CN112011537B - 一组扩增李斯特氏菌mlst分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用，涉及二代测序技术领域。本发明将行业标准《SNT 4525.9‑2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌》里规定的7个管家基因同时建立扩增引物组，并基于所述引物组建立基于二代测序的建库方法，同时一次PCR可以实现7个管家基因的扩增，直接用于建库，操作简单。利用上述方法构建得到的测序文库，可直接进行高通量二代测序，李斯特氏菌株，七基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号。

Description

一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二 代测序建库方法和应用
技术领域
本发明属于二代测序技术领域，具体涉及一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用。
背景技术
据统计，每年有6000多万艘(辆/架)交通工具带来的超过数万亿美元的产品物流进入我国，通过国境口岸的出入境人数超过2亿人次。随着交通工具、货物、人员在国际间的流动日益频繁，旅游和贸易打破了疾病爆发流行的生态地域限制，为传染病及其媒介生物的传播，提供了人为的便利，国际贸易已经成为传播传染病及其媒介生物的重要途径。对输入性的病原体进行分型溯源研究成为了传染病学的一个重要方面。
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特氏菌) 属于李斯特氏菌属(Listeria)，是一种人畜共患的病原菌，可引起人和动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症和流产等，死亡率可达20～30％。近年来随着冷藏和速冻食品消费量迅速增多，食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越大。
单核细胞增生李斯特氏菌的分型方法包括血清学分型和噬菌体分型等传统分型方法，以及PFGE、RFLP、RAPD、ERIC-PCR、Ribotyping、MLVA、 Rep-PCR等基因分型方法，但是各种方法都有一定的局限性。
而近年来使用越来越频繁的多位点测序分型溯源(MLST)技术越来越展现出在分型方面的强大优势。与传统分子生物学分型方法相比，MLST具有更高的分辨力，能将同种细菌分为更多的亚型，并确定不同ST型之间的系统发育关系以及与疾病的联系。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。
MLST越来越多的被作为能进行国际间菌株比较的常用工具，建立一种更为准确的分型系统方法。MLST目前已经成为了细菌分子流行病学研究的一种重要方法，可通过数据库与其它国家和地区的研究结果进行比对，从而更加全面的认识本地区细菌流行的特征。
而随着分子生物学的发展，基因测序日新月异，越来越普及到普通的实验室。测序成本的降低和二代测序技术的发展为MLST技术打开了方便之门，一次扩增可以就可以完成多基因测序成为了MLST技术进步的重要基础。
针对单核细胞增生李斯特氏菌的MLST分型技术早有研究，其行业标准更是已经颁布，但是采用的一代测序的方法还有一定的局限性，本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株进行分析，在现有的MLST分型标准基础上，建立新的测序建库方法，可以更方便的开展测序工作，加快MLST分型的速度，减少工作量。选取单核细胞增生李斯特氏菌的7个管家基因作为目的基因：abcZ、bglA、dapE、Cat、Dat、1dh和1hkA多重建库。
目前已经颁布的行业标准《SNT 4525.9-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌》里规定了7个管家基因用于单核细胞增生李斯特氏菌的MLST分型，但是针对这7个基因的扩增采用普通PCR的方法，测序采用一代测序的方法，一代测序需要针对同一个细菌多次扩增，测序需要外送到第三方公司，操作复杂，工作量大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用，同时一次PCR可以实现所有基因的扩增，直接用于建库，操作简单。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，所述管家基因包括abcZ、bglA、dapE、Cat、Dat、1dh和1hkA；
扩增所述管家基因abcZ的引物包括abcZ-F1、abcZ-F2和abcZ-R1，所述abcZ-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，abcZ-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，abcZ-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
扩增所述管家基因bglA的引物包括bglA-F1和bglA-R1，所述bglA-F1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述bglA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
扩增所述管家基因dapE的引物包括dapE-F1、dapE-F2和dapE-R1，所述dapE-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述dapE-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述dapE-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
扩增所述管家基因Cat的引物包括Cat-F1、Cat-F2和Cat-R1，所述Cat-F1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述Cat-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述Cat-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
扩增所述管家基因Dat的引物包括Dat-F1、Dat-F2和Dat-R1，所述Dat-F1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述Dat-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述Dat-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
扩增所述管家基因1dh的引物包括1dh-F1、1dh-F2和1dh-R1，所述 1dh-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述1dh-F2的核苷酸序列如 SEQ ID NO.16所示，所述1dh-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
扩增所述管家基因1hkA的引物包括1hkA-F1、1hkA-F2和1hkA-R1，所述1hkA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述1hkA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述1hkA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20 所示。
优选的，在所述引物的F1端和R1端还分别包括通用序列，其中F1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，R1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
