纯化产物浓度测定(Qubit)

取1μL纯化产物使用

3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度并计算产量。结果见表5。

表5一轮扩展纯化产物的浓度

编号	组1	组2	组3	组4
					浓度(ng/μL)	1.93	1.43	1.88	1.88
总计(ng)	38.6	28.6	37.6	37.6

2.6二轮扩增

取部分一轮扩展纯化产物进行二轮扩增，即高通量测序接头添加过程，引物使用翊圣96Single Index Primers Kit(Cat#12611)。

1)扩增体系(25μL体系)见表6。

表6二轮扩展反应体系

注：505，701，702，703，704分别代表index primer的名字，具体采用翊圣12613系列index primer。

2)扩增程序见表7。

表7二轮扩展反应程序

3)扩增产物纯化(1×beads)

4)纯化产物浓度测定(Qubit)

取1μL文库使用

3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度并计算产量。结果见表8。

表8不同实验组制备的文库浓度

编号	组1	组2	组3	组4
					浓度(ng/μL)	25.0	28.0	25.2	24.6
总计(ng)	500.0	560.0	504.0	492.0

5)取150ng二轮产物电泳检测，电泳条件130V，60min。结果见图1。由图1可知，四组制备的文库扩展得到目标片段。

实施例2

将实施例1制备的四组文库混合后测序，具体见表9。

表9高通量测序文库信息(4组文库等质量混样测序)

测序结果分析

1、数据质量见表10。

表10不同方法制备的文库测序数据质量一览表

2、基因序列匹配情况见表11。

表11不同方法制备的文库基因序列匹配情况

3、测序结果分析

1)1269菌株，两组扩增方案，七基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号，两组数据比对结果一致。

2)1177菌株，两组扩增方案，七基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号，两组数据比对结果一致。

4、与一代测序结果比较一致，具体见表12。

表12一代测序与本发明二代建库测序结果比较

5、基因序列

1)gyrB测序序列

F1 R1扩增片段为VPgB_12024_12618(SEQ ID NO.27)；

F2 R1扩增片段为VPgB_12274_12618(SEQ ID NO.28)；

拼接后得到的VPgB(SEQ ID NO.29)匹配到的基因序列编号gyrB_4(正向比对)；

3)recA-1引物测序序

F1 R1扩增片段为VPrA_2693496_2694229(SEQ ID NO.30)；

F2 R1扩增片段为VPrA_2693496_2693878(SEQ ID NO.31)；

F1 R2扩增片段为VPrA_2693871_2694229(SEQ ID NO.32)；

拼接后VPrA(SEQ ID NO.33)匹配到的基因序列编号recA_19(反向互补比对)；

4)recA-2引物测序序列

F1 R1扩增片段为VPrA_2693496_2694229(SEQ ID NO.34)；

F3 R3扩增片段为VPrA_2693643_2693966(SEQ ID NO.35)；

拼接得到VPrecA(SEQ ID NO.36)匹配到的基因列表编号：recA_19(反向互补比对)；recA两组测序引物方案测序结果一致。

5)dnaE测序序列

F1 R1扩增片段为VPdE_2414627_2415200(SEQ ID NO.37)；

F2 R1扩增片段为VPdE_2414895_2415200(SEQ ID NO.38)；

拼接得到VPdE(SEQ ID NO.39)匹配到的基因列表编号：dnaE_3(正向比对)；

6)dtdS测序序列

F1 R1扩增片段为VPds_1613277_1613757(SEQ ID NO.40)；

F2 R1扩增片段为VPds_1613277_1613558(SEQ ID NO.41)；

拼接的VPds(SEQ ID NO.42)匹配到的基因列表编号：dtdS_4(反向互补比对)；

7)pyrC测序序列

F1 R1扩增片段为VPpC_404120_404633(SEQ ID NO.43)；

F2 R1扩增片段为VPpC_404120_404462(SEQ ID NO.44)；

拼接VPpC(SEQ ID NO.45)匹配到的基因列表编号：pyrC_4(反向互补比对)；

8)tnaA测序序列，F1 R1扩增片段为VPtA_191455_191880(SEQ ID NO.46)，匹配到的基因列表编号：tnaA_22(正向比对)；

9)pntA测序序列

F1 R1扩增片段为VPpA_955657_956092(SEQ ID NO.47)，匹配到的基因列表编号：pntA_29(反向互补比对)；

二、1177菌株：

1)gyrB测序序列

F1 R1扩增片段为VPgB_12024_12618(SEQ ID NO.48)；

F2 R1扩增片段为VPgB_12274_12618(SEQ ID NO.49)；

拼接组装之后的序列VPgB(SEQ ID NO.50)匹配到的基因序列编号gyrB_10(正向比对)；

2)recA-1引物测序序列(组3)

F1 R1扩增片段为VPrA_2693496_2694229(SEQ ID NO.51)；

F2 R1扩增片段为VPrA_2693496_2693878(SEQ ID NO.52)；

F1 R2扩增片段为VPrA_2693871_2694229(SEQ ID NO.53)；

拼接组装之后的序列为VPrA(SEQ ID NO.54)匹配到的基因序列编号recA_19(反向互补比对)；

3)recA-2引物测序序列(组4)

