CN107254556A - 基于rpa‑iac技术筛查南方菜豆花叶病毒的方法、rpa‑iac引物及试剂盒 - Google Patents

基于rpa‑iac技术筛查南方菜豆花叶病毒的方法、rpa‑iac引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的引物对及内标扩增序列在制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品中的应用；以及基于RPA‑IAC技术的筛查南方菜豆花叶病毒的方法。经实验证明，本发明的基于RPA‑IAC引物并配合内标扩增序列建立的南方菜豆花叶病毒RPA‑IAC筛查方法特异性好、灵敏度高、筛查时间短、质控效果佳、不需要特殊的仪器且适用范围广，对进出口相关植物及产品筛查具有指导意义。

Description

基于RPA-IAC技术筛查南方菜豆花叶病毒的方法、RPA-IAC引 物及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物筛查领域，特别涉及筛查南方菜豆花叶病毒的RPA-IAC方法、引物及试剂盒。
背景技术
南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)为南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)成员，自然寄主多为豆科植物，包括大豆、菜豆、绿豆、豇豆等；人工接种则可侵染赤小豆、红花菜豆、棉豆、豌豆、蚕豆、草木樨等约12个属23种植物。汁液接种最易传毒。种子带毒传毒，菜豆种传率1～5％，豇豆种传率比较高，一般为5～40％。如果种子发芽，其幼苗与感病的汁液接触或种植在靠近感病植物附近的土壤中也可传播病毒。该病毒一旦传入我国并定殖下来，将很难根除，会对我国农业生产造成重大损失。因此，该病毒已被列入我国新修订的植物检疫性有害生物名单中，由于目前尚无有效的病毒防治方法，因此加强该病毒的检疫筛查工作是防止这种病毒传入的最有效的途径之一。我国每年从国外进口大量的大豆等植物及其产品，为防止该危险性病毒的传入，需要建立该病毒快速准确的筛查技术。
目前筛查南方菜豆花叶病毒的方法主要包括血清学筛查、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和实时荧光RT-PCR筛查技术等。血清学方法需要制备血清，较为繁琐，且筛查周期长，并因南方菜豆花叶病毒存在不同株系易导致漏检现象；RT-PCR技术需要热循环设备；实时荧光RT-PCR技术需要昂贵的筛查设备，筛查成本较高，不适合基层和小型实验室推广使用。RPA(Recombinase polymerase amplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮组下使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。该方法仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；只需要37℃下恒温反应，不需要特殊的热循环设备；反应时间短；扩增产物有特定大小的条带，结果易于判断。而RPA与扩增内标(Internal Amplification Control,IAC)的结合使用则会有效控制假阴性的出现，大大提高了检测的准确性，避免了漏检，能够更有效的筛查防控该病毒的发生危害。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA-IAC技术的筛查南方菜豆花叶病毒的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、筛查时间短、质控效果佳、不需要特殊的仪器和适用范围广的RPA-IAC引物和含有该RPA-IAC引物的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供了所述的引物对和内标扩增序列在制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品中的应用。
在一优选例中，所述制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒的产品。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括上述的引物对和包含有上述的内标扩增序列的质粒。
在一优选例中，还包括RPA-IAC恒温扩增试剂；
在一优选例中，所述RPA-IAC恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits所包含的试剂。
在一优选例中，还包括植物总RNA提取试剂。
在一优选例中，所述植物总RNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂。
在一优选例中，还包括反转录试剂。
在一优选例中，所述反转录试剂包括来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCR Kit所包含的试剂。
本发明第四方面提供了一种试剂盒在筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒，或制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品中的应用；
在一优选例中，所述筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒，以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒；
在一优选例中，所述制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒的产品。
本发明第五方面提供了一种筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的方法，包括使用所述的引物对和包含有上述的内标扩增序列的质粒，或所述试剂盒的步骤。
在一优选例中，所述筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒；以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒。
在一优选例中，所述的方法包括如下步骤：
1)RPA-IAC扩增
从待测植物样品或待测病毒中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板与所述的引物对和包含有上述的内标扩增序列的质粒，或所述试剂盒进行RPA-IAC扩增。