本发明还提供了一种基于上述引物组的李斯特氏菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，包括以下步骤：(1)利用上述管家基因同时对李斯特氏菌进行一轮扩增；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性 15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；
(2)将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量；
(3)取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括P5和 P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min；
(4)对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。
优选的，步骤(1)所述一轮扩增的体系以25μL计，包括：李斯特氏菌 gDNA 5ng，2×Mix 12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。
优选的，所述引物混合液中：abcZ-F1的浓度为0.12μM，abcZ-F2的浓度为1μM和abcZ-R1的浓度为0.4μM；
bglA-F1的浓度为0.4μM，bglA-R1的浓度为0.4μM；
dapE-F1的浓度为0.12μM，dapE-F2的浓度为1μM，dapE-R1的浓度为 0.4μM；
Cat-F1的浓度为0.12μM，Cat-F2的浓度为0.8μM，Cat-R1的浓度为 0.4μM；
Dat-F1的浓度为0.2μM，Dat-F2的浓度为0.6μM，Dat-R1的浓度为 0.4μM；
1dh-F1的浓度为0.12μM，1dh-F2的浓度为0.6μM，1dh-R1的浓度为 0.4μM；
1hkA-F1的浓度为0.12μM，1hkA-F2的浓度为0.8μM，1hkA-R1的浓度为0.4μM。
优选的，步骤(3)所述二轮扩增的体系以25μL计，包括：一轮产物 10ng，2×Mix12.5μL，P5 0.25μL，P7 0.25μL，余量为H2O。
优选的，在得步骤(4)所述二代测序文库后，还包括测定二轮产物的浓度。
本发明还提供了利用上述建库方法构建得到的二代测序文库在李斯特氏菌二代测序中的应用。
本发明还提供了一种基于上述建库方法构建得到的二代测序文库的李斯特氏菌二代测序方法，包括以下步骤：取150ng二轮产物电泳检测后进行高通量二代测序。
优选的，所述高通量二代测序的测序平台为PE300，或其他等效测序平台，测序数据量为250M。
本发明提供了一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，将行业标准《SNT 4525.9-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌》里规定的7个管家基因同时建立扩增引物组。本发明还基于上述引物组建立了用于李斯特氏菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，同时一次PCR可以实现所有基因的扩增，直接用于建库，操作简单。在本发明实施例中，利用上述方法构建得到的测序文库，可直接进行高通量二代测序，李斯特氏菌株，七基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号。
附图说明
图1为二轮产物电泳检测结果，其中左侧条带为Marker(翌圣生物100bp DNALadder)。
具体实施方式
本发明提供了一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，所述管家基因包括abcZ、bglA、dapE、Cat、Dat、1dh和1hkA；
扩增所述管家基因abcZ的引物包括abcZ-F1、abcZ-F2和abcZ-R1，所述abcZ-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，abcZ-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，abcZ-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
扩增所述管家基因bglA的引物包括bglA-F1和bglA-R1，所述bglA-F1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述bglA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
扩增所述管家基因dapE的引物包括dapE-F1、dapE-F2和dapE-R1，所述dapE-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述dapE-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述dapE-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
扩增所述管家基因Cat的引物包括Cat-F1、Cat-F2和Cat-R1，所述 dapE-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述dapE-F2的核苷酸序列如 SEQ ID NO.10所示，所述dapE-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
扩增所述管家基因Dat的引物包括Dat-F1、Dat-F2和Dat-R1，所述Dat-F1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述Dat-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述Dat-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
扩增所述管家基因1dh的引物包括1dh-F1、1dh-F2和1dh-R1，所述 1dh-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述1dh-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述1dh-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
扩增所述管家基因1hkA的引物包括1hkA-F1、1hkA-F2和1hkA-R1，所述1hkA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述1hkA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述1hkA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20 所示。
本发明所述7个管家基因为行业标准《SNT 4525.9-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌》公开的 7个管家基因：abcZ、bglA、dapE、Cat、Dat、1dh和1hkA，各管家基因的引物及扩增片段信息如表1所示。
表1 7管家基因基本信息
Figure GDA0003842681980000061
Figure GDA0003842681980000071
表1中R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D和N的含义如表2所示。
表2字母含义表征序列信息
字母 含义
R A/G
Y C/T
M A/C
K G/T
S G/C
W A/T
H A/T/C
B G/T/C
V G/A/C
D G/A/T
N A/T/C/G