F1 R1扩增片段为VPrA_2693496_2694229(SEQ ID NO.55)；

F3 R3扩增片段为VPrA_2693643_2693966(SEQ ID NO.56)；

拼接组装之后的序列为VPrA(SEQ ID NO.57)，匹配到的基因列表编号：recA_19(反向互补比对)，recA两组测序引物方案测序结果一致。

5)dnaE测序序列

F1 R1扩增片段为VPdE_2414627_2415200(SEQ ID NO.58)；

F2 R1扩增片段为VPdE_2414895_2415200(SEQ ID NO.59)；

拼接组装之后的序列为VPdE(SEQ ID NO.60)匹配到的基因列表编号：dnaE_13(正向比对)；

4)dtdS测序序列

F1 R1扩增片段，无扩增片段；

F2 R1扩增片段为VPds_1613277_1613558(SEQ ID NO.61)；

拼接组装之后的序列(只有短片段扩增序列)VPds(SEQ ID NO.62)匹配到的基因列表编号：dtdS_27(反向互补比对)；

5)pyrC测序序列

F1 R1扩增片段为VPpC_404120_404633(SEQ ID NO.63)；

F2 R1扩增片段为VPpC_404120_404462(SEQ ID NO.64)；

拼接组装之后的序列VPpC(SEQ ID NO.65)匹配到的基因列表编号：pyrC_27(反向互补比对)；

6)tnaA测序序列

F1 R1扩增片段为VPtA_191455_191880(SEQ ID NO.66)，匹配到的基因列表编号：tnaA_21(正向比对)；

7)pntA测序序列

F1 R1扩增片段为VPpA_955657_956092(SEQ ID NO.67)，匹配到的基因列表编号：pntA_28(反向互补比对)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海国际旅行卫生保健中心（上海海关口岸门诊部）

<120> 一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组及其二代测序建库方法

<160> 67

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtatgaag gtggtattca agc 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaaggyttc tcdaagaaag c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcagagtcac cctccacaat 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggatgtaga aaccatttca acg 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcdgarathg aaggygarat g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ckngcytgna rvcccatrtg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cattgtagct gtaccaagca cc 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtntcycarc cdgayacwgg 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cyttdatdcg hgtytcrtta cc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caacgtcacg gattaccgct 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaatvgmrt trtctttcga c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcactgaaga ggaaatgtgt g 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accgaagtag acaaacctga g 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aycgygtwtc yggygaag 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgagcaccaa cgtgtttag 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agattcgcgc agcaaaagca 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcaccabgtt gatatyttcg ac 22

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgtgcgcagt gtaagaacc 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgtgtacga aattgccacc 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcaatatttt cgccgcatca ac 22

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgacggcta cgcaaaaga 19

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcttgaggct gagccgatac 20

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcggtatc gatggaaaac atgc 54

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcaatat tttcgccgca tcaac 55

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atc 33

<210> 27

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gttcgttcag cacttaaaca ccaacaaaac accaatcatc gagaaaatct tccacttcga 60

cttagaacgt gaagacggta tctcggtaga agtggcaatg cagtggaacg atggtttcca 120

agagaacatc ttctgtttca ccaacaacat tccacagcgc gatggtggta ctcaccttgc 180

tggtttccgt gcggcactaa cacgtacgct aaacagcttt atggataaag aaggcttctc 240

gaagaaagcg aaaacagcaa cgtcaggcga cgatgcgcgn nnnnnnnncc tgatccaaaa 300

ttctcgagcc aaaccaaaga caaactggtt tcttctgaag tgaaatcagc ggttgaatcg 360

gcgatgggtg agaaattatc tgagttcttg gtcgaaaacc caagcgaagc gaagatggtt 420

tgttcgaaaa tcatcgatgc agcacgtgca cgtgaagccg cacgtaaagc gcgtgaaatg 480

actcgtcgta aaggcgcgct agacctagca ggcctaccag gcaaacttgc agactgtcag 540

gaaaaagatc cggcactctc tgaactatac 570

<210> 28

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaaacagcaa cgtcaggcga cgatgcgcgt gaaggtttga cagccgttgt ttcggtaaaa 60

gtgcctgatc caaaattctc gagccaaacc aaagacaaac tggtttcttc tgaagtgaaa 120

tcagcggttg aatcggcgat gggtgagaaa ttatctgagt tcttggtcga aaacccaagc 180

gaagcgaaga tggtttgttc gaaaatcatc gatgcagcac gtgcacgtga agccgcacgt 240

aaagcgcgtg aaatgactcg tcgtaaaggc gcgctagacc tagcaggcct accaggcaaa 300

cttgcagact gtcaggaaaa agatccggca ctctctgaac tatac 345

<210> 29

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gttcgttcag cacttaaaca ccaacaaaac accaatcatc gagaaaatct tccacttcga 60