2)根据RPA-IAC扩增的结果判断待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒，或待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒。
在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：
若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为169bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为337bp、169bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为待测植物样品感染南方菜豆花叶病毒或待测病毒为或候选为南方菜豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为337bp的内标扩增片段，未含有大小为169bp的目标基因片段，则判定为待测植物样品未感染南方菜豆花叶病毒或待测病毒不为或候选不为南方菜豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为337bp的内标扩增片段，同时也未含有大小为169bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行筛查。
在一优选例中，步骤1)中从待测植物样品中提取总RNA是采用天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒进行的；
步骤1)中将总RNA反转录成cDNA是采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCR Kit进行的。
在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：
含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管
再水化缓冲液 29.5μL
SEQ ID NO：1所示的引物和SEQ ID NO：2所示的引物各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/L
包含有SEQ ID NO：3所示的内标扩增序列的质粒20ng
cDNA 50ng
醋酸镁溶液 2.5μL，浓度为280mmol/L
去离子水 补足至50μL
在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。
本发明提到的待测植物样品，可为植物的根﹑茎﹑叶等部分的成长的植物体；而待测病毒则是一种纯病毒或至少二种以上的病毒的混合。
本发明涉及的“内标扩增片段”是添加到PCR反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建DNA序列或者是一段致病菌的保守基因序列。扩增内标作用的主要原理是：将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目的基因进行共同扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的基因的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明针对南方菜豆花叶病毒设计特异性RPA-IAC引物，建立了南方菜豆花叶病毒RPA-IAC筛查方法，可对南方菜豆花叶病毒进行定性筛查。
(2)本发明涉及的内标扩增序列与南方菜豆花叶病毒基因组非同源，可在确保目标序列扩增效率的同时有效规避筛查假阴性的发生。
(3)本发明针对南方菜豆花叶病毒仅用一对引物即可完成扩增，省去了LAMP等其它恒温扩增方法需要的多对引物的复杂设计过程；本发明的引物扩增只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需40min，筛查时间短；不像LAMP产物的弥散带，RPA-IAC扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带，其结果易于判断。
(4)本发明的RPA-IAC扩增引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。
(5)本发明建立的南方菜豆花叶病毒RPA-IAC筛查方法，灵敏、准确、简便和快速，对进出境相关植物及产品检验检疫具有指导意义。
附图说明
图1是采用本发明的RPA-IAC引物对多种病毒进行特异性筛查的琼脂糖凝胶电泳图，共有八条泳道：其中M为marker DL1000，1为南方菜豆花叶病毒的RPA-IAC扩增产物，2为菜豆荚斑驳病毒的RPA-IAC扩增产物，3为大豆花叶病毒的RPA-IAC扩增产物，4为南芥菜花叶病毒的RPA-IAC扩增产物，5为烟草环斑病毒的RPA-IAC扩增产物，6为阴性对照。
图2是采用本发明的RPA-IAC引物对南方菜豆花叶病毒进行灵敏度筛查的琼脂糖凝胶电泳图，共有九条泳道：其中M为marker DL500，1-7分别为南方菜豆花叶病毒cDNA的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀释度的RPA-IAC扩增产物，8为阴性对照。
具体实施方式：
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种RPA-IAC引物对和内标扩增序列及其应用。
RPA-IAC引物的筛选方法为：针对南方菜豆花叶病毒基因组(Genbank登录号AF055888.1)的保守序列，设计筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的RPA-IAC引物，设计了多条RPA-IAC引物后进行了大量的筛选实验，综合其特异性、灵敏度和所使用的各引物与RPA-IAC扩增试剂盒的适配性，最终筛选出特异性好、灵敏度高且适用范围广的一对RPA-IAC引物。
此RPA-IAC引物具体序列如下：
上游引物：5′-TGGAAGCCCCGGCCACTCAATCGAGGAGGCCC-3′(SEQ ID NO：1)；
下游引物：5′-ACTGTCACACCTCCAGCCGTTCTAAGCGATGGT-3′(SEQ ID NO：2)。