在本发明中，所述引物在进行一轮扩增时，除用于基因合成的序列之外，优选还包括用于二轮引物结合扩增的通用序列，其中F1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示(ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)，R1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示 (GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC)。
本发明还提供了一种基于上述引物组的李斯特氏菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，包括以下步骤：(1)利用上述管家基因同时对李斯特氏菌进行一轮扩增；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性 15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；
(2)将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量；
(3)取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括P5和 P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火 30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min；
(4)对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。
本发明利用7个管家基因同时对李斯特氏菌进行一轮扩增；所述7个管家基因包括abcZ、bglA、dapE、Cat、Dat、1dh和1hkA；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s， 26个循环；72℃延伸5min。
本发明所述一轮扩增的体系以25μL计，优选包括：李斯特氏菌gDNA 5ng，2×Mix12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。本发明对所述李斯特氏菌gDNA的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规gDNA提取方法即可。
本发明所述引物混合液(七基因多重Primer Mix)中，各基因的引物浓度并不相同，具体如表3所示。
表3引物浓度
Figure GDA0003842681980000081
Figure GDA0003842681980000091
本发明将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量。本发明对所述纯化的方法并没有特殊限定，优选使用翊圣DNASelction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。本发明在所述纯化后，使用26μL水洗脱，优选取1μL文库使用
Figure GDA0003842681980000092
3.0 Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度并计算产量。经过计算，本发明实施例中一轮产物浓度共计 95.2ng/μL，共得一轮产物2475ng。
本发明取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括P5和 P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火 30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min。本发明所述二轮扩增为对一轮产物添加高通量测序接头，所述接头引物P5和P7优选为翊圣384dual Index Primers Kit(Cat#12613)。本发明所述二轮扩增的体系以25μL计，优选包括：一轮产物10ng，2×Mix 12.5μL，P5 501 0.25μL，P7 706 0.25μL，余量为H2O。本发明所述二轮扩增的体系中P5 501中的501表示P5端Index Primer编号，P7706中的706表示P7端Index Primer编号。
本发明对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。本发明对所述纯化的方法并没有特殊限定，优选使用翊圣DNA Selction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。本发明在得到所述二代测序文库后，优选还包括取1μL文库使用
Figure GDA0003842681980000093
3.0 Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit，Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度并计算产量。在本发明实施例中，获得的二轮产物的浓度为106ng/μL，共计得二轮产物 2756ng。
本发明还提供了利用上述建库方法构建得到的二代测序文库在李斯特氏菌二代测序中的应用。
本发明提供了一种基于上述建库方法构建得到的二代测序文库的李斯特氏菌二代测序方法，包括以下步骤：取150ng二轮产物电泳检测后进行高通量二代测序。本发明所述电泳检测的条件优选为130V，60min，利用所述电泳可对建库片段进行初步检测，以确定片段是否得到有效的扩增，条带大小和浓度是否符合预期，如未得到扩增,可进检查体系进行再次实验。本发明所述高通量二代测序的测序平台优选为PE300，或其他等效测序平台，测序数据量优选为250M。
下面结合实施例对本发明提供的扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用表1、表2和表3中所展示的信息进行下列实验：
1、一轮扩增
1)一轮引物除用于基因合成的序列之外，还会带有一段用于二轮引物结合扩增的通用序列，以abcZ基因引物为例，F1序列为SEQ ID NO.21+SEQ ID NO.1，即ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GTATCATTATGACAGGGGTAGCTGG；R1序列为SEQ ID NO.22+SEQ IDNO.2，即：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC TCAAGGTCGCCGTTTAGAG。
2)一轮扩增体系：25μL计：李斯特氏菌gDNA 5ng，2×Mix 12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。
3)扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min，一轮产物在4℃保存。
4)扩增产物纯化(1×beads)
使用翊圣DNA Selction Beads(Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。最后使用26μL水洗脱。
5)纯化产物浓度测定(Qubit)
取1μL文库使用
Figure GDA0003842681980000101
3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit， Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度(95.2ng/μL)并计算产量 (2475ng)。
2、二轮扩增
取部分一轮产物进行二轮扩增，即高通量测序接头添加过程，引物使用翊圣384dual Index Primers Kit(Cat#12613)。
1)扩增体系(25μL)：一轮产物10ng，2×Mix 12.5μL，12613-P5 501 0.25μL，12613-P7 706 0.25μL，余量为H2O。
2)扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min。二轮产物4℃保存。