cttagaacgt gaagacggta tctcggtaga agtggcaatg cagtggaacg atggtttcca 120

agagaacatc ttctgtttca ccaacaacat tccacagcgc gatggtggta ctcaccttgc 180

tggtttccgt gcggcactaa cacgtacgct aaacagcttt atggataaag aaggcttctc 240

gaagaaagcg aaaacagcaa cgtcaggcga cgatgcgcgt gaaggtttga cagccgttgt 300

ttcggtaaaa gtgcctgatc caaaattctc gagccaaacc aaagacaaac tggtttcttc 360

tgaagtgaaa tcagcggttg aatcggcgat gggtgagaaa ttatctgagt tcttggtcga 420

aaacccaagc gaagcgaaga tggtttgttc gaaaatcatc gatgcagcac gtgcacgtga 480

agccgcacgt aaagcgcgtg aaatgactcg tcgtaaaggc gcgctagacc tagcaggcct 540

accaggcaaa cttgcagact gtcaggaaaa agatccggca ctctctgaac tatac 595

<210> 30

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt nnnnnnnnng agcgagctaa 300

tgcatcacaa atctctagag cttgctcacc agtgtctggc tgagatacca atagcgcatc 360

gatatcaaca ccaagctttt tagcgtacac aggatccaac gcgtgctcag catcgataaa 420

cgcacaagtt ttaccttcac gttgtgcagc agcgataagc tcgagagtta gcgttgtttt 480

acctgaagat tctggaccgt agatttctac gatacgaccc attggtagac caccagcacc 540

caaagcgata tcaagagaaa gcgaacc 567

<210> 31

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt ggttgatgaa gatacacata 300

cagttagact gtttcaggtt acctgtaagc ttacgcattg cttgagaaag catacgagct 360

tggagaccca tgtggctgtc gcc 383

<210> 32

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctgtcgccca tttcgccttc gatctcagct ttaggtgtta gagcagcaac agagtcaaca 60

accattacgt cgatggcgcc agagcgagct aatgcatcac aaatctctag agcttgctca 120

ccagtgtctg gctgagatac caatagcgca tcgatatcaa caccaagctt tttagcgtac 180

acaggatcca acgcgtgctc agcatcgata aacgcacaag ttttaccttc acgttgtgca 240

gcagcgataa gctcgagagt tagcgttgtt ttacctgaag attctggacc gtagatttct 300

acgatacgac ccattggtag accaccagca cccaaagcga tatcaagaga aagcgaacc 359

<210> 33

<211> 734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt ggttgatgaa gatacacata 300

cagttagact gtttcaggtt acctgtaagc ttacgcattg cttgagaaag catacgagct 360

tggagaccca tgtggctgtc gcccatttcg ccttcgatct cagctttagg tgttagagca 420

gcaacagagt caacaaccat tacgtcgatg gcgccagagc gagctaatgc atcacaaatc 480

tctagagctt gctcaccagt gtctggctga gataccaata gcgcatcgat atcaacacca 540

agctttttag cgtacacagg atccaacgcg tgctcagcat cgataaacgc acaagtttta 600

ccttcacgtt gtgcagcagc gataagctcg agagttagcg ttgttttacc tgaagattct 660

ggaccgtaga tttctacgat acgacccatt ggtagaccac cagcacccaa agcgatatca 720

agagaaagcg aacc 734

<210> 34

<211> 568

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt nnnnnnnnnn gagcgagcta 300

atgcatcaca aatctctaga gcttgctcac cagtgtctgg ctgagatacc aatagcgcat 360

cgatatcaac accaagcttt ttagcgtaca caggatccaa cgcgtgctca gcatcgataa 420

acgcacaagt tttaccttca cgttgtgcag cagcgataag ctcgagagtt agcgttgttt 480

tacctgaaga ttctggaccg tagatttcta cgatacgacc cattggtaga ccaccagcac 540

ccaaagcgat atcaagagaa agcgaacc 568

<210> 35

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acaacttcat cgccttcttt gattgcgcca gtacgacgga tatctaaacg aacagaagcg 60

taaaacttaa gcgcgttacc gccagtagtc gtttcagggt taccgaacat cacaccaatc 120

ttcatacgga tttggttgat gaagatacac atacagttag actgtttcag gttacctgta 180

agcttacgca ttgcttgaga aagcatacga gcttggagac ccatgtggct gtcgcccatt 240

tcgccttcga tctcagcttt aggtgttaga gcagcaacag agtcaacaac cattacgtcg 300

atggcgccag agcgagctaa tgca 324

<210> 36

<211> 734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt ggttgatgaa gatacacata 300

cagttagact gtttcaggtt acctgtaagc ttacgcattg cttgagaaag catacgagct 360

tggagaccca tgtggctgtc gcccatttcg ccttcgatct cagctttagg tgttagagca 420

gcaacagagt caacaaccat tacgtcgatg gcgccagagc gagctaatgc atcacaaatc 480

tctagagctt gctcaccagt gtctggctga gataccaata gcgcatcgat atcaacacca 540

agctttttag cgtacacagg atccaacgcg tgctcagcat cgataaacgc acaagtttta 600

ccttcacgtt gtgcagcagc gataagctcg agagttagcg ttgttttacc tgaagattct 660

ggaccgtaga tttctacgat acgacccatt ggtagaccac cagcacccaa agcgatatca 720

agagaaagcg aacc 734

<210> 37

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttcgccgcca tcgtaccgaa tgtgatgatc tgagatacgg catcgcgacc gtacatttcg 60