内标扩增序列的设计和合成：为避免相近细菌的同源干扰和筛查人员的个体核酸污染，经过综合分析考量和反复实验验证，以高度保守的猪种属特异性基因β-actin的部分核酸序列为基础，两端分别连接上述的上游引物的序列和下游引物的序列，形成如下所示序列大小为337bp的内标扩增序列：
TGGAAGCCCCGGCCACTCAATCGAGGAGGCCCgttcgagaccttcaacaccccagccatgtacgtggccatccaggcggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgtgatggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactacctcatgaagatcctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcgggacatcaaggACCATCGCTTAGAACGGCTGGAGGTGTGACAGT(Seq ID NO：3)
上述Seq ID NO：3中，大写序列为添加的上述上游引物的原始序列和下游引物的反向互补序列，小写序列272bp来源于Genbank登录号为DQ452569.1且标题为Sus scrofabeta actin(ACTB)gene,partial cds中489-760的一段序列，并经过理论和实践的同源性验证。
上述RPA-IAC引物对和内标扩增序列的合成工作，均由上海生工生物技术有限公司完成。
上述RPA-IAC引物对和内标扩增序列可应用到制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品上，例如制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒的产品，或制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒的产品。
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
(1)植物总RNA提取试剂；
(2)反转录试剂；
(3)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2(均来自实施例1)，以及含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒；；
(4)含冻干酶粉管；
(5)再水化缓冲液；
(6)醋酸镁溶液。
所述植物总RNA提取试剂为来自天根生物科技有限公司植物总RNA提取试剂盒(货号:DP432)的试剂；所述反转录试剂为来自TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit(货号:RR014A)的试剂。
上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)均来源于RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits(TwistDX公司，货号:TABAS03KIT)。
所述含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒的构建：将实施例1合成的内标扩增序列连接到通用载体PUC57上，得到含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的阳性质粒。具体为：采用常规T4噬菌体DNA连接酶连接到通用载体PUC57，并制备成阳性质粒冻干粉。在本发明中此构建是由上海生工生物技术有限公司完成。按照拷贝数N copies/μL＝PCR片段的质量(g/μL)/(650g/mol×碱基数)×(6.02×1023)计算，将阳性质粒干粉稀释至1.83×103copies/μL。
利用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和上述含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒针对南方菜豆花叶病毒进行RPA-IAC扩增，得到的RPA-IAC目标基因扩增产物和扩增内标产物的大小分别为169bp、337bp。
实验证明，上述植物总RNA提取试剂、反转录试剂与RPA扩增试剂盒TwistAmpBasic kits，以及其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒的联合使用，效果更加优越，具体表现在特异性强、重复性好、灵敏度高以及质控效果佳。
上述试剂盒可应用于筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒上，例如筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒，或筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒；还可以用来制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品，例如制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒的产品，或制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒的产品。
实施例3
本实施例提供了一种筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的方法，例如筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒，或筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒，该方法使用了实施例1的RPA-IAC引物和含有上述内标扩增序列的质粒，或实施例2的试剂盒。
上述方法包括如下步骤：
1、RNA的提取及cDNA的合成
采用天根生物科技有限公司的货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒，根据其说明书提取待测植物样品的总RNA；并采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit，根据其说明书将前述提取的总RNA作为模板反转录获得cDNA，将获得的cDNA保存于-20℃备用。
2、RPA-IAC扩增
以cDNA为模板，添加实施例2中含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒，采用实施例1的上游引物和下游引物(序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)进行RPA-IAC扩增，得到RPA-IAC扩增产物，同时设置阴性对照(模板为超纯水)。