3)扩增产物纯化：(1×beads)：使用翊圣DNA Selction Beads (Cat#12601)纯化，具体步骤参见说明书。最后使用26μL水洗脱。
4)纯化产物浓度测定(Qubit)
取1μL文库使用
Figure GDA0003842681980000111
3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit， Cat#12640)进行文库浓度测定，记录文库浓度(106ng/μL)并计算产量 (2756ng)。
5)取150ng二轮产物电泳检测，电泳条件130V，60min。电泳结果如图1所示，表示各建库片段都得到了有效的扩增，可以进行测序。
3、高通量测序文库信息
测序平台：PE300；测序数据量250M。
4、测序结果分析
1)数据质量如表4所示，原始数据为209.06M，经过过滤之后的数据为76.30M，过滤后数据q30达到87.23，数据符合要求。
表4数据质量
Figure GDA0003842681980000112
2)基因序列匹配情况
利用abcZ-F1和abcZ-R1的扩增片段如SEQ ID NO.23所示，利用 abcZ-F2和abcZ-R1的扩增片段如SEQ ID NO.24所示，且匹配到的abcZ_1 序列如SEQ ID NO.25所示；
利用bglA-F1和bglA-R1的扩增片段如SEQ ID NO.26所示，匹配到的bglA_1序列如SEQ ID NO.27所示；
利用dapE-F1和dapE-R1的扩增片段如SEQ ID NO.28所示，dapE-F2 和dapE-R1的扩增片段如SEQ ID NO.29所示，匹配到的dapE_11序列如SEQ ID NO.30所示；
利用Cat-F1和Cat-R1的扩增片段如SEQ ID NO.31所示，Cat-F2和 Cat-R1的扩增片段如SEQ ID NO.32所示，匹配到的Cat_11序列如SEQ ID NO.33所示；
利用Dat-F1和Dat-R1的扩增片段如SEQ ID NO.34所示，Dat-F2和 Dat-R1的扩增片段如SEQ ID NO.35所示，匹配到的Dat_2序列如SEQ ID NO.36所示；
利用1dh-F1和1dh-R1的扩增片段如SEQ ID NO.37所示，1dh-F2和 1dh-R1的扩增片段如SEQ ID NO.38所示，匹配到的ldh_12序列如SEQ ID NO.39所示；
利用1hkA-F1和1hkA-R1的扩增片段如SEQ ID NO.40所示，1hkA-F2 和1hkA-R1的扩增片段如SEQ ID NO.41所示，匹配到的lhkA_5序列如SEQ ID NO.42所示。
3)测序结果分析
李斯特氏菌株，七基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号，与一代测序结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海国际旅行卫生保健中心（上海海关口岸门诊部）
<120> 一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtatcattat gacaggggta gctgg 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgrtyggngt yathatcatg atgt 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaaggtcgc cgtttagag 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctttttatgg ggtggagctg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gattaaatac ggtgcggaca tag 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggcatgaa gaacaagttg c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcnggncata tggaygtagt nga 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcatcgaact atgggcattt ttac 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatagagagc gagtaccaga acg 23
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcncgttttt cdacngtdat ycytgg 26
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggttcactat tcccgctttt g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgccacagtt gacattgaag ac 22
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
chggdaatgt ntayytdcaa vtnac 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgtgcgtcc ataacacacc gtc 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccatgccgtt ccattttcta cac 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggcnagyg gntttgaygg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagcaacgcc gtagaatgta g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caatcaaaaa cgccaacgat g 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tvaattcwcc nattagcggk ac 22
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggtacgcatt tcatgagaaa catc 24
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atc 33
<210> 23
<211> 539
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
taaatcgacg aacagaatgc gtataggact tttccgcaag atggaaaaac tatcaatccg 60
tttcttcgat agccgcaatg atggcgaaat gcttagtcgt ttcactagtg acttagataa 120
tatttccaac acactaaacc aagcattgat ccaagtacta tccaacgtcg cgctaatgat 180
tggtgttatc atcatgatgt tccaacaaaa cgtggaacta gccttcgtta ctctaatatc 240
tgctccattt gcgattatta ttgcgacagt gattattcga aaagcccgca aattcgttga 300
tattcaacaa gatgaactag gcgtacttaa cggctacatt gacgaaaaaa tctctggtca 360
aaaaattatt atcacaaatg gcttagaaga agaaacaatt gacggctttg ttaaacaaaa 420
caatatcgtt aaaaacgcca cttacaaagg tcaagtttac tccggtttac ttttcccaat 480