gcaacgtgat caatcacttg gtcacgctta tccatacaaa agtcgacgtc gaaatcgggc 120

atggatacac gttctgggtt caagaaacgt tcgaagagca agtcatattc aagcggatca 180

agatcggtga ttttcagcgc gtaggccacc aaagaaccgg cacccgaacc acgaccagga 240

ccgactggaa tcgcgttgtc tttcgaccac tggatgaact ccnnnnnnng aagtagcctg 300

ggaaccccat ttggttgatt acgtcgagtt cgatttgtaa acgctcgtcg tattctggac 360

ggcgcttttt gcgttcttct tcattaggga ataggaactc tagacgctct tccaaacctt 420

ctcgcgactt catgaccaag aattcagttt cttccatccc ttctgttggg aaggctggca 480

agaagtattc acccaaacga acggtcacgt tacaacgctt agcgatctcg acactgtttt 540

ctagcgcttc tggaatatca gcaaacagct 570

<210> 38

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

actggatgaa ctccattacg atcaagaagt agcctgggaa ccccatttgg ttgattacgt 60

cgagttcgat ttgtaaacgc tcgtcgtatt ctggacggcg ctttttgcgt tcttcttcat 120

tagggaatag gaactctaga cgctcttcca aaccttctcg cgacttcatg accaagaatt 180

cagtttcttc catcccttct gttgggaagg ctggcaagaa gtattcaccc aaacgaacgg 240

tcacgttaca acgcttagcg atctcgacac tgttttctag cgcttctgga atatcagcaa 300

acagct 306

<210> 39

<211> 574

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ttcgccgcca tcgtaccgaa tgtgatgatc tgagatacgg catcgcgacc gtacatttcg 60

gcaacgtgat caatcacttg gtcacgctta tccatacaaa agtcgacgtc gaaatcgggc 120

atggatacac gttctgggtt caagaaacgt tcgaagagca agtcatattc aagcggatca 180

agatcggtga ttttcagcgc gtaggccacc aaagaaccgg cacccgaacc acgaccagga 240

ccgactggaa tcgcgttgtc tttcgaccac tggatgaact ccattacgat caagaagtag 300

cctgggaacc ccatttggtt gattacgtcg agttcgattt gtaaacgctc gtcgtattct 360

ggacggcgct ttttgcgttc ttcttcatta gggaatagga actctagacg ctcttccaaa 420

ccttctcgcg acttcatgac caagaattca gtttcttcca tcccttctgt tgggaaggct 480

ggcaagaagt attcacccaa acgaacggtc acgttacaac gcttagcgat ctcgacactg 540

ttttctagcg cttctggaat atcagcaaac agct 574

<210> 40

<211> 481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

caaccgctgc cgccatgatg ccgattgggc cagcacctgt gatcagcacg tcttcaccca 60

caaggtcgaa agaaagtgcg gtgtgtactg cgttaccaaa cgggtcaaag atagacgcta 120

gatcgtcaga gatctcgtct gggatcttga acgcgttgaa cgctgggata accaagtatt 180

ctgcaaatgc gccttcacgg tttacaccca caccgatagt gttacggcat aagtgagtac 240

gaccgccacg acagttacga cagtgaccac acgtgatgtg accttcgcca gatacgcggt 300

caccgatttc aaagccacga acttcctgac caatcgcgac cacttcaccc acgtattcgt 360

gaccgacaac cataggtact ggaatggttt tttgtgacca ttcgtcccag ttgtaaatgt 420

gtacgtctgt accacaaatc gcagttttct taattttgat cagaatgtcg ttatggccaa 480

c 481

<210> 41

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

caaccgctgc cgccatgatg ccgattgggc cagcacctgt gatcagcacg tcttcaccca 60

caaggtcgaa agaaagtgcg gtgtgtactg cgttaccaaa cgggtcaaag atagacgcta 120

gatcgtcaga gatctcgtct gggatcttga acgcgttgaa cgctgggata accaagtatt 180

ctgcaaatgc gccttcacgg tttacaccca caccgatagt gttacggcat aagtgagtac 240

gaccgccacg acagttacga cagtgaccac acgtgatgtg ac 282

<210> 42

<211> 481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

caaccgctgc cgccatgatg ccgattgggc cagcacctgt gatcagcacg tcttcaccca 60

caaggtcgaa agaaagtgcg gtgtgtactg cgttaccaaa cgggtcaaag atagacgcta 120

gatcgtcaga gatctcgtct gggatcttga acgcgttgaa cgctgggata accaagtatt 180

ctgcaaatgc gccttcacgg tttacaccca caccgatagt gttacggcat aagtgagtac 240

gaccgccacg acagttacga cagtgaccac acgtgatgtg accttcgcca gatacgcggt 300

caccgatttc aaagccacga acttcctgac caatcgcgac cacttcaccc acgtattcgt 360

gaccgacaac cataggtact ggaatggttt tttgtgacca ttcgtcccag ttgtaaatgt 420

gtacgtctgt accacaaatc gcagttttct taattttgat cagaatgtcg ttatggccaa 480

c 481

<210> 43

<211> 514

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cacaaccgca agccgattct ttcgcgcctt ttgcatgcgg agcagagtcg gtacctagga 60