RPA-IAC扩增体系(50μL)的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、上游引物和下游引物(实施例1的上游引物和下游引物)各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒1μL(1.83×103copies)(来自实施例2)，模板cDNA 50ng，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)，用去离子水补足至50μL。
RPA-IAC扩增反应条件：将上述RPA-IAC扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA-IAC扩增产物。
3、RPA-IAC扩增产物的电泳检测
RPA-IAC反应结束后，向上述RPA-IAC扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA-IAC扩增产物进行测序(在建立方法过程中均进行了测序验证，本文不再赘述)。
所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：
若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为169bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为337bp、169bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为待测植物样品感染南方菜豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为337bp的内标扩增片段，未含有大小为169bp的目标基因片段，则判定为待测植物样品未感染南方菜豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为337bp的内标扩增片段，同时也未含有大小为169bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行筛查。
实施例4
本实施例对实施例3建立的筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的方法进行了有效性验证。
步骤一：RNA的提取及cDNA的合成
采用天根生物科技有限公司的货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒，根据其说明书提取感染南方菜豆花叶病毒的大豆叶片(保存于中国检验检疫科学研究院)的RNA；并采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit，根据其说明书将前述提取的RNA作为模板反转录获得cDNA，将获得的cDNA保存于-20℃备用。
步骤二：RPA-IAC扩增
以步骤一获得的cDNA为模板，添加含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒，采用实施例1的上游引物和下游引物进行RPA-IAC扩增，同时设置阴性对照(模板为超纯水)。
RPA-IAC扩增体系(50μL)的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、上游引物和下游引物(实施例1的上游引物和下游引物)各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒1μL(1.83×103copies)(来自实施例2)，模板cDNA 50ng，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)，用去离子水补足至50μL。
RPA-IAC扩增反应条件：将上述RPA-IAC扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA-IAC扩增产物。
步骤三：RPA-IAC扩增产物的电泳检测
RPA-IAC反应结束后，向RPA-IAC扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取上清液5μL于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA-IAC扩增产物进行测序。
结果显示南方菜豆花叶病毒的RPA-IAC扩增产物含有1条大小为169bp的条带和1条大小为337bp的条带，而阴性对照仅在337bp处有扩增条带，说明本发明的基于RPA-IAC引物及RPA-IAC试剂盒建立的筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的方法可以有效筛查南方菜豆花叶病毒。
实施例5
本实施例对实施例1的RPA-IAC引物进行了特异性验证，所用的供试材料如下：南方菜豆花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、大豆花叶病毒、南芥菜花叶病毒和烟草环斑病毒共5种病毒感染的大豆叶片，5种病毒如表1所示，编号依次为1、2、3、4、5。上述供试材料均保存于中国检验检疫科学研究院，并设阴性对照(模板为超纯水)。
表1供试病毒
采用天根生物科技有限公司的货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒，根据其说明书分别提取上述5种病毒感染的大豆叶片的RNA；并采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit，根据其说明书将前述提取的RNA作为模板反转录获得cDNA。
以cDNA为模板，进行RPA-IAC扩增和RPA-IAC扩增产物的电泳检测，RPA-IAC扩增和RPA-IAC扩增产物的电泳检测的方法同实施例4的步骤二和步骤三。
结果分析：
结果如图1所示，组1-组5分别对应泳道1-5，阴性对照对应泳道6，泳道1显示在337bp和169bp处均有扩增条带，根据实施例3的判断标准，为阳性，即顺利检出南方菜豆花叶病毒，其余泳道2-泳道6显示只有在337bp处有扩增条带，根据实施例3的判断标准，判断为未感染南方菜豆花叶病毒，且排除了假阴性可能性，进一步提高了结果的可靠性。综上，上述阳性判定和阴性判定结果均准确且所有组的扩增内标均成功扩增，由此证明本发明实施例1的引物对和内标扩增序列具有有效性、高特异性和良好指示性；进一步的，本发明基于引物对和内标扩增序列及试剂盒建立的筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的方法能够准确的对南方菜豆花叶病毒进行筛查。
