CN112592989B - 一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的rpa引物及检测方法 - Google Patents

一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的rpa引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物及检测方法。区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物由针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物和针对沙门氏菌dnaN的引物组成；所述的针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物为：上游引物ureR‑F：SEQ ID NO.1，下游引物ureR‑R：SEQ ID NO.2；针对沙门氏菌dnaN的引物为：上游引物dnaN‑F：SEQ ID NO.3，下游引物dnaN‑R：SEQ ID NO.4。本发明采用RPA扩增技术同时检测和区分这两种细菌，用时更短，更灵敏，无需PCR等昂贵设备，便于基层和大批量样本的快速检测使用。

Description

一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学应用技术领域，涉及一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物及检测方法。
背景技术
沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌，在自然界分布广泛，主要通过受污染的肉蛋乳类水果蔬菜等食物和水源感染人类，可引起人得胃肠炎、伤寒、败血症等多种疾病。沙门氏菌血清型众多，达2500种。奇异变形杆菌是一种重要的条件致病菌，是仅次于大肠埃希菌的泌尿系统感染的主要病原菌，可引起败血症、食物中毒、腹膜炎、脑膜炎等。
奇异变形杆菌和沙门氏菌生化培养特征相似，且具有共同抗原，常常发生血清交叉凝集反应，因此采用常规血清检测方法无法正确区分两者。食品卫生指标中沙门氏菌是必检项目。奇异变形杆菌也是常见导致食品腐败的细菌和沙门氏菌检验中的常见干扰菌，但目前针对奇异变形杆菌的分子生物学检测方法很少。
RPA技术(重组酶聚合酶扩增)是2006年由英国TwistDx公司研发的一种等温核酸扩增技术。跟传统PCR技术相比，RPA技术有以下优点：1、无需PCR仪等昂贵设备，DNA扩增反应在37℃下恒温进行，即用一台水浴锅就可以进行；2、RPA技术灵敏性高于常规PCR，能够将痕量的核酸模板(1-10拷贝)扩增到可以检出的水平，相比PCR动辄几小时，RPA技术耗时更短，仅20min就可以完成核酸扩增。RPA技术相比常规PCR更为简便快捷灵敏，但因为RPA是在37-39℃下进行，对引物要求更高，否则容易出现核酸错误扩增。RPA技术没有PCR普及，目前还没有专业软件辅助设计RPA引物，主要依靠科研工作者凭自身专业知识来设计合适的RPA引物。因此目前尚没有公布的奇异变形杆菌的RPA检测方法。
现有沙门氏菌的检测技术一般针对沙门氏菌毒力基因invA或特异基因iroB等基因，但沙门氏菌型别多，仅血清型就有2500种。沙门氏菌毒力基因变异多，针对上述基因设计的引物广谱性不强。现有的针对沙门氏菌毒力基因invA或特异基因iroB等基因研发的核酸检测技术，往往仅采用几十株沙门氏菌进行验证，涵盖了仅仅少数常见血清型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强的区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物。
本发明的另一个目的在于提供准确、快速、简便的可同步检测奇异变形杆菌和沙门氏菌的分子生物学方法。
为实现上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：
一种区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA检测引物，由针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物和针对沙门氏菌dnaN的引物组成；所述的针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物为：上游引物ureR-F：5’TATATGGTGCAAAAGGTGAGATTTGTATTA 3’(SEQ ID NO.1)，下游引物ureR-R：5’ACAGATTGTAATTCAGTTTCAGACAGTAC 3’(SEQ ID NO.2)；针对沙门氏菌dnaN的引物为：上游引物dnaN-F：5’GAACATTTATTAAAACCGCTTCAGCAGGTC 3’(SEQ ID NO.3)，下游引物dnaN-R：5’GTAAATTCAACTTCGCTTTGCCAGTCGTCAAG 3’(SEQ ID NO.4)。
本发明所述的RPA检测引物在制备沙门氏菌和奇异变形杆菌的鉴别试剂中的应用。
本发明所述的RPA检测引物在非诊断目的的区分沙门氏菌和奇异变形杆菌中的应用。
一种非诊断目的的区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA检测方法，包括如下步骤：