aaaacttctt gctaccactg gttgcggctt cgattagcgc ttgctggtgg gtgttgcgct 120

ttagaatcgg taagcagtag aaatgaggct taatgccacc gacaagcatg tgattgcggt 180

tgaaaagaag gtggtgagca gtaatggtag cggcaacatt atcagacgcg ttgttaacga 240

actgtgctgc gtcggcggtg gtgatatgtt ctagaacgat tttaagattt gggaagtcat 300

taacgatagg agcgaggacg gtatcaagga attctttttc tcggtcgaag atatcaacgt 360

ggtgatgggt gacttctcca tgaaccaaaa gcaacatccc gacttcttcc atggcttcga 420

gaacgtggta aatgttcttc gcatcggtca caccagaatc tgagttagtc gttgcacctg 480

ctgggtaaag cttcgctgcg acaattttac cggt 514

<210> 44

<211> 343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cacaaccgca agccgattct ttcgcgcctt ttgcatgcgg agcagagtcg gtacctagga 60

aaaacttctt gctaccactg gttgcggctt cgattagcgc ttgctggtgg gtgttgcgct 120

ttagaatcgg taagcagtag aaatgaggct taatgccacc gacaagcatg tgattgcggt 180

tgaaaagaag gtggtgagca gtaatggtag cggcaacatt atcagacgcg ttgttaacga 240

actgtgctgc gtcggcggtg gtgatatgtt ctagaacgat tttaagattt gggaagtcat 300

taacgatagg agcgaggacg gtatcaagga attctttttc tcg 343

<210> 45

<211> 514

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cacaaccgca agccgattct ttcgcgcctt ttgcatgcgg agcagagtcg gtacctagga 60

aaaacttctt gctaccactg gttgcggctt cgattagcgc ttgctggtgg gtgttgcgct 120

ttagaatcgg taagcagtag aaatgaggct taatgccacc gacaagcatg tgattgcggt 180

tgaaaagaag gtggtgagca gtaatggtag cggcaacatt atcagacgcg ttgttaacga 240

actgtgctgc gtcggcggtg gtgatatgtt ctagaacgat tttaagattt gggaagtcat 300

taacgatagg agcgaggacg gtatcaagga attctttttc tcggtcgaag atatcaacgt 360

ggtgatgggt gacttctcca tgaaccaaaa gcaacatccc gacttcttcc atggcttcga 420

gaacgtggta aatgttcttc gcatcggtca caccagaatc tgagttagtc gttgcacctg 480

ctgggtaaag cttcgctgcg acaattttac cggt 514

<210> 46

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

aaatacgata tcccagtggt gattgactcg gctcgctatt gtgagaatgc ttatttcatc 60

aaacagcgtg aagaaggtta cgctgacaag tcgattttgg aaatcattcg tgaaatgtat 120

caatacggcg atatgctcac gatgtctgcc aagaaagatc caatggtgaa cattggtggc 180

atgtgttgta ttcgtgatca tcaagagttg ttccaagcgg tgcaaacgcg ctgcgttcct 240

atggaaggtt ttgtcactta tggcggcatg gctgggcgcg atatggaggc tttagcccga 300

ggtttgtatg agggcgcgga tgaagacttc ctgcattatc gaatcagtca ggtgcaatat 360

ttgggcgaac gtctgcggga ggggggaatt ccaatccaat atccaactgg tggccatgcg 420

gtgttt 426

<210> 47

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cttgaattgg tggtgcaggc caagtgattt cgccttcttt aataacagta acaccacgaa 60

gaaccacatc ttcgaaatca atattgatgt tgccgtcttt ttctttacaa agcagtttaa 120

gaaggtttac aaggttggtt gcgtaaagct gggaagattg cgttggcaaa cggccgacca 180

tgtcggtgta accaacaatt tttacgccgt tgtctgtcat gataacttgg tctttcactg 240

tgtattcaca gttaccacca ttggcggctg ccaagtcaac aatcacacta cccgctttca 300

tgctatcaac catttctttg gtgatcagct tcggagcagg tctgcccggg attaatgcag 360

ttgtgatgat gatatcaacg tctttagctt gctctgcata tagctctgcc gctttcttat 420

tgaagtcatc agacat 436

<210> 48

<211> 571

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gttcgttcag cacttaaaca ccaacaaaac accaatcatc gagaaaatct tccacttcga 60

cttagaacgt gaagacggca tctcggtaga agtggcaatg cagtggaacg atggtttcca 120

agagaacatc ttctgtttca ccaacaacat tccacagcgc gatggtggta ctcaccttgc 180

tggtttccgt gcggcactaa cacgtacgct aaacagcttt atggataaag aaggcttctc 240

gaagaaagcg aaaacagcaa cgtcaggcga cgatgcgcgt nnnnnnnnnc ctgatccaaa 300

attctcgagc caaaccaaag acaaactggt ttcttctgaa gtgaaatcag cggttgaatc 360

ggcgatgggt gagaagctat ctgagttctt ggtcgaaaac ccaagtgaag cgaaaatggt 420

ttgttcgaaa atcatcgatg cagcacgtgc tcgtgaagcc gcacgtaaag cgcgtgaaat 480

gactcgtcgt aaaggcgcgc tagacctagc aggcctacca ggcaaacttg cagactgtca 540

ggaaaaagat ccggcactct ctgaactata c 571

<210> 49

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

aaaacagcaa cgtcaggcga cgatgcgcgt gaaggtttga cagccgttgt ttcggtaaaa 60

gtgcctgatc caaaattctc gagccaaacc aaagacaaac tggtttcttc tgaagtgaaa 120

tcagcggttg aatcggcgat gggtgagaag ctatctgagt tcttggtcga aaacccaagt 180

gaagcgaaaa tggtttgttc gaaaatcatc gatgcagcac gtgctcgtga agccgcacgt 240

aaagcgcgtg aaatgactcg tcgtaaaggc gcgctagacc tagcaggcct accaggcaaa 300

cttgcagact gtcaggaaaa agatccggca ctctctgaac tatac 345

<210> 50

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gttcgttcag cacttaaaca ccaacaaaac accaatcatc gagaaaatct tccacttcga 60