实施例6
本实施例对实施例1的RPA-IAC引物进行了灵敏度的验证，其方法如下：
步骤一：cDNA的获取
参照实施例5的方法对感染南方菜豆花叶病毒的大豆叶片(保存于中国检验检疫科学研究院)提取RNA并反转录获取cDNA(浓度为50ng/μL)，并将获取的cDNA进行梯度稀释，分别得到稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的南方菜豆花叶病毒的cDNA。
步骤二：RPA-IAC扩增
分别以上述步骤一得到的稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的南方菜豆花叶病毒的cDNA为模板(模板量均取1μL)进行RPA-IAC扩增和RPA-IAC扩增产物的电泳检测，并设阴性对照(模板为超纯水)。RPA-IAC扩增的方法同实施例4的步骤二。
步骤三：电泳检测
RPA-IAC扩增反应结束后，分别向RPA-IAC扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。RPA-IAC电泳结果如图2所示。
从图2可以看出，本发明的RPA-IAC方法的灵敏度为10-3稀释度。组1-4均在169bp处有条带且组4-8在337bp处有条带，说明了组1-8的结果均有效且组5-组8无假阴性可能性，同时也说明本发明实施例1的引物对具有较高的灵敏度，可筛查出样品中仅含有0.05ng的微量DNA；而后进行对应的RPA扩增(扩增体系里不添加实施例2中含有如SEQ ID NO：3所示内标扩增序列的质粒，其余条件相同)，其灵敏度结果同RPA-IAC扩增，由此可知添加扩增内标并没有降低筛查的灵敏度。
对比例1
实际上，在寻求到本发明的引物对之前，尝试了本发明的包含有内标扩增序列的质粒(来自实施例2)与非常多的引物对组合，在本对比例中只摘取其中之若干进行阐述，其余不予赘述，具体为：
利用实施例1的RPA-IAC引物对以及用Primer Premier 5.0软件设计并选取其中排分靠前的RPA-IAC引物组合1-6，用实施例3建立的筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的方法对50份大豆样品进行了筛查，同时用中国检验检疫行业标准《SN/T 3438-2012南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法》中的方法对这50份大豆样品进行了南方菜豆花叶病毒的筛查，灵敏度试验的取样和模板浓度梯度的设置均按照实施例6进行，筛查结果如表2所示。
表2不同引物对筛查样品中南方菜豆花叶病毒的结果
结果显示：鉴于存在包含有内标扩增序列的质粒的情况下本发明引物对的筛查结果与行业标准筛查方法的筛查结果一致，这说明本发明引物对组合特异性强、灵敏度高且重复性很好，而采用引物设计软件随机选取的若干种RPA-IAC引物对则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高、重复性不好以及干扰扩增内标等各种缺陷。
对比例2
本对比例提供了不同的试剂与本发明的引物对(来自实施例1)、包含有内标扩增序列的质粒(来自实施例2)组合在一起筛查南方菜豆花叶病毒时的筛查结果对比。
各种试剂与本发明的引物对和包含有内标扩增序列的质粒组合:
组合1：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+某市售植物总RNA提取试剂盒1+某市售反转录试剂盒1+某市售RPA扩增试剂盒1
组合2：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+某市售植物总RNA提取试剂盒2+某市售反转录试剂盒2+某市售RPA扩增试剂盒2
组合3：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+某市售植物总RNA提取试剂盒3+某市售反转录试剂盒3+某市售RPA扩增试剂盒3
本发明组合：本发明引物对和包含有内标扩增序列的质粒+来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂+来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit所包含的试剂+来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasic kits所包含的试剂。
利用上述本发明组合筛查南方菜豆花叶病毒时，其方法采用实施例3中的方法进行。灵敏度实验的取样和模板浓度稀释梯度的设置均按照实施例6进行。
利用上述组合1、组合2和组合3筛查南方菜豆花叶病毒时，凡是用到市售试剂盒，均按照其说明书进行操作进行，其余条件均同本发明组合。同时设行业标准(见对比例1)检测。
受检样品同对比例1中的50份大豆样品。
筛查结果如表3所示。
表3不同试剂组合筛查样品中南方菜豆花叶病毒的结果
结果显示：本发明引物对、包含有内标扩增序列的质粒和各特定试剂的组合的筛查结果与行业标准筛查方法的筛查结果一致，这说明本发明引物对、包含有内标扩增序列的质粒和各特定试剂的组合所组成的试剂盒具有特异性强、灵敏度高且重复性好的优势，而在存在内标扩增序列的情况下采用本发明引物对与其它随机选取的若干试剂的组合则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高和重复性不好的各种缺陷。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 基于RPA-IAC技术筛查南方菜豆花叶病毒的方法、RPA-IAC引物及试剂盒
<130> 17CN
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SEQ ID NO ：1
<400> 1
tggaagcccc ggccactcaa tcgaggaggc cc 32
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SEQ ID NO ：2
<400> 2
actgtcacac ctccagccgt tctaagcgat ggt 33
<210> 3
<211> 337
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SEQ ID NO ：3