gatgcaaggt atttccctat taaatacagc tatcgttatc ttcttcggtg gatggttag 539
<210> 24
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tccaacaaaa cgtggaacta gccttcgtta ctctaatatc tgctccattt gcgattatta 60
ttgcgacagt gattattcga aaagcccgca aattcgttga tattcaacaa gatgaactag 120
gcgtacttaa cggctacatt gacgaaaaaa tctctggtca aaaaattatt atcacaaatg 180
gcttagaaga agaaacaatt gacggctttg ttaaacaaaa caatatcgtt aaaaacgcca 240
cttacaaagg tcaagtttac tccggtttac ttttcccaat gatgcaaggt atttccctat 300
taaatacagc tatcgttatc ttcttcggtg gatggttag 339
<210> 25
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aaatcgacga acagaatgcg tataggactt ttccgcaaga tggaaaaact atcaatccgt 60
ttcttcgata gccgcaatga tggcgaaatg cttagtcgtt tcactagtga cttagataat 120
atttccaaca cactaaacca agcattgatc caagtactat ccaacgtcgc gctaatgatt 180
ggtgttatca tcatgatgtt ccaacaaaac gtggaactag ccttcgttac tctaatatct 240
gctccatttg cgattattat tgcgacagtg attattcgaa aagcccgcaa attcgttgat 300
attcaacaag atgaactagg cgtacttaac ggctacattg acgaaaaaat ctctggtcaa 360
aaaattatta tcacaaatgg cttagaagaa gaaacaattg acggctttgt taaacaaaac 420
aatatcgtta aaaacgccac ttacaaaggt caagtttact ccggtttact tttcccaatg 480
atgcaaggta tttccctatt aaatacagct atcgttatct tcttcggtgg atggtta 537
<210> 26
<211> 409
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttttcataga agtcgatcat ttttctattt acccagccgt cgtaagtttt cgataagtga 60
agtggtgttt catagtgaga taaagtaatc agtggttcga tattatgtgc tagaagttca 120
tcgaataaat catcgtaaaa ttgtaatcct gcttcgtttg gctcagtttc gtcaccattt 180
gggaagatac gggaccaagc gatggaagta cggaaaacct tgaagcccat ttcggcaaaa 240
agtttcacgt catctttgta gcgatgatag aagtcaattc cttctaattt taagttatct 300
ggtgttggac cgtcagtaat gtgaccaaat ccgccttttg gagtaacatc ttgaacggaa 360
agtccttttc catcgacgtt gtaagcgcct tcgaattggt ttgcagcag 409
<210> 27
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttcatagaag tcgatcattt ttctatttac ccagccgtcg taagttttcg ataagtgaag 60
tggtgtttca tagtgagata aagtaatcag tggttcgata ttatgtgcta gaagttcatc 120
gaataaatca tcgtaaaatt gtaatcctgc ttcgtttggc tcagtttcgt caccatttgg 180
gaagatacgg gaccaagcga tggaagtacg gaaaaccttg aagcccattt cggcaaaaag 240
tttcacgtca tctttgtagc gatgatagaa gtcaattcct tctaatttta agttatctgg 300
tgttggaccg tcagtaatgt gaccaaatcc gccttttgga gtaacatctt gaacggaaag 360
tccttttcca tcgacgttgt aagcgccttc gaattggtt 399
<210> 28
<211> 473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaactatttg caaaagttgt tagctgaaca cggtattgag tccgaaaagg tacaatacga 60
cgtagacaga gccagcctag ttagcgaaat tggttccagt gacgagaaag ttttggcgtt 120
ttcagggcat atggatgtcg ttgatgcggg tgatgtctcg aagtggaagt tcccaccttt 180
tgaagcagca gagcatgaag ggaaaatata cggacgtggc gcgacggata tgaagtcagg 240
tctagcggcg atgattattg caatgattga gcttcatgaa gaaaaacaaa aactaaatgg 300
caaaattaga ttattagcaa cggttggtga agaagtcggt gaacttggag ccgaacaact 360
aacgcaaaaa ggttacgcag atgatttaga tggcttgatt atcggcgaac cgagtggaca 420
ccggattgtt tatgcgcata aaggttccat taattatacc attaaatcca ctg 473
<210> 29
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgcgggtgat gtctcgaagt ggaagttccc accttttgaa gcagcagagc atgaagggaa 60
aatatacgga cgtggcgcga cggatatgaa gtcaggtcta gcggcgatga ttattgcaat 120
gattgagctt catgaagaaa aacaaaaact aaatggcaaa attagattat tagcaacggt 180
tggtgaagaa gtcggtgaac ttggagccga acaactaacg caaaaaggtt acgcagatga 240
tttagatggc ttgattatcg gcgaaccgag tggacaccgg attgtttatg cgcataaagg 300
ttccattaat tataccatta aatccactg 329
<210> 30
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttgcaaaagt tgttagctga acacggtatt gagtccgaaa aggtacaata cgacgtagac 60
agagccagcc tagttagcga aattggttcc agtgacgaga aagttttggc gttttcaggg 120
catatggatg tcgttgatgc gggtgatgtc tcgaagtgga agttcccacc ttttgaagca 180