cttagaacgt gaagacggca tctcggtaga agtggcaatg cagtggaacg atggtttcca 120

agagaacatc ttctgtttca ccaacaacat tccacagcgc gatggtggta ctcaccttgc 180

tggtttccgt gcggcactaa cacgtacgct aaacagcttt atggataaag aaggcttctc 240

gaagaaagcg aaaacagcaa cgtcaggcga cgatgcgcgt gaaggtttga cagccgttgt 300

ttcggtaaaa gtgcctgatc caaaattctc gagccaaacc aaagacaaac tggtttcttc 360

tgaagtgaaa tcagcggttg aatcggcgat gggtgagaag ctatctgagt tcttggtcga 420

aaacccaagt gaagcgaaaa tggtttgttc gaaaatcatc gatgcagcac gtgctcgtga 480

agccgcacgt aaagcgcgtg aaatgactcg tcgtaaaggc gcgctagacc tagcaggcct 540

accaggcaaa cttgcagact gtcaggaaaa agatccggca ctctctgaac tatac 595

<210> 51

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt nnnnnnnnng agcgagctaa 300

tgcatcacaa atctctagag cttgctcacc agtgtctggc tgagatacca atagcgcatc 360

gatatcaaca ccaagctttt tagcgtacac aggatccaac gcgtgctcag catcgataaa 420

cgcacaagtt ttaccttcac gttgtgcagc agcgataagc tcgagagtta gcgttgtttt 480

acctgaagat tctggaccgt agatttctac gatacgaccc attggtagac caccagcacc 540

caaagcgata tcaagagaaa gcgaacc 567

<210> 52

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt ggttgatgaa gatacacata 300

cagttagact gtttcaggtt acctgtaagc ttacgcattg cttgagaaag catacgagct 360

tggagaccca tgtggctgtc gcc 383

<210> 53

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ctgtcgccca tttcgccttc gatctcagct ttaggtgtta gagcagcaac agagtcaaca 60

accattacgt cgatggcgcc agagcgagct aatgcatcac aaatctctag agcttgctca 120

ccagtgtctg gctgagatac caatagcgca tcgatatcaa caccaagctt tttagcgtac 180

acaggatcca acgcgtgctc agcatcgata aacgcacaag ttttaccttc acgttgtgca 240

gcagcgataa gctcgagagt tagcgttgtt ttacctgaag attctggacc gtagatttct 300

acgatacgac ccattggtag accaccagca cccaaagcga tatcaagaga aagcgaacc 359

<210> 54

<211> 734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt ggttgatgaa gatacacata 300

cagttagact gtttcaggtt acctgtaagc ttacgcattg cttgagaaag catacgagct 360

tggagaccca tgtggctgtc gcccatttcg ccttcgatct cagctttagg tgttagagca 420

gcaacagagt caacaaccat tacgtcgatg gcgccagagc gagctaatgc atcacaaatc 480

tctagagctt gctcaccagt gtctggctga gataccaata gcgcatcgat atcaacacca 540

agctttttag cgtacacagg atccaacgcg tgctcagcat cgataaacgc acaagtttta 600

ccttcacgtt gtgcagcagc gataagctcg agagttagcg ttgttttacc tgaagattct 660

ggaccgtaga tttctacgat acgacccatt ggtagaccac cagcacccaa agcgatatca 720

agagaaagcg aacc 734

<210> 55

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt gagcgagcta atgcatcaca 300

aatctctaga gcttgctcac cagtgtctgg ctgagatacc aatagcgcat cgatatcaac 360

accaagcttt ttagcgtaca caggatccaa cgcgtgctca gcatcgataa acgcacaagt 420

tttaccttca cgttgtgcag cagcgataag ctcgagagtt agcgttgttt tacctgaaga 480

ttctggaccg tagatttcta cgatacgacc cattggtaga ccaccagcac ccaaagcgat 540

atcaagagaa agcgaacc 558

<210> 56

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

acaacttcat cgccttcttt gattgcgcca gtacgacgga tatctaaacg aacagaagcg 60

taaaacttaa gcgcgttacc gccagtagtc gtttcagggt taccgaacat cacaccaatc 120

ttcatacgga tttggttgat gaagatacac atacagttag actgtttcag gttacctgta 180

agcttacgca ttgcttgaga aagcatacga gcttggagac ccatgtggct gtcgcccatt 240

tcgccttcga tctcagcttt aggtgttaga gcagcaacag agtcaacaac cattacgtcg 300

atggcgccag agcgagctaa tgca 324

<210> 57

<211> 734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gctttttcta ctagcttgtg cttcacgcct aagtcaatca actcaccttc acggttaaag 60