1)制备待检样本的DNA样本；
2)利用本发明所述的引物对ureR-F/ureR-R以及dnaN-F/dnaN-R分别对DNA样本进行RPA反应；
3)在RPA反应完毕后直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，或对反应产物进行纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用ureR引物检测具有阳性条带，而利用dnaN引物检测不具有阳性条带的为奇异变形杆菌；利用ureR引物检测不具有阳性条带，而利用dnaN引物检测具有阳性条带的为沙门氏菌。
作为本发明的一种优选，RPA反应的体系为：29.5μL Rehydration Buffer；10μM上、下游引物各加入2.4μL；无菌双蒸水和DNA样本一共13.2μL。
作为本发明的一种优选，RPA反应条件为：37-42℃，反应时间为15-20min。
一种区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA试剂盒，包含本发明所述的区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA检测引物。
一种用于检测沙门氏菌的RPA引物，上游引物为dnaN-F：SEQ ID NO.3，下游引物为dnaN-R：SEQ ID NO.4。
本发明所述的针对沙门氏菌的RPA引物在制备沙门氏菌检测试剂中的应用。
一种检测沙门氏菌的RPA试剂盒，包含本发明所述的针对沙门氏菌的RPA引物。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
1)同时检测奇异变形杆菌和沙门氏菌的现有的技术多为双重常规PCR，PCR扩增时间一般1小时以上。本发明采用RPA扩增技术同时检测和区分这两种细菌，用时更短，无需PCR等昂贵设备，便于基层和大批量样本的快速检测使用。
2)现有检测技术一般针对沙门氏菌毒力基因invA或特异基因iroB等基因，但沙门氏菌型别多，毒力基因变异多，针对上述基因设计的引物广谱性不强。沙门氏菌有7对看家基因，可用于MLST分型鉴别。本发明根据生物信息学分析、沙门氏菌MLST实验，发现hisD等看家基因也容易发生突变(图5)，MLST分型可产生新的ST型别。但沙门氏菌看家基因dnaN保守性相对更强，采用该基因作为检测靶标广谱性更强。因此可采用dnaN作为沙门氏菌检测的特异性靶标。本发明的方法在鉴别区分沙门氏菌和奇异变形杆菌上有优良的广谱性、特异性。
附图说明
图1是本发明的RPA方法ureR引物检测扩增实验。M是marker。泳道1-2为奇异变形杆菌S012。泳道3为TwistDXTM公司的Twistamp TM Basic试剂盒提供的阳性对照。泳道4为沙门氏菌ATCC14028。
图2是本发明的RPA方法dnaN引物检测扩增实验。M是marker。泳道1-2为沙门氏菌ATCC14028。泳道3为TwistDXTM公司的Twistamp TM Basic试剂盒提供的阳性对照。泳道4为奇异变形杆菌S012。
图3是本发明的RPA ureR引物检测特异性实验。M是marker。泳道1为奇异变形杆菌S012。泳道2为沙门氏菌ATCC14028。3是汤卜逊沙门氏菌，4纽波特沙门氏菌，5布利丹沙门氏菌，6肠炎沙门氏菌，7肯塔基沙门氏菌，8伦敦沙门氏菌，9德尔卑沙门氏菌。10大肠杆菌O157ATCC43895,11单增李斯特菌ATCC15313，12阪崎肠杆菌ATCC51329。
图4是本发明的RPA方法dnaN引物检测特异性实验。泳道1为沙门氏菌ATCC14028。2是汤卜逊沙门氏菌，3纽波特沙门氏菌，4布利丹沙门氏菌，5肠炎沙门氏菌，6肯塔基沙门氏菌，7伦敦沙门氏菌，8德尔卑沙门氏菌。9大肠杆菌O157 ATCC43895,10单增李斯特菌ATCC15313，11阪崎肠杆菌ATCC51329。12为奇异变形杆菌S012。
图5沙门氏菌hisD基因NCBI数据库序列同源性比较结果
图6沙门氏菌dnaN基因NCBI数据库序列同源性比较结果
图7沙门氏菌测序结果分析
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1靶基因的选取和RPA引物的设计
利用生物信息学知识和相关软件，以及前期菌型鉴别的实验发现，最终选取ureR作为奇异变形杆菌的检测靶标，dnaN作为沙门氏菌的检测靶标。从NCBI数据库下载多条ureR、dnaN序列，进行多序列比对，在序列保守区设计引物。然后将引物输入到NCBI进行blast比对，分析引物的特异性。最终优选出本发明公开的引物对。引物由上海生工有限公司合成。
针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物：
上游引物ureR-F：5’TATATGGTGCAAAAGGTGAGATTTGTATTA 3’(SEQ ID NO.1)
下游引物ureR-R：5’ACAGATTGTAATTCAGTTTCAGACAGTAC 3’(SEQ ID NO.2)
针对沙门氏菌dnaN的引物：
上游引物dnaN-F：5’GAACATTTATTAAAACCGCTTCAGCAGGTC 3’(SEQ ID NO.3)
下游引物dnaN-R:5’GTAAATTCAACTTCGCTTTGCCAGTCGTCAAG 3’(SEQ ID NO.4)
实施例2
试验菌株