gcagagcatg aagggaaaat atacggacgt ggcgcgacgg atatgaagtc aggtctagcg 240
gcgatgatta ttgcaatgat tgagcttcat gaagaaaaac aaaaactaaa tggcaaaatt 300
agattattag caacggttgg tgaagaagtc ggtgaacttg gagccgaaca actaacgcaa 360
aaaggttacg cagatgattt agatggcttg attatcggcg aaccgagtgg acaccggatt 420
gtttatgcgc ataaaggttc cattaattat accattaaat cc 462
<210> 31
<211> 497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaatccagcg cagttttaca taaactgttt tgccttcttc gttaatccat ttgaacgcat 60
gaacactaga gccacgtatt tcgcggtaag aagccggcgt tccttcatca ctgaataagt 120
acataatcat cgtcgtagct tccggtgtaa ggctaaagaa atcccagtaa cggttgccat 180
cttgaatatt tgtgcgtgga tcaggcttca aggaatgaat aacatccgga aacttaatcg 240
catcacgaat gaagaatacc ggcaaattat ttccgacaaa atcataattc ccttcttctg 300
tataaaactt aacggagaaa ccgcgtggat cacgtaatgt ttctggagaa tgttgcccat 360
gaattactgt tgaaaaacga gcaaaaacct ccgtttccgt tccttcttct tgcaaaaatt 420
tagccattgt atattttttc atgcttttct tagtgacaaa tttcccgtga gcaccagcac 480
cacgagcatg tacaacc 497
<210> 32
<211> 356
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaatccagcg cagttttaca taaactgttt tgccttcttc gttaatccat ttgaacgcat 60
gaacactaga gccacgtatt tcgcggtaag aagccggcgt tccttcatca ctgaataagt 120
acataatcat cgtcgtagct tccggtgtaa ggctaaagaa atcccagtaa cggttgccat 180
cttgaatatt tgtgcgtgga tcaggcttca aggaatgaat aacatccgga aacttaatcg 240
catcacgaat gaagaatacc ggcaaattat ttccgacaaa atcataattc ccttcttctg 300
tataaaactt aacggagaaa ccgcgtggat cacgtaatgt ttctggagaa tgttgc 356
<210> 33
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aatccagcgc agttttacat aaactgtttt gccttcttcg ttaatccatt tgaacgcatg 60
aacactagag ccacgtattt cgcggtaaga agccggcgtt ccttcatcac tgaataagta 120
cataatcatc gtcgtagctt ccggtgtaag gctaaagaaa tcccagtaac ggttgccatc 180
ttgaatattt gtgcgtggat caggcttcaa ggaatgaata acatccggaa acttaatcgc 240
atcacgaatg aagaataccg gcaaattatt tccgacaaaa tcataattcc cttcttctgt 300
ataaaactta acggagaaac cgcgtggatc acgtaatgtt tctggagaat gttgcccatg 360
aattactgtt gaaaaacgag caaaaacctc cgtttccgtt ccttcttctt gcaaaaattt 420
agccattgta tattttttca tgcttttctt agtgacaaat ttcccgtgag caccagcacc 480
acgagc 486
<210> 34
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tttaataata gaaatattgg aagctgaaca ctcagttact tgctctccgc ggtgtaaaac 60
agcttctaac gcattttgtt gatgtgcttt gttttttgct aaaatgtttc caagtaaatt 120
caaactcttg atgtcacagc gtaaccaacg aacatcttct tctgtaatta ctggtccacc 180
ttgcacaaat tgttgttcat ttcttggtac ttcacgagct gctgctgtta aaacgccttc 240
cagcgggaaa tcatctggca taacgtgatt acgcgggttt tgaacacctc gagtcacttg 300
taaatagaca tttcctgtat taatattatt ttcagcaact aatttttcaa gtaacgctcg 360
taactcttct ttcgaataag gaataactaa gtcaattttt gctgcactcg catataaacg 420
atcaatgtgt tcattataag tgaagaattt tccattatat agacgaacta cttcatatac 480
accatcacca aactgatatc cgcg 504
<210> 35
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tttaataata gaaatattgg aagctgaaca ctcagttact tgctctccgc ggtgtaaaac 60
agcttctaac gcattttgtt gatgtgcttt gttttttgct aaaatgtttc caagtaaatt 120
caaactcttg atgtcacagc gtaaccaacg aacatcttct tctgtaatta ctggtccacc 180
ttgcacaaat tgttgttcat ttcttggtac ttcacgagct gctgctgtta aaacgccttc 240
cagcgggaaa tcatctggca taacgtgatt acgcgggttt tgaacacctc ga 292
<210> 36
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aataatagaa atattggaag ctgaacactc agttacttgc tctccgcggt gtaaaacagc 60
ttctaacgca ttttgttgat gtgctttgtt ttttgctaaa atgtttccaa gtaaattcaa 120
actcttgatg tcacagcgta accaacgaac atcttcttct gtaattactg gtccaccttg 180
cacaaattgt tgttcatttc ttggtacttc acgagctgct gctgttaaaa cgccttccag 240
cgggaaatca tctggcataa cgtgattacg cgggttttga acacctcgag tcacttgtaa 300