ccttggccat acatgatttg cgtgtttgct tctttaaatg gtgctgcaat cttgttctta 120

accactttga tacgcgtttc gttacctaca acttcatcgc cttctttgat tgcgccagta 180

cgacggatat ctaaacgaac agaagcgtaa aacttaagcg cgttaccgcc agtagtcgtt 240

tcagggttac cgaacatcac accaatcttc atacggattt ggttgatgaa gatacacata 300

cagttagact gtttcaggtt acctgtaagc ttacgcattg cttgagaaag catacgagct 360

tggagaccca tgtggctgtc gcccatttcg ccttcgatct cagctttagg tgttagagca 420

gcaacagagt caacaaccat tacgtcgatg gcgccagagc gagctaatgc atcacaaatc 480

tctagagctt gctcaccagt gtctggctga gataccaata gcgcatcgat atcaacacca 540

agctttttag cgtacacagg atccaacgcg tgctcagcat cgataaacgc acaagtttta 600

ccttcacgtt gtgcagcagc gataagctcg agagttagcg ttgttttacc tgaagattct 660

ggaccgtaga tttctacgat acgacccatt ggtagaccac cagcacccaa agcgatatca 720

agagaaagcg aacc 734

<210> 58

<211> 571

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ttcgccgcca tcgtaccgaa tgtgatgatc tgagatacgg catcgcgacc gtacatttcg 60