沙门氏菌ATCC14028、肯塔基沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、大肠杆菌O157、奇异变形杆菌等12株参考菌株由武汉轻工大学食品安全团队实验室保存。
细菌DNA模板的制备
用煮沸法提取待检菌株的基因组DNA：将菌株在LB液体培养基中培养过夜，取1mL菌液12000rpm离心5min，弃上清液；细胞沉淀用1mL无菌水洗涤，12000rpm离心5min，弃尽上清液。加入100μL无菌去离子水于沉淀中形成悬浮液，煮沸10min，冰浴5min，12000rpm离心5min，上清液即为基因组DNA，用做RPA扩增的模板。
RPA扩增体系
购置TwistDXTM公司的Twistamp TM Basic试剂盒。在加有酶的RPA反应管中加入29.5μL Rehydration Buffer，10μM上下游引物各加入2.4μL，无菌双蒸水11.2μL和DNA2μL。最后在反应管盖中加入2.5μL醋酸镁溶液(280mmol)。
RPA反应条件
39℃条件下反应20min。
RPA反应结束后，取5μL反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳胶中加入Goldview进行染色。电泳结束后在紫外投射仪下观察拍照。如想获得理想观察结果，可采用PCR产物试剂盒进行产物纯化，然后进行琼脂糖凝胶电泳和拍照观察。
本发明的特异性验证结果如图1-图4所示。图1、图2显示ureR和dnaN引物检测奇异变形杆菌和沙门氏菌阳性条带与预期产物大小一致。图3显示ureR仅有奇异变形杆菌能扩增，其他细菌均未能扩增。图4显示dnaN引物仅有沙门氏菌能扩增，其他种类细菌均未能扩增。结果表明，本发明方法对检测和区分奇异变形杆菌和沙门氏菌有良好的特异性。
实施例4靶基因广谱性的生物信息学分析
将沙门氏菌食品分离株进行MLST分型，hisD、dnaN基因扩增后双向测序，拼接得到基因全长。其中，MLST比对采用的hisD序列如SEQ ID NO.5所示；MLST比对采用的dnaN序列为：如SEQ ID NO.6所示。将基因序列输入到NCBI数据库比对，检测靶基因的序列同源性。图3显示具有突变位点的某菌株hisD序列与数据库保存的沙门氏菌hisD基因最高相似性仅99.5％，而图4显示具有突变位点的某菌株dnaN的相似性可达到99.87％。比对的菌株均具有新的ST基因型。说明dnaN保守性相对更强，采用该基因作为检测靶标广谱性更强。
以上结合具体实例为本发明的优选实施例，仅为本发明的具体实施案例，但本发明的专利特征并不仅限于此。对于本领域的技术人员，对本发明的技术方案及设计思路的改变、等效变化及直接或间接地替换，均属于本发明权力要求的保护范围之内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种区分奇异变形杆菌和沙门氏菌的RPA引物及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatatggtgc aaaaggtgag atttgtatta 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acagattgta attcagtttc agacagtac 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacatttat taaaaccgct tcagcaggtc 30
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaaattcaa cttcgctttg ccagtcgtca ag 32
<210> 5
<211> 802
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acaggtagca gtatagccat aggtcggtaa aacatggttg gttccggaag cgtaatcacc 60
ggcggattcc ggcgaccagt cgccgagaaa taccgagcct gcgctggtaa tcgcatccac 120
caaatcgcgc gcattgcgcg tctggataat taagtgttcc ggcccatact gattagagat 180
ggcgacgcac tgcgctaaat ctttggtcac aatcagacga ctggcgctca gggcctgccg 240
ggcggtgtcc gcgcgcggca gttccgccag ttgacgttct accgcctccg ccaccttgcg 300
ggcaatgtca gcatcaggcg tcagcaggat cacctgcgaa tccggaccgt gttctgcctg 360
ggagagcagg tcagaagcga cgaaatccgg tgttgcgccg ctgtcggcga tcaccagtac 420
ttcagacggc ccggctggca tatcgatagc cgcgccgtcg aggcgctggc tgacctgacg 480
cttggcttcg gttacaaagg cgttgccggg gccaaaaatt ttatccactt tcggtacgga 540
ctcgctgccg aaggccagag cggcaatcgc ctgcgcgccg ccgacgttaa agatttcctg 600