atagacattt cctgtattaa tattattttc agcaactaat ttttcaagta acgctcgtaa 360
ctcttctttc gaataaggaa taactaagtc aatttttgct gcactcgcat ataaacgatc 420
aatgtgttca ttataagtga agaattttcc attatataga cgaactactt c 471
<210> 37
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgcctttttt attaataatt tcataagctg catcacgaac acttacgaaa atagtatcca 60
ttgcaccttg tttatcttcg ctaatccatt cagtgattgg aagaccgccg acagttgtgt 120
ggctccatgc tgggaattct gtatcgccgt gttcgccaag gatgtaacca tggacgttac 180
gagcatctac ttttagatag tcggcaattg acatacggaa acgtgctgta tcaaggcttg 240
ttccagaacc gataacacgt tcttttggaa gacctgagaa tttccatgta gcgtaagtta 300
agatatctac tgggttagaa gcgattaaga agataccgtc aaatccgcta gccattactt 360
catccacgat gcctttcatg attttaatat tacgatttac taaatctaaa cgagtttcac 420
caggtttttg tgcagtcccg gcagttacaa caactaagtc cgcatcgtgg cagtcgctat 480
aatttgctga gtagattttc ttag 504
<210> 38
<211> 335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgcctttttt attaataatt tcataagctg catcacgaac acttacgaaa atagtatcca 60
ttgcaccttg tttatcttcg ctaatccatt cagtgattgg aagaccgccg acagttgtgt 120
ggctccatgc tgggaattct gtatcgccgt gttcgccaag gatgtaacca tggacgttac 180
gagcatctac ttttagatag tcggcaattg acatacggaa acgtgctgta tcaaggcttg 240
ttccagaacc gataacacgt tcttttggaa gacctgagaa tttccatgta gcgtaagtta 300
agatatctac tgggttagaa gcgattaaga agata 335
<210> 39
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgcatcacga acacttacga aaatagtatc cattgcacct tgtttatctt cgctaatcca 60
ttcagtgatt ggaagaccgc cgacagttgt gtggctccat gctgggaatt ctgtatcgcc 120
gtgttcgcca aggatgtaac catggacgtt acgagcatct acttttagat agtcggcaat 180
tgacatacgg aaacgtgctg tatcaaggct tgttccagaa ccgataacac gttcttttgg 240
aagacctgag aatttccatg tagcgtaagt taagatatct actgggttag aagcgattaa 300
gaagataccg tcaaatccgc tagccattac ttcatccacg atgcctttca tgattttaat 360
attacgattt actaaatcta aacgagtttc accaggtttt tgtgcagtcc cggcagttac 420
aacaactaag tccgcatcgt ggcagtcgct ata 453
<210> 40
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaaccattta tccaacacag atgaatcagc cgttaccaaa ggatttctct atttcttcgg 60
atgataagaa aaagcttgaa agtggcgaaa cagttagtaa gaaaatagat aatcgcttta 120
ataaagaaat gacaattgtg tacgtcccaa taatgaatgg cgacaaattt gtcggttcta 180
tcgtgctcaa ttcacctatt agcggtacgg agcaagtaat tggtacgatt aaccgctata 240
tgttctacac tattttactt tctataacgg tagcacttat tcttagcgca atcttgtcca 300
aactacaagt aaatcgaatc aacaaactac gagcagcgac aaaagacgtt attcaaggca 360
attacaaagc tcgattgaag gaaaataatt ttgatgaaat tggtgcactt gccattgatt 420
tcaataaaat gacacaaacc cttgaaacat ctcaagaaga aatagaacga caagagaagc 480
ggagacgcca gtttattgct 500
<210> 41
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggagcaagta attggtacga ttaaccgcta tatgttctac actattttac tttctataac 60
ggtagcactt attcttagcg caatcttgtc caaactacaa gtaaatcgaa tcaacaaact 120
acgagcagcg acaaaagacg ttattcaagg caattacaaa gctcgattga aggaaaataa 180
ttttgatgaa attggtgcac ttgccattga tttcaataaa atgacacaaa cccttgaaac 240
atctcaagaa gaaatagaac gacaagagaa gcggagacgc cagtttattg ct 292
<210> 42
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tatccaacac agatgaatca gccgttacca aaggatttct ctatttcttc ggatgataag 60
aaaaagcttg aaagtggcga aacagttagt aagaaaatag ataatcgctt taataaagaa 120
atgacaattg tgtacgtccc aataatgaat ggcgacaaat ttgtcggttc tatcgtgctc 180
aattcaccta ttagcggtac ggagcaagta attggtacga ttaaccgcta tatgttctac 240
actattttac tttctataac ggtagcactt attcttagcg caatcttgtc caaactacaa 300
gtaaatcgaa tcaacaaact acgagcagcg acaaaagacg ttattcaagg caattacaaa 360
gctcgattga aggaaaataa ttttgatgaa attggtgcac ttgccattga tttcaataaa 420
atgacacaaa cccttgaaac atctcaagaa gaaatagaac gacaagagaa gcggagacgc 480

Claims (10)