gcaacgtgat caattacttg gtcacgctta tccatacaaa agtcgacgtc gaaatcgggc 120

atggatacac gttctgggtt caagaaacgt tcgaagagca agtcatattc aagcggatca 180

agatcggtga ttttcagcgc gtaggccacc aaagaaccgg cacccgaacc acgaccagga 240

ccgactggaa tcgcgttgtc tttcgaccac tggatgaact ccnnnnnnnn gaagtagcct 300

gggaacccca tttggttgat tacgtcgagt tcgatttgta aacgctcgtc gtattctgga 360

cggcgctttt tgcgctcttc ttcattaggg aataggaact ctagacgctc ttccaaacct 420

tctcgtgact tcatgaccaa gaattcagtt tcttccatcc cttctgttgg gaaggctggc 480

aagaagtatt cacctaaacg aacggtcacg ttacaacgct tggcgatctc aacactgttt 540

tctagcgctt ctggaatatc agcaaacagc t 571

<210> 59

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

actggatgaa ctccattacg atcaagaagt agcctgggaa ccccatttgg ttgattacgt 60

cgagttcgat ttgtaaacgc tcgtcgtatt ctggacggcg ctttttgcgc tcttcttcat 120

tagggaatag gaactctaga cgctcttcca aaccttctcg tgacttcatg accaagaatt 180

cagtttcttc catcccttct gttgggaagg ctggcaagaa gtattcacct aaacgaacgg 240

tcacgttaca acgcttggcg atctcaacac tgttttctag cgcttctgga atatcagcaa 300

acagct 306

<210> 60

<211> 574

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

ttcgccgcca tcgtaccgaa tgtgatgatc tgagatacgg catcgcgacc gtacatttcg 60

gcaacgtgat caattacttg gtcacgctta tccatacaaa agtcgacgtc gaaatcgggc 120

atggatacac gttctgggtt caagaaacgt tcgaagagca agtcatattc aagcggatca 180

agatcggtga ttttcagcgc gtaggccacc aaagaaccgg cacccgaacc acgaccagga 240

ccgactggaa tcgcgttgtc tttcgaccac tggatgaact ccattacgat caagaagtag 300

cctgggaacc ccatttggtt gattacgtcg agttcgattt gtaaacgctc gtcgtattct 360

ggacggcgct ttttgcgctc ttcttcatta gggaatagga actctagacg ctcttccaaa 420

ccttctcgtg acttcatgac caagaattca gtttcttcca tcccttctgt tgggaaggct 480

ggcaagaagt attcacctaa acgaacggtc acgttacaac gcttggcgat ctcaacactg 540

ttttctagcg cttctggaat atcagcaaac agct 574

<210> 61

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

caaccgctgc cgccatgatg ccgattgggc cagcacctgt gatcagcacg tcctcaccca 60

caaggtcgaa agaaagcgca gtgtgtaccg cgttaccaaa cgggtcaaag atagacgcta 120

gatcgtcaga gatctcgtct gggatcttga acgcgttgaa cgctgggata accaagtatt 180

ctgcaaatgc gccttcgcgg tttacaccca caccgatagt gttacggcat aagtgagtac 240

ggccgccacg acagttacga cagtgaccac aagtgatgtg ac 282

<210> 62

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

caaccgctgc cgccatgatg ccgattgggc cagcacctgt gatcagcacg tcctcaccca 60

caaggtcgaa agaaagcgca gtgtgtaccg cgttaccaaa cgggtcaaag atagacgcta 120

gatcgtcaga gatctcgtct gggatcttga acgcgttgaa cgctgggata accaagtatt 180

ctgcaaatgc gccttcgcgg tttacaccca caccgatagt gttacggcat aagtgagtac 240

ggccgccacg acagttacga cagtgaccac aagtgatgtg ac 282

<210> 63

<211> 514

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

cacaaccgca agccgattct ttcgcgcctt ttgcatgcgg agcagagtca gtacctagga 60

aaaacttttt gctaccactg gttgcggctt cgattagcgc ttgctggtgg gtattgcgct 120

ttagaatcgg taagcagtag aaatgaggct taatgccacc gacaagcatg tgattgcggt 180

tgaaaagaag gtggtgagca gtaatggtag cggcaacatt atcagacgcg ttgttaacga 240

actgtgctgc gtcggcagtg gtgatatgtt ctagaacgat tttaagatta gggaagtcat 300

taacgatagg agcgaggacg gtatcaagga attctttttc tcggtcgaag atatcaacgt 360

ggtgatgagt gacttctcca tgaaccaaaa gcaacatccc gacttcttcc atggcttcga 420

gaacgtggta aatgttcttc gcatcggtca caccagaatc tgagttagtc gttgcacctg 480

cagggtaaag cttcgctgcg acaattttac cggt 514

<210> 64

<211> 343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

cacaaccgca agccgattct ttcgcgcctt ttgcatgcgg agcagagtca gtacctagga 60

aaaacttttt gctaccactg gttgcggctt cgattagcgc ttgctggtgg gtattgcgct 120

ttagaatcgg taagcagtag aaatgaggct taatgccacc gacaagcatg tgattgcggt 180

tgaaaagaag gtggtgagca gtaatggtag cggcaacatt atcagacgcg ttgttaacga 240

actgtgctgc gtcggcagtg gtgatatgtt ctagaacgat tttaagatta gggaagtcat 300

taacgatagg agcgaggacg gtatcaagga attctttttc tcg 343

<210> 65

<211> 514

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

cacaaccgca agccgattct ttcgcgcctt ttgcatgcgg agcagagtca gtacctagga 60

aaaacttttt gctaccactg gttgcggctt cgattagcgc ttgctggtgg gtattgcgct 120

ttagaatcgg taagcagtag aaatgaggct taatgccacc gacaagcatg tgattgcggt 180

tgaaaagaag gtggtgagca gtaatggtag cggcaacatt atcagacgcg ttgttaacga 240

actgtgctgc gtcggcagtg gtgatatgtt ctagaacgat tttaagatta gggaagtcat 300

taacgatagg agcgaggacg gtatcaagga attctttttc tcggtcgaag atatcaacgt 360

ggtgatgagt gacttctcca tgaaccaaaa gcaacatccc gacttcttcc atggcttcga 420

gaacgtggta aatgttcttc gcatcggtca caccagaatc tgagttagtc gttgcacctg 480

cagggtaaag cttcgctgcg acaattttac cggt 514

<210> 66

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

aaatacgata tcccagtggt gattgactcg gctcgctatt gtgagaatgc ttatttcatc 60

aaacagcgtg aagaaggcta cgctgacaaa tcgattttgg aaatcattcg tgaaatgtat 120

caatacggcg atatgctcac gatgtctgcc aagaaagatc caatggtgaa cattggtggc 180

atgtgttgta ttcgtgatca tcaagagttg ttccaagcgg tgcaaacgcg ctgcgtccct 240

atggaaggtt ttgtcactta tggtggcatg gctgggcgcg atatggaggc tttagcccgt 300

ggcttgtatg agggcgcgga tgaagacttc ctgcattatc gaatcagtca ggtgcaatac 360

ttgggcgagc gtctacggga ggggggaatt ccaatccaat atccaactgg tggccatgcg 420

gtgttt 426

<210> 67

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

cttgaattgg tggcgcaggc caagtgattt caccttcttt aataacagta acaccacgaa 60

gaaccacatc ttcgaaatca atattgatgt tgccgtcttt ttctttacaa agcagtttaa 120

gaaggtttac aaggttggtt gcgtaaagct gggaagattg cgttggcaaa cggccgacca 180

tgtcggtgta accaacaatt ttaacgccgt tgtctgtcat gataacttgg tctttcactg 240

tgtattcaca gttaccacca ttagcggctg ccaagtcaac aatcacacta cccgctttca 300

tgctatcgac catttctttg gtgatcaact tcggagcagg tctgcccggg attaatgcag 360

ttgtaatgat gatatcaacg tctttagctt gctctgcata tagctctgcc gctttcttat 420

tgaagtcatc agacat 436

Claims

1.一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物组，包括gyrB基因扩增用引物、dnaE基因扩增用引物、dtdS基因扩增用引物、pyrC基因扩增用引物、tnaA基因扩增用引物和pntA基因扩增用引物以及recA-1基因扩增用引物或recA-2基因扩增用引物中的一种，其特征在于，所述gyrB基因扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的gyrB-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的gyrB-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的gyrB-R1；

2.一种用于副溶血弧菌MLST分型溯源的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述多重PCR引物组。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括多重PCR扩增反应用试剂。

4.权利要求1所述引物组或权利要求2或3所述试剂盒在副溶血弧菌MLST分型溯源在副溶血弧菌建库中的应用。

5.一种副溶血弧菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检测副溶血弧菌的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，用权利要求1所述多重PCR引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR产物；

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤2)中所述多重PCR扩增的反应程序为95℃ 2min；95℃ 15sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，15个循环；72℃ 5min。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤2)中所述多重PCR扩增的反应体系为模板5ng、扩增反应混合液12.5μL、多重引物Mix，用ddH₂O补充至25μL；

所述多重引物Mix中各条引物在所述反应体系的终浓度如下：

8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤2)中所述多重PCR扩增或步骤3)中所述添加高通量测序接头后，还包括分别对反应产物进行纯化。