cacgccacac agttgcgccg catagaggat ttcatcagcg atgggcggcg gcgagcacag 660
aaccacgttc tggcatcccg caatgcgcgc cggcgtcgcc agcatcagca ccgttgagaa 720
gagcggagcc gagccgccgg gaatatacag accgacagac gcgacgggac gcgtaacctg 780
ctggcaacgc acgcctggct gg 802
<210> 6
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgcagcccg cttccagatg tttatccgga ttcttcggca gaacgcgacg gtaatccggg 60
aagcgaccat ccaccagctt cgaggtaaag ataaagtcgc cgacgtgcgc gcggatatta 120
ttactgccaa tctgcacgcg cagcgggttt tcgccgccgt cgagcatacg catcagttca 180
atcacgcctt tacgcggcac aatcaccgag tggctgggta aagacgcttc cagcggcatt 240
gagcacaccg ccaggcggtg gccgtcggtc gcgacagtgc gcagttcgct accttccgtt 300
tcaaacagca taccgtttaa gtagtagcgc acatcctgat gggccatcga aaactgggtc 360
gcttcaatca ggcgcttcat cgtggcctgc ggcagcgtaa attcaacttc gctttgccag 420
tcgtcaagat tcgggaaatc ggcggcaggc agtgtagaca gcgagaagcg gctacggcca 480
gaacgcacca gcatccgatc gccttccaac tgaacggcaa tctccgcgcc ctccggcagg 540
ccgcggcaga tatcaaagaa tttccgcgcc ggcacggtag tggcgcctgg ctcatgcggc 600
tgagaaagcg taacgcgcgc gaccatctcc atttcaagat cggtgccggt cagagaaagc 660
gtaccgtccg ctacctggag gagcaggtta ccgagaatcg gcagcgtagg acgaccgccc 720
agcgggccgc tgacctgctg aagcggt 747

Claims (10)

1.一种区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA检测引物，其特征在于，由针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物和针对沙门氏菌dnaN的引物组成；所述的针对奇异变形杆菌毒力基因ureR的引物为：上游引物ureR-F：SEQ ID NO.1，下游引物ureR-R：SEQ ID NO.2；针对沙门氏菌dnaN的引物为：上游引物dnaN-F：SEQ ID NO.3，下游引物dnaN-R：SEQ ID NO.4。
2.权利要求1所述的RPA检测引物在制备沙门氏菌和奇异变形杆菌的鉴别试剂中的应用。
3.权利要求1所述的RPA检测引物在非诊断目的的区分沙门氏菌和奇异变形杆菌中的应用。
4.一种非诊断目的的区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备待检样本的DNA样本；
2)利用权利要求1中所述的引物对ureR-F/ureR-R以及dnaN-F/dnaN-R分别对DNA样本进行RPA反应；
3)在RPA反应完毕后直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，或对反应产物进行纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用ureR引物检测具有阳性条带，而利用dnaN引物检测不具有阳性条带的为奇异变形杆菌；利用ureR引物检测不具有阳性条带，而利用dnaN引物检测具有阳性条带的为沙门氏菌。
5.根据权利要求4所述的RPA检测方法，其特征在于，RPA反应的体系为：29.5μLRehydration Buffer；10μM上、下游引物各加入2.4μL；无菌双蒸水和DNA样本一共13.2μL。
6.根据权利要求4所述的RPA检测方法，其特征在于，RPA反应条件为：37-42℃，反应时间为15-20min。
7.一种区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的区分沙门氏菌和奇异变形杆菌的RPA检测引物。
8.一种用于检测沙门氏菌的RPA引物，其特征在于上游引物为dnaN-F：SEQ ID NO.3，下游引物为dnaN-R：SEQ ID NO.4。
9.权利要求8所述的RPA引物在制备沙门氏菌检测试剂中的应用。
10.一种检测沙门氏菌的RPA试剂盒，其特征在于包含权利要求8所述的RPA引物。
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