<400> 3
tggaagcccc ggccactcaa tcgaggaggc ccgttcgaga ccttcaacac cccagccatg 60
tacgtggcca tccaggcggt gctgtccctg tacgcctctg gccgcaccac tggcatcgtg 120
atggactccg gagacggggt cacccacacg gtgcccatct acgaggggta cgccctgccc 180
cacgccatcc tgcgtctgga cctggctggc cgggacctga ccgactacct catgaagatc 240
ctgacggagc ggggctacag cttcaccacc acggccgagc gggagatcgt gcgggacatc 300
aaggaccatc gcttagaacg gctggaggtg tgacagt 337

Claims (10)

1.引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的引物对和内标扩增序列在制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品中的应用；
任选的，所述制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒为或候选为南方菜豆花叶病毒的产品。
3.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括RPA-IAC恒温扩增试剂；
任选的，所述RPA-IAC恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasic kits所包含的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括植物总RNA提取试剂；
任选的，所述植物总RNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂；
任选的，还包括反转录试剂；
任选的，所述反转录试剂包括来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCR Kit所包含的试剂。
6.权利要求3至5任一项所述的试剂盒在筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒，或制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品中的应用；
任选的，所述筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒，以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒；
任选的，所述制备筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的产品包括：制备筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒的产品，以及制备筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒的产品。
7.一种筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒的方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒，或权利要求3-5中任一项所述试剂盒的步骤；
任选的，所述筛查或辅助筛查南方菜豆花叶病毒包括：筛查或辅助筛查待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒；以及筛查或辅助筛查待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)RPA-IAC扩增
从待测植物样品或待测病毒中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板与权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒，或权利要求3-4中任一项所述试剂盒进行RPA-IAC扩增；
2)根据RPA-IAC扩增的结果判断待测植物样品是否感染南方菜豆花叶病毒，或待测病毒是否为或候选为南方菜豆花叶病毒；
任选的，所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：
若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为169bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为337bp、169bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为待测植物样品感染南方菜豆花叶病毒或待测病毒为或候选为南方菜豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为337bp的内标扩增片段，未含有大小为169bp的目标基因片段，则判定为待测植物样品未感染南方菜豆花叶病毒或待测病毒不为或候选不为南方菜豆花叶病毒；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为337bp的内标扩增片段，同时也未含有大小为169bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行筛查。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤1)中从待测植物样品中提取总RNA是采用天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒进行的；
步骤1)中将总RNA反转录成cDNA是采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScript RT-PCRKit进行的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：
任选的，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。
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