1.一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组，其特征在于，所述管家基因包括abcZ、bglA、dapE、Cat、Dat、1dh和1hkA；
扩增所述管家基因abcZ的引物包括abcZ-F1、abcZ-F2和abcZ-R1，所述abcZ-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，abcZ-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，abcZ-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
扩增所述管家基因bglA的引物包括bglA-F1和bglA-R1，所述bglA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述bglA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
扩增所述管家基因dapE的引物包括dapE-F1、dapE-F2和dapE-R1，所述dapE-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述dapE-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述dapE-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
扩增所述管家基因Cat的引物包括Cat-F1、Cat-F2和Cat-R1，所述Cat-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述Cat-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述Cat-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
扩增所述管家基因Dat的引物包括Dat-F1、Dat-F2和Dat-R1，所述Dat-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述Dat-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述Dat-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
扩增所述管家基因1dh的引物包括1dh-F1、1dh-F2和1dh-R1，所述1dh-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述1dh-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述1dh-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
扩增所述管家基因1hkA的引物包括1hkA-F1、1hkA-F2和1hkA-R1，所述1hkA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述1hkA-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述1hkA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，在所述引物的F1端和R1端还分别包括通用序列，其中F1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，R1端的通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
3.一种基于权利要求2所述引物组的李斯特氏菌MLST分型溯源的二代测序建库方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用所述管家基因的引物组同时对李斯特氏菌进行一轮扩增；所述一轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；
（2）将一轮扩增的扩增产物纯化，用水洗脱后进行文库浓度测定，得一轮产物浓度和一轮产物总量；
（3）取10ng一轮产物进行二轮扩增，所述二轮扩增的引物包括接头引物P5和接头引物P7；所述二轮扩增的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸5min；
（4）对所述二轮扩增的产物进行纯化，用水洗脱后，得二代测序文库。
4.根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，步骤（1）所述一轮扩增的体系以25μL计，包括：李斯特氏菌gDNA 5ng，2×Mix 12.5μL，引物混合液5μL，余量为H2O。
5.根据权利要求4所述建库方法，其特征在于，所述引物混合液中：abcZ-F1的浓度为0.12μM，abcZ-F2的浓度为1μM和abcZ-R1的浓度为0.4μM；
bglA-F1的浓度为0.4μM，bglA-R1的浓度为0.4μM；
dapE-F1的浓度为0.12μM，dapE-F2的浓度为1μM，dapE-R1的浓度为0.4μM；
Cat-F1的浓度为0.12μM，Cat-F2的浓度为0.8μM，Cat-R1的浓度为0.4μM；
Dat-F1的浓度为0.2μM，Dat-F2的浓度为0.6μM，Dat-R1的浓度为0.4μM；
1dh-F1的浓度为0.12μM，1dh-F2的浓度为0.6μM，1dh-R1的浓度为0.4μM；
1hkA-F1的浓度为0.12μM，1hkA-F2的浓度为0.8μM，1hkA-R1的浓度为0.4μM。
6.根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，步骤（3）所述二轮扩增的体系以25μL计，包括：一轮产物10ng，2×Mix 12.5μL，接头引物P5 0.25μL，接头引物P7 0.25 μL，余量为H2O。
7.根据权利要求3所述建库方法，其特征在于，在得步骤（4）所述二代测序文库后，还包括测定二轮产物的浓度。
8.利用权利要求3~7任一项所述建库方法构建得到的二代测序文库在非诊断目的的李斯特氏菌二代测序中的应用。
9.一种基于权利要求3~7任一项所述建库方法构建得到的二代测序文库的非诊断目的的李斯特氏菌二代测序方法，其特征在于，包括以下步骤：取150ng二轮产物电泳检测后进行高通量二代测序；所述电泳检测的电压为130V，时间为60min。
10.根据权利要求9所述测序方法，其特征在于，所述高通量二代测序的测序平台为PE300，或其他等效测序平台，测序数据量为250M。
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JP5522623B2 (ja) * 2009-05-18 2014-06-18 国立大学法人九州大学 リステリア菌検出用のプライマーセット
JP2013188224A (ja) * 2013-05-13 2013-09-26 Kyushu Univ 病原性リステリア菌の検出方法
CN104846067B (zh) * 2015-02-04 2019-03-05 内蒙古自治区农牧业科学院 单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重pcr检测试剂盒及检测方法
MX2019011503A (es) * 2017-03-31 2019-12-19 Conagra Foods Rdm Inc Composiciones de cebador y métodos multiplex para detectar la presencia de listeria.
CN109735638B (zh) * 2019-02-26 2022-02-22 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌st121的多重pcr检测引物、试剂盒、方法及应